法醫(yī)STR的快速檢驗(yàn)方法

鄭小婷，李麗

（1.浙江省公安廳物證鑒定中心，浙江杭州310009；2.江門市公安局刑警支隊(duì)，廣東江門529000）

以STR復(fù)合擴(kuò)增檢測為代表的法醫(yī)DNA分型技術(shù)以其靈敏度高、核心序列小、可復(fù)合擴(kuò)增、方法易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢，已經(jīng)成為當(dāng)前法庭科學(xué)DNA檢驗(yàn)的主要手段，在各國刑事案件偵破和民事案件解決中發(fā)揮了重要的作用。本研究在國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室法醫(yī)STR快速檢驗(yàn)方法[1]的基礎(chǔ)上，從生物物證DNA免提取擴(kuò)增檢驗(yàn)、生物物證DNA快速提取檢驗(yàn)、生物物證DNA快速擴(kuò)增、利用新型檢測設(shè)備快速檢測及使用GeneMapper ID-X軟件快速分析5個(gè)方面進(jìn)行歸納。

1 生物物證DNA免提取擴(kuò)增檢驗(yàn)

免提取擴(kuò)增技術(shù)又稱直接PCR或直接擴(kuò)增技術(shù)，是指將未經(jīng)DNA提取或其他前處理的樣本直接加入PCR反應(yīng)體系并獲得擴(kuò)增產(chǎn)物[2-3]。直接擴(kuò)增試劑盒在PCR反應(yīng)液中添加了有效的PCR反應(yīng)抑制劑[4]，由于其對(duì)血紅素、鞣酸、腐植酸等抑制物的耐受性更高，因此，只要生物物證在單位體積內(nèi)DNA含量足夠，實(shí)驗(yàn)室就可運(yùn)用直接擴(kuò)增法獲得較好的分型。

商品化的直接擴(kuò)增試劑盒如Powerplex?16 HS系統(tǒng)、Identifiler?Direct PCR擴(kuò)增試劑盒等均能對(duì)血液和煙蒂樣本直接擴(kuò)增，檢驗(yàn)成功率可達(dá)94%以上[5]。Identifiler?Direct PCR擴(kuò)增試劑盒還能對(duì)肋軟骨進(jìn)行直接擴(kuò)增和檢測，方法簡單、快速、穩(wěn)定[6]。由于直接擴(kuò)增可采用10μL體系，當(dāng)血斑量較少時(shí)，選用直接擴(kuò)增檢驗(yàn)可減少DNA損耗、節(jié)省提取步驟，提高分型成功率。有研究[7]表明，直接擴(kuò)增試劑盒對(duì)手套、飲料瓶、吸管等接觸性DNA也能直接擴(kuò)增，獲得有效分型。

2 生物物證DNA快速提取檢驗(yàn)

2.1 堿性裂解法堿性裂解法[8]因強(qiáng)堿NaOH能有效消除抑制劑對(duì)

Taq酶的抑制，使擴(kuò)增效果明顯增強(qiáng)。運(yùn)用堿性裂解法可在5~10min內(nèi)快速提取血斑、唾液斑、精斑、毛發(fā)、新鮮組織等常規(guī)生物物證上的DNA。改良的堿性裂解法[9]，通過調(diào)整NaOH的濃度至0.25mol/L、Tris-HCl的濃度至0.05mol/L及pH值至6.5，可使檢驗(yàn)結(jié)果均衡性達(dá)到最好，且在8min內(nèi)就可完成各類生物物證的DNA提取，尤其適用于毛發(fā)及精斑的檢驗(yàn)。

2.2 運(yùn)用脫氧核糖核酸酶

含有精斑的混合斑物證檢驗(yàn)耗時(shí)長，常規(guī)方法在消化女性成分后，需進(jìn)行多次清洗以清除女性成分，用常規(guī)的Chelex法、硅珠法或磁珠法提取精子也需較長時(shí)間。脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ可消化單鏈或雙鏈DNA，產(chǎn)生具有3羧基和5′磷酸末端的2-、3-寡核苷酸產(chǎn)物[10]，可以使女性上皮細(xì)胞DNA降解但不會(huì)破壞精子頭部的DNA。在差異裂解法的同時(shí)，應(yīng)用DNaseⅠ將混合斑中的女性DNA分解除去，再結(jié)合堿性裂解法消化精子，可省去清洗步驟，快速獲得精子DNA[11]。

2.3 PrepFiler Express BTA提取試劑盒

高林林等[12]使用PrepFiler Express BTA提取試劑盒（美國AB公司）裂解消化骨粉或牙粉，配合Auto-Mate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取工作站提取骨骼及牙齒DNA，用少量的檢材（150mg左右）在3h左右就可以完成骨骼及牙齒的DNA提取及純化，該方法檢驗(yàn)了150年前的清代遺骸，成功獲得常染色體STR分型。該研究證明，利用PrepFiler Express BTA提取試劑盒裂解消化骨粉或牙粉，結(jié)合硅珠法進(jìn)行手工提取純化，可達(dá)同樣快速檢驗(yàn)的效果。

