銀杏葉復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響

李焰，鄧心慰，曾福炎，王華，2，尹會(huì)方，2（.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000；2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364000）

銀杏葉復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響

李焰1，2*，鄧心慰1，曾福炎1，王華1，2，尹會(huì)方1，2
（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000；2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364000）

本試驗(yàn)旨在研究銀杏葉復(fù)方（YXF）和四君子湯（SJZ）對(duì)環(huán)磷酰胺（CY）所致免疫抑制模型小鼠細(xì)胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響。KM種小鼠180只，雌性，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只。A為對(duì)照組（CK），B為CY組，C為YXF組，D為CY+YXF組，E為SJZ組；F為CY+SJZ組。A、B和C、D、E、F組分別每天灌服蒸餾水和相應(yīng)制劑0.3 mL/只，A、C、E和B、D、F組分別按照75 mg/kg體重隔日腹腔注射生理鹽水和CY，連續(xù)15 d。結(jié)果表明：CY組的IL-1、TNF-a含量較CK組顯著下降（P＜0.05），CY+YXF組的IL-1和TNF-a含量較CY組有所增加（P＞0.05）；CY+SJZ組TNF-a含量較CY組有所降低（P＞0.05）。CY組的肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，CY和CY+SJZ組脾臟紅白髓界限不明顯；CY+YXF組肝細(xì)胞板完整，白髓大而明顯；CY+SJZ組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。結(jié)論，YXF制劑通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子生成，對(duì)CY介導(dǎo)的免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，拮抗CY對(duì)肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于SJZ。

銀杏葉復(fù)方；免疫抑制小鼠；細(xì)胞因子；病理變化

目前在養(yǎng)殖過(guò)程中由于化藥、抗生素的盲目濫用和嚴(yán)重超標(biāo)，導(dǎo)致畜禽適應(yīng)能力和抗病能力下降，也造成多病原疫病流行，由此發(fā)生的食品安全問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮。中藥則在協(xié)調(diào)機(jī)體平衡，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力方面具有獨(dú)特療效［1］，將中醫(yī)理論應(yīng)用于動(dòng)物身上，將“治未病”作為動(dòng)物保健的前提，能夠減少疫苗、化學(xué)藥物及抗生素的使用。中醫(yī)認(rèn)為“四季脾旺不受邪”，脾失健運(yùn)，氣血生化能力下降，表現(xiàn)為免疫功能的低下。許多研究表明，脾虛動(dòng)物均有明顯的免疫功能低下，其中又以細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能所受影響更明顯［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，脾虛小鼠存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)之間的調(diào)節(jié)失衡，最終引起脾虛時(shí)的機(jī)體免疫功能低下，經(jīng)銀杏葉復(fù)方治療后上述免疫失調(diào)得到明顯糾正［3］；銀杏葉復(fù)方的急性毒性、最大耐受量及細(xì)胞毒性研究表明該方劑毒性很小，臨床使用安全［4］；飼糧中添加適量的銀杏葉復(fù)方制劑，可維持和養(yǎng)護(hù)斷奶肉兔的小腸黏膜組織［5］。為進(jìn)一步探討銀杏葉復(fù)方對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用，本研究根據(jù)中藥方劑的組方原則，以具有免疫調(diào)節(jié)作用的四君子湯為對(duì)照，觀察了銀杏葉復(fù)方對(duì)CY所致免疫抑制模型小鼠細(xì)胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響，為組方優(yōu)化以及用于動(dòng)物養(yǎng)殖實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料環(huán)磷酰胺（Cy）（0.2 g/支），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：10030921。每支Cy用10 mL生理鹽水溶解，以75 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。

四君子湯為以3∶3∶3∶1配比的黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草，選自《太平惠民和劑局方》。

