SPE-GC/MS法分析魚(yú)塘水中的5種農(nóng)藥

藺大偉 ，張 艷 ，孫紅雷 ，李文海 ，邵 凱

（1．泰安市公安局刑警支隊(duì)刑事科學(xué)技術(shù)研究所，山東 泰安 271000；2.泰安市公安局泰山區(qū)分局刑事科學(xué)技術(shù)室，山東 泰安 271000）

近些年來(lái)，我國(guó)農(nóng)村地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，同時(shí)，隨著社會(huì)不穩(wěn)定因素增加，致使魚(yú)塘投毒案件激增。魚(yú)塘投毒不僅對(duì)養(yǎng)殖戶危害重大，而且對(duì)周?chē)h(huán)境、村民及牲畜存在很大的潛在危險(xiǎn)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成長(zhǎng)期影響[1]。該類案件最大的特點(diǎn)是使用毒物的隨機(jī)性大、地域性強(qiáng)、魚(yú)塘水中毒物含量低，其前處理方法多采用液-液萃取[2]和固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[3]。SPE現(xiàn)已成為毒物學(xué)分析中被廣泛采用的樣品前處理技術(shù)[4-5]。謝偉宏等[3]用DIKMA ProElutTMC18固相萃取柱提取魚(yú)塘水中6種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥，利用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器（gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD）進(jìn)行檢測(cè)，回收率在65.4%～88.4%。

本研究利用SPE聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）檢測(cè)克百威、硫丹、甲基對(duì)硫磷、莠去津和馬拉硫磷等本地區(qū)魚(yú)塘投毒案件中常見(jiàn)的5種有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和除草劑類農(nóng)藥。分別考察3種萃取柱的提取回收率，并對(duì)不同洗脫劑和洗脫體積的洗脫效果進(jìn)行比較，建立同時(shí)提取魚(yú)塘水中5種農(nóng)藥的固相萃取方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

PE Clarus 500 GC/MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Elite-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）（美國(guó)珀金埃爾默公司），12管固相萃取裝置（美國(guó)GC Science公司），氮吹儀（美國(guó)PIERCE公司），精密移液器［大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司］，Oasis HLB cartridge固相萃取柱（6mL/500mg，美國(guó) Waters公司），Bond Elut C18固相萃取柱（6 mL/500 mg，美國(guó) Varian公司），SampliQ C18固相萃取柱（6 mL/500 mg，美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試劑

克百威、硫丹、甲基對(duì)硫磷、莠去津、馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（99%高純）均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；乙醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Mallinckrodt Baker公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、苯均為分析純，購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。魚(yú)塘水取自泰山區(qū)周邊未被污染的魚(yú)塘。

1.3 工作液的制備

質(zhì)量濃度50 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確稱取5mg各標(biāo)準(zhǔn)品分別置于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，4℃下保存3個(gè)月。

1.4 試樣的配制

分別取50 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)工作液各10 mL，加入500mL容量瓶中，用魚(yú)塘水定容至刻度搖勻，配成1μg/mL的魚(yú)塘水試樣，待用。

1.5 方法

將100mL魚(yú)塘水試樣通過(guò)遠(yuǎn)端放置脫脂棉的分液漏斗，用于過(guò)濾魚(yú)塘水中的雜質(zhì)及浮游物，以免阻塞固相萃取柱。

SPE處理過(guò)程：用5 mL甲醇以1 mL/min的流速淋洗活化萃取柱，再用3mL去離子水以1mL/min的流速過(guò)柱，使萃取柱處于水溶性狀態(tài)；將過(guò)濾干凈的100 mL魚(yú)塘水試樣以1 mL/min的流速通過(guò)萃取柱；用5mL去離子水以1mL/min的流速過(guò)柱洗去雜質(zhì)；最后用3 mL洗脫劑以0.5 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液于試管中。氮吹儀濃縮至近干，加1mL乙醇定容，供GC/MS檢測(cè)。

1.6 GC/MS條件

1.6.1 色譜條件

Elite-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣為氦氣，純度 99.999%，流速 1mL/min；初始柱溫 80℃，以 10℃/min升溫至 280℃，保持10 min；進(jìn)樣器溫度250℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件