3 生物物證DNA快速擴(kuò)增

3.1 使用高效的擴(kuò)增試劑盒

目前使用常規(guī)提取、擴(kuò)增、檢測方法進(jìn)行STR檢驗(yàn)生物物證至少需要8~10 h，其中最耗時(shí)的步驟是PCR擴(kuò)增。使用特殊處理后的DNA聚合酶和更快的變溫速率已經(jīng)可以使PCR復(fù)合擴(kuò)增的時(shí)間下降至約30min或更短[13-14]。近年來部分商品化擴(kuò)增試劑盒在擴(kuò)增時(shí)間上較以往試劑盒明顯縮短，如GlobalFiler試劑盒（美國AB公司），利用經(jīng)過優(yōu)化的試劑、熱循環(huán)參數(shù)以及寡核苷酸合成和純化上的最新技術(shù)，使其在80min內(nèi)可完成21個(gè)常染色體基因座的復(fù)合擴(kuò)增。而目前實(shí)驗(yàn)室常用的Identifiler試劑盒，擴(kuò)增時(shí)間需要3h左右。

3.2 調(diào)整擴(kuò)增參數(shù)

李秋陽等[15]通過調(diào)整GoldeneyeTM20A-M試劑盒的擴(kuò)增參數(shù)，進(jìn)一步縮短其PCR擴(kuò)增時(shí)間至40 min左右，通過對(duì)濾紙血痕進(jìn)行批量檢驗(yàn)，獲得了良好的分型結(jié)果，而建庫樣本保存時(shí)間的長短對(duì)檢出率的影響不顯著。

3.3 快速擴(kuò)增設(shè)備

升降溫速率快、溫控性能好的快速PCR儀，如Veriti擴(kuò)增儀（美國AB公司）、Eppendorf Mastercycler可明顯縮短PCR擴(kuò)增時(shí)間。

4 利用新型檢測設(shè)備快速檢測

在檢測設(shè)備上，目前實(shí)驗(yàn)室普遍配置的3100型或3130XL型遺傳分析儀在45min的時(shí)間完成16個(gè)樣本的檢測，而新型的3500XL型遺傳分析儀可在35 min的時(shí)間內(nèi)完成24個(gè)樣本的檢測，有效提高實(shí)驗(yàn)室在大批量生物物證檢驗(yàn)的工作效率。

5 使用GeneMapper ID-X軟件快速分析

大通量的檢測設(shè)備使物證樣本快速獲得檢測的同時(shí)，也帶來大批量的數(shù)據(jù)需要分析，選用好的分析軟件往往使實(shí)驗(yàn)室工作事半功倍。GeneMapper ID-X軟件可以對(duì)310、3130XL、3500XL等遺傳分析儀所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)分。通過軟件運(yùn)行驗(yàn)證后，標(biāo)記為“綠燈”的DNA圖譜通常很好，一般不需要進(jìn)行人工審查。在建立專案數(shù)據(jù)包后，可從大量的檢材中快速發(fā)現(xiàn)相同分型，并可分析混合分型與單一分型的關(guān)系，為混合分型找到可能的提供者。

在實(shí)際檢案工作中，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢驗(yàn)需求靈活使用不同的快速STR檢驗(yàn)方案，在最短的時(shí)間內(nèi)為偵查提供破案線索，鎖定犯罪嫌疑人。

[1]平原，周懷谷，許炎，等.6+1 STR試劑盒和電泳凝膠EXQ20用于DNA快速檢驗(yàn)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（6）：444-446.

[2]Wang DY，Chang CW，Oldroyd NJ，et al.Direct amplification of STRs from blood or buccal cell samples[J].Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2009，2（1）：113-114.

[3]Linacre A，Pekarek V，Swaran YC，et al.Generation of DNA profiles from fabrics without DNA extraction[J].Forensic Sci Int Genet，2010，4（2）：137-141.

[4]Bu Y，Huang H，Zhou G.Direct polymerase chain reaction（PCR）from human whole blood and filter-paper-dried blood by using a PCR buffer with a higher pH[J].Anal Biochem，2008，375（2）：370-372.

[5]張艷霞，李愛強(qiáng)，趙麗，等.直接擴(kuò)增法用于常見現(xiàn)場檢材DNA檢驗(yàn)[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（1）：62-63.

[6]李林，劉靜，王敏，等.直接擴(kuò)增法在血痕、肋軟骨和唾液檢材中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（2）：148-150.

[7]李長征，劉海東.直擴(kuò)試劑盒檢驗(yàn)接觸DAN檢材初探[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（3）：247.

[8]劉翠蘭，胡家偉.堿性裂解法提取法醫(yī)生物檢材DNA及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2001，16（2）：102-104.

[9]李愛強(qiáng)，趙興春，張艷霞，等.生物檢材DNA堿性裂解提取法的優(yōu)化與改良[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（4）：301-304.

[10]Vitolo JM，Thiriet C，Hayes JJ.DNaseⅠand hydroxyl radical characterization of chromatin complexes[J].Current Protocols in Molecular Biology，2001.doi:10.1002/0471142727.mb2104s48.

[11]袁自闖，金洪年，賴躍，等.DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法提取混合斑精子DNA[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：10-12.

[12]高林林，徐念來，謝煒，等.利用AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取骨骼及牙齒DNA[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（2）：127-129.

[13]Giese H，Lam R，Selden R，et al.Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis[J].J Forensic Sci，2009，54（6）：1287-1296.

[14]Vallone PM，Hill CR，Butler JM.Demonstration of rapid multiplex PCR amplification involving 16 genetic loci[J].Forensic Sci Int Genet，2008，3（1）：42-45.

[15]李秋陽，金萍，沈紅纓，等.GoldeneyeTM20A-M試劑盒在數(shù)據(jù)庫建設(shè)中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（4）：272-274.