銀杏葉復(fù)方制劑包括銀杏葉、黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮。銀杏葉粉購(gòu)自長(zhǎng)沙博鍵生物科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/ADPG001-2008；其余藥物均購(gòu)自龍巖市第一醫(yī)院，質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)獸藥典標(biāo)準(zhǔn)。

以上2種方劑按比例配比，采用傳統(tǒng)水煎法：蒸餾水預(yù)行浸泡2 h，加熱煎煮2次，第1次保持微沸30 min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30 min，濾出藥液；合并2次濾液，小火濃縮至1 g/mL（按照生藥量計(jì)算）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物6周齡清潔級(jí)KM種小鼠，雌性，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)2007000564825。

1.3 免疫抑制小鼠模型的建立選用細(xì)胞毒化療藥物—CY制作免疫抑制模型，臨床研究表明CY也是一種免疫抑制劑，使小鼠細(xì)胞免疫功能受到明顯的抑制，可建立長(zhǎng)期免疫低下模型［6］。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)以小鼠精神沉郁、怕冷、扎堆，體重顯著減輕表示模型制作成功，CY的使用劑量為每支Cy用10 mL生理鹽水溶解，以75 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。

1.4 動(dòng)物分組與處理KM種小鼠180只，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只小鼠。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組見(jiàn)表1。各組灌服蒸餾水和相應(yīng)制劑的劑量為0.3 mL/只，每天1次；生理鹽水和CY的劑量按照75 mg/kg體重腹腔注射，隔日一次。連續(xù)15 d。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

1.5 血清中細(xì)胞因子含量的測(cè)定末次給藥各組小鼠禁食不禁水，12h后眼眶采血1mL，離心（3500r/min） 15 min，取血清，放入EP管，-70℃保存。采用放射免疫方法檢測(cè)白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。試劑盒均由北京華英生物技術(shù)研究所提供，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 切片的制作和觀察將采血后小鼠的肝和脾用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)方法制備切片并HE染色，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan′s多重比較，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)免疫抑制小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-a含量的影響由表2可見(jiàn)，CY組的IL-1含量較CK組顯著下降（P＜0.05），YXF組與SJZ組IL-1的含量較CK組顯著增加（P＜0.05），CY+ YXF組IL-1的含量較CY組有所增加但差異不顯著（P＞0.05）；CY+SJZ組IL-1的含量較CY組顯著提高（P＜0.05），與CY+YXF組含量相比差異不顯著（P＞0.05）；CY組IL-6的含量與其他各試驗(yàn)組相比差異不顯著（P＞0.05）；CY組TNF-α含量較CK組顯著下降（P＜0.05），YXF組與CY+YXF組TNF-α含量較CY組有所增加，但差異不顯著（P＞0.05），SJZ組和CY+SJZ組TNF-α含量較CY組有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)免疫抑制小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的影響ng·mL-1

2.2 銀杏葉復(fù)方對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝脾組織形態(tài)的影響經(jīng)采血后的小鼠進(jìn)行處死解剖取肝臟、脾臟，可明顯觀察到凡注射過(guò)CY的小鼠，脾臟均有不同程度的萎縮，肝臟及其他臟器未見(jiàn)明顯肉眼可見(jiàn)病變。對(duì)肝和脾進(jìn)行組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)，CK組和YXF組小鼠肝細(xì)胞板完整，排列規(guī)則，細(xì)胞膜形態(tài)完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核大而深染，位于細(xì)胞中央（分別見(jiàn)圖A1、C1），脾組織中的白髓大而明顯（分別見(jiàn)圖A2、C2）；CY組的肝出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，肝細(xì)胞核濃染（核濃縮），有的細(xì)胞核已消失，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，可見(jiàn)壞死的肝細(xì)胞（圖B1），脾臟紅白髓界限不明顯，結(jié)構(gòu)雜亂，脾小梁密集（圖B2）；相對(duì)于CY組，CY+YXF組小鼠肝細(xì)胞板完整，排列規(guī)則，細(xì)胞核大而深染，胞質(zhì)染色均勻，肝組織未見(jiàn)明顯病變（圖D1），脾組織中的白髓大而明顯（圖D2）；SJZ組肝臟細(xì)胞個(gè)別出現(xiàn)核濃縮甚至核消失（見(jiàn)E1），脾臟白髓?。ㄒ?jiàn)E2）；CY+SJZ組肝細(xì)胞的腫脹現(xiàn)象減輕，少見(jiàn)肝細(xì)胞壞死和空泡樣變性，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常（F1），脾臟紅白髓界限不明顯，脾小梁密集（圖F2）。以上結(jié)果表明，銀杏葉復(fù)方能有效拮抗CY對(duì)肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于四君子湯。