電離模式：EI，能量70eV，離子源溫度200℃，延遲掃描4 min，傳輸線溫度250℃，電子倍增器電壓500V；質(zhì)量掃描范圍：40～500amu。定量離子（m/z）：克百威為164、硫丹為195，甲基對(duì)硫磷為109、莠去津?yàn)?00、馬拉硫磷為73。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE條件優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了 Oasis HLB cartridge、Bond Elut C18和SampliQ C18固相萃取柱的提取效果，采用空白魚(yú)塘水加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式進(jìn)行提取回收率實(shí)驗(yàn)，每種固相萃取柱平行測(cè)定3次。5種農(nóng)藥的保留時(shí)間（tR）分別為克百威 16.09 min、硫丹 19.09 min，甲基對(duì)硫磷17.27min、莠去津15.42min、馬拉硫磷17.59min。由表1可見(jiàn)，Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg）對(duì)魚(yú)塘水中除草劑莠去津及甲基對(duì)硫磷的提取回收率高于其他兩種小柱，SampliQ C18固相萃取柱對(duì)魚(yú)塘水中硫丹的提取回收率低于其他兩種小柱，3種固相萃取柱對(duì)魚(yú)塘水中克百威、馬拉硫磷的提取回收率基本相同。因此本實(shí)驗(yàn)采用Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg）。

表1 不同固相萃取柱對(duì)試樣提取回收率的比較（n=3，%）

2.1.2 洗脫劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取苯、二氯甲烷、乙酸乙酯和V（二氯甲烷）∶V（正己烷）=1∶1 作為洗脫劑進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，每一種洗脫劑平行進(jìn)行3次測(cè)定。由表2可見(jiàn)，用苯作為洗脫劑時(shí)，對(duì)5種農(nóng)藥組分洗脫效果較好，提取回收率均高于60%；二氯甲烷、乙酸乙酯作為克百威、甲基對(duì)硫磷、莠去津和馬拉硫磷的洗脫劑，提取回收率也較為滿意，只是洗脫硫丹的提取回收率較低，而混合洗脫劑 V（二氯甲烷）∶V（正己烷）=1∶1 的提取回收率不理想，所以本試驗(yàn)選擇苯作為洗脫溶劑。

表2 使用Bond Elut C18固相萃取柱不同洗脫劑對(duì)試樣提取回收率的比較 （n=3，%）

2.1.3 洗脫劑體積優(yōu)化的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用3、4、6 mL劑量的苯進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，考察不同劑量洗脫劑洗脫后的提取回收率，每個(gè)洗脫劑量平行進(jìn)行3次測(cè)定。由表3可知，洗脫劑用量為3、4mL時(shí)提取回收率均較為滿意，使用6mL苯洗脫時(shí)，在揮干定容過(guò)程中用時(shí)長(zhǎng)，農(nóng)藥組分損失也較多，影響實(shí)驗(yàn)提取回收率。因此，為了最大程度節(jié)約時(shí)間，試驗(yàn)選用3mL洗脫劑進(jìn)行洗脫。

表3 不同洗脫劑體積（苯）對(duì)試樣提取回收率的比較（n=3，%）

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限

取100 mL經(jīng)測(cè)定不含農(nóng)藥的魚(yú)塘水樣，加入農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液，配制含 1、5、10、25、50μg/mL 混合試樣，使用 Bond Elut C18固相萃取柱（6 mL/500 mg）萃取，按1.5節(jié)方法提取，3 mL苯洗脫，經(jīng)濃縮定容后利用GC/MS法分析。5種農(nóng)藥質(zhì)量濃度的線性范圍為1～50μg/mL，以農(nóng)藥的峰面積（y）對(duì)其質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸。以3倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（μg/L）為檢出限（表 4）。

表4 5種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

2.2.2 準(zhǔn)確度和精密度

取500mL魚(yú)塘水，配制成含5μg/mL的混合試樣作加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)樣品做3次單獨(dú)測(cè)定，使用Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg），按 1.5 節(jié)方法進(jìn)行萃取，3mL苯作為洗脫劑，濃縮定容后，取1μL進(jìn)樣進(jìn)行GC/MS分析。以提取回收率表示準(zhǔn)確度，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示精密度。5種農(nóng)藥的提取回收率在61.49%～102.48%，方法準(zhǔn)確度較高，RSD均小于3.01%（表5），表明本方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，精密度和可靠性較好。

表5 5種農(nóng)藥的提取回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3，%）

2.3 方法應(yīng)用

2013年7月1日下午，本市某村徐某發(fā)現(xiàn)自己魚(yú)塘內(nèi)的魚(yú)開(kāi)始死亡。鑒定部門(mén)提取死魚(yú)較多水域的待檢水樣及對(duì)照水樣，應(yīng)用本研究方法進(jìn)行分析檢測(cè)，成功從待檢水樣中檢出硫丹（tR=19.12 min）成分（圖1），為案件的進(jìn)一步偵查提供了方向。

圖1 魚(yú)塘水中硫丹（箭頭）總離子流圖