圖1 小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，400×）

圖2 小鼠脾臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，40×）

3 討論

CY是一種細(xì)胞毒性藥物，同時(shí)也屬于烷化劑類免疫抑制劑，作為一種化療藥物，因具有明顯的殺傷腫瘤作用，在腫瘤治療中被廣泛應(yīng)用。其作用主要是破壞DNA的結(jié)構(gòu)，它能殺死有絲分裂和進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，故在免疫學(xué)研究中，常以CY作為細(xì)胞免疫、體液免疫中的免疫抑制模型的制備藥物［7-9］。臨床實(shí)踐證明，在拮抗化療損傷方面，中醫(yī)藥有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，具有扶正祛邪的復(fù)方制劑目前被廣泛應(yīng)用于臨床。如韓春楊等［10］研究發(fā)現(xiàn)，自擬中藥免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)免疫抑制小鼠血細(xì)胞數(shù)、體質(zhì)量、脾臟指數(shù)以及脾、肝組織病理學(xué)均表現(xiàn)出一定的正向調(diào)節(jié)作用；吳軍等［11］研究了四君子湯、六味地黃湯對(duì)CY致小鼠免疫抑制的拮抗作用，結(jié)果表明CY能明顯降低小鼠脾指數(shù)，抑制胸腺細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡，而四君子湯和六味地黃湯能顯著提高脾指數(shù)，促進(jìn)胸腺細(xì)胞增殖及抑制脾細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)中免疫抑制組小鼠的血清中Th1型細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1較對(duì)照組顯著降低，而Th2型細(xì)胞因子IL-6含量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，Th1/Th2細(xì)胞比例失調(diào)，可能的作用機(jī)制是由CY導(dǎo)致了機(jī)體免疫功能的失調(diào)，詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)采用CY制作小鼠的免疫抑制模型，顯示其對(duì)機(jī)體免疫功能的損傷是多方面的。從細(xì)胞因子角度分析，CY阻抑了多種細(xì)胞因子（IL-1、IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生；從形態(tài)學(xué)角度分析，CY則引起小鼠肝臟和脾臟細(xì)胞的病理學(xué)變化，銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子生成，對(duì)CY介導(dǎo)免疫抑制模型小鼠的細(xì)胞免疫發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)作用，能有效拮抗CY對(duì)肝脾組織造成的損傷，這種作用與銀杏葉復(fù)方組成有關(guān)。中醫(yī)理論中肝為剛臟，其性疏泄調(diào)達(dá)，有賴于脾生化之水谷精微濡養(yǎng)，才能剛?cè)嵯酀?jì)，體陰而用陽(yáng)，則稱為“脾土營(yíng)肝木”。若脾失健運(yùn)，水濕停聚，壅塞氣機(jī)，反侮肝木，致肝失疏泄，即“土壅侮木”［12］，方中，銀杏葉味甘、苦、澀，性平，歸心、肺經(jīng)，具有斂肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效［13］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉所含化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，包括黃酮類、萜類、生物堿、多糖、酚類及氨基酸等。其中黃酮類和萜內(nèi)酯是銀杏葉中發(fā)揮獨(dú)特藥理活性的有效成分，而且是銀杏葉及其中間品和植物藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的重要依據(jù)［14］。近年研究發(fā)現(xiàn)，其藥理作用范圍不斷擴(kuò)大，特別是具有促進(jìn)毛細(xì)血管循環(huán)以及營(yíng)養(yǎng)脾胃和心腦臟器功能的作用［15］。黃芪、黨參為補(bǔ)氣健脾、益血首選藥物，三藥合用具有補(bǔ)氣健脾、提升脾胃消化功能之功效，是為君藥，白術(shù)補(bǔ)氣健脾，燥濕利水，協(xié)助君藥以健脾化濕，使脾胃功能更旺，為臣藥。茯苓利水滲濕、健脾為佐，砂仁、陳皮化濕行氣，調(diào)中是為使藥。中藥五行理論認(rèn)為心屬火，脾屬土，而火又生土，故銀杏葉有利脾之功效，諸藥合用共奏補(bǔ)氣健脾、營(yíng)養(yǎng)臟器、行氣化濕之功效，脾胃功能旺盛，營(yíng)養(yǎng)充足則免疫力增強(qiáng)。

4 結(jié)論

銀杏葉復(fù)方制劑通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子生成，對(duì)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)免疫抑制模型小鼠的細(xì)胞免疫發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，能有效拮抗CY對(duì)肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于四君子湯。

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Effect of Ginkgo Biloba Compound on Cytokines and Histomorphology of Liver and Spleen in Immunosuppressive Mice

LI Yan1，2*，DENG Xin-wei1，ZENG Fu-yan1，WANG Hua1，2，YIN Hui-fang1，2
（1.Collge of Life Science，Longyan University，F(xiàn)ujian Longyan 364000，China；2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，F(xiàn)ujian Longyan 364000，China）

This experiment was conducted to study the Ginkgo biloba compound on cytokines and histomorphology of liver and spleen in the cyclophosphamide（CY）induced immunosuppression mice.A total of 180 female，KM mice were divided randomly into 6 groups with，six replicates and five in each.Group A was control group with normal mice（CK）.Group B was cyclophosphamide induced mice（CY）.Group C was normal mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（YXF）.Group D was cyclophosphamide induced mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（CY+YXF）.The last two groups were E（SJZ）and F（CY+SJZ），which were both administered by Sijunzi decoction and consisted of normal mice and cyclophosphamide induced mice respectively.Group A and B were administered with 0.3 mL distilled water everyday，while group C/D and group E/F were injected Ginkgo biloba compound and Sijunzi decoction as the same volume.The results showed that The content of IL-1，TNF-α was decreased significantly（P＜0.05）in group CY when compared with group CK.The contents of IL-1，TNF-α in group D（CY+YXF）were increased（P＞0.05）when compared with group CY.The level of TNF-α in group F（CY+SJZ）was lower than group CY（P＞0.05）.Moreover，hepatic vacuolar degeneration was found and red pulp's boundary in spleen was not clear in group CY，while the hepatic cell were aligned and integrated and the white pulp in spleen tissue was clear in group CY+YXF.In group CY+SJZ，the liver swelling was reduced and hepatic cell vacuoles degeneration was rarely happened.But the red and white pulp line in spleen was not obvious.The result indicatedthat the Ginkgo biloba compound could effectively inhibit CY induced damage of liver and spleen by generating regulatory cytokines and enhancing function of the immune cell in immunosuppression model mice.Furthermore，the therapeutic effect of Ginkgo biloba compound was better than Sijunzi decoction.

compound of Ginkgo biloba；immunosuppressive mice；cytokine；pathologic changes

S865.5

：A

：0258-7033（2015）19-0071-04

2015-02-11；

2015-05-07

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470129）；龍巖市科技局項(xiàng)目（2014LY24）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01142）

李焰（1968-），女，四川安縣人，碩士，教授，主要從事飼料添加劑研究，E-mail：529783204@qq.com

*通訊作者