革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白耐藥功能及其抑菌策略研究進(jìn)展

李碗芯,孫莉娜,林向民

(1.福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))；2.福建省高校作物生態(tài)與分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,福建福州350002)

革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白耐藥功能及其抑菌策略研究進(jìn)展

李碗芯1 ,2,孫莉娜1 ,2,林向民1 ,2

(1.福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))；2.福建省高校作物生態(tài)與分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,福建福州350002)

當(dāng)前細(xì)菌耐藥的形勢(shì)日益嚴(yán)峻 ,已引起全世界的廣泛關(guān)注.革蘭氏陰性細(xì)菌的耐藥性普遍比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌強(qiáng) ,這與鑲嵌或錨定在革蘭氏陰性細(xì)菌外膜上的蛋白耐藥功能密切相關(guān).目前已知外膜蛋白能夠阻礙抗生素通過(guò)外膜以及將抗生素排出胞外等方式使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性 ,但具體的耐藥與調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.近年來(lái) ,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展 ,特別是結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)在該領(lǐng)域的充分運(yùn)用 ,有關(guān)外膜蛋白功能的研究和技術(shù)取得了很大的進(jìn)步.本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在細(xì)菌外膜蛋白的結(jié)構(gòu)與耐藥機(jī)理、耐藥新功能及新機(jī)制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述 ,為揭示革蘭氏陰性菌耐藥形成機(jī)制奠定基礎(chǔ).

外膜蛋白；耐藥機(jī)制；藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；抑菌策略

由于抗生素的誤用與濫用 ,細(xì)菌的耐藥性正逐漸成為制約世界衛(wèi)生健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素之一 ,這受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注.從1983年至1987年 ,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Ad-ministration ,FDA)共批準(zhǔn)16種抗生素上市 ,而1998年至2002年僅批準(zhǔn)7種 ,2008年至2012年只批準(zhǔn)了2種 ,抗生素的研發(fā)明顯慢于耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的速度.2013年McKenna[1]報(bào)道 ,碳青霉烯類抗生素曾被認(rèn)為是人類抵抗耐藥菌的最后一道防線 ,但目前已在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了針對(duì)此抗生素的超級(jí)耐藥菌株.因此 ,細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究與新型藥物作用靶點(diǎn)的篩選迫在眉睫 ,其已成為新型抗生素開發(fā)的重要研究領(lǐng)域 ,是當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題.

革蘭氏陰性細(xì)菌的耐藥性能普遍比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌強(qiáng) ,其中一個(gè)很重要的原因在于革蘭氏陰性細(xì)菌多了一層外膜 ,外膜上的蛋白具有控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或如抗生素等小分子進(jìn)出的功能 ,稱之為外膜蛋白(outer membrane protein ,OMP).除了部分錨定在外膜內(nèi)部或外部的脂蛋白以外 ,大部分外膜蛋白均由8－22個(gè)跨膜鏈 ,以反向平行方式通過(guò)相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結(jié)構(gòu)(β-barrel).跨膜鏈的數(shù)量決定了外膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) ,從而導(dǎo)致孔徑的不同[2].如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的OmpA、OmpF、TolC和OmpW等蛋白的結(jié)構(gòu)與功能具有代表性和特殊性.Nikaido et al[3]認(rèn)為 ,外膜蛋白可以通過(guò)啟動(dòng)細(xì)菌主動(dòng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(efflux pump systems)和改變細(xì)胞外膜的通透性而誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥特性的形成.

1 外膜蛋白的結(jié)構(gòu)與耐藥功能

1.1 細(xì)菌主動(dòng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

主動(dòng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)又稱外排(efflux) ,可以通過(guò)外膜蛋白與周質(zhì)空間蛋白和內(nèi)膜蛋白組成的復(fù)合物系統(tǒng) ,將抗菌藥物泵出細(xì)胞外.在目前已知的與抗生素抗性有關(guān)的外膜蛋白中 ,TolC是一個(gè)廣泛報(bào)道的參與外排廣譜性抗生素藥物的多功能外膜蛋白.1996年Nikaido[4]和Fralick[5]幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)TolC與周質(zhì)空間蛋白ArcA和內(nèi)膜蛋白ArcB形成的復(fù)合物具有重要的多重藥物外排功能；隨后在產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、豬布魯氏桿菌(Brucella suis)等革蘭氏陰性細(xì)菌中相繼發(fā)現(xiàn) ,TolC的同源蛋白也具有外排抗生素的功能[6－7],形成如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的MexA-MexB-OprM和MexC-MexD-OprJ、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的VmeA-VmeB-TolC等復(fù)合物 ,統(tǒng)稱為多重耐藥外排系統(tǒng)[8].

結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究顯示 ,TolC可形成特殊的三聚體結(jié)構(gòu) ,3個(gè)亞基在外膜處由12條β折疊鏈共同組成一個(gè)β-桶狀結(jié)構(gòu) ,并在周質(zhì)空間處由12個(gè)α-螺旋形成內(nèi)空的通道[9].TolC長(zhǎng)桶狀的結(jié)構(gòu)使其容易在Ar-cA的協(xié)助下與AcrB結(jié)合 ,形成連接細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶厥馔ǖ?,在質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的作用下將抗生素排出胞外[10－11].此外 ,TolC可以與主要易化子(major facilitator superfamily ,MFS)家族和ABC超家族(ATP bind-ing casssette superfamily)相互作用.目前已知的與抗生素抗性相關(guān)的大腸埃希氏菌外膜蛋白復(fù)合物 ,大部分與TolC相關(guān) ,包括AcrAB、AcrAD、AcrEF、MdtEF、MdtABC和MacAB等系統(tǒng)[5 ,12－14],可以外排如疏水性溶劑以及β-內(nèi)酰胺類、萘啶酮酸和氨基糖苷類等多種抗生素.由于TolC蛋白在細(xì)菌耐藥中的重要作用 ,缺失tolC基因的菌株對(duì)廣譜性抗生素的敏感性顯著下降[15].

1.2 改變細(xì)胞外膜的通透性

從20世紀(jì)90年代至今 ,研究人員從蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及基因組序列預(yù)測(cè)等方面對(duì)涉及泵外排系統(tǒng)的外膜蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的研究 ,并取得重大進(jìn)展.但多數(shù)研究集中在外膜蛋白空間結(jié)構(gòu)和孔徑大小與抗生素的相互作用方面 ,有關(guān)這些蛋白的耐藥功能與調(diào)控機(jī)制的研究并不多.研究比較透徹的涉及抗生素?cái)z取的外膜蛋白為OmpC和OmpF超家族 ,這是大腸埃希氏菌細(xì)胞外膜上的2個(gè)主要孔道蛋白 ,對(duì)一定大小的親水性小分子物質(zhì)具有非特異通道的屬性.這2個(gè)蛋白具有很高的同源性 ,結(jié)構(gòu)和功能也相似.但是通過(guò)對(duì)多種不同分子大小的有機(jī)分子的滲透率的研究發(fā)現(xiàn) ,OmpF的孔道半徑比OmpC至少大6倍 ,使得β-內(nèi)酰胺類抗生素、膽酸等有毒物質(zhì)更易從OmpF的通道通過(guò)；而OmpC可以允許分子質(zhì)量小于600 u的親水性溶質(zhì)或離子通過(guò)[16].這2個(gè)外膜蛋白對(duì)不同抗生素有不同的敏感性 ,ompF基因缺失可顯著增強(qiáng)菌株對(duì)氟諾沙星、四環(huán)素、頭孢菌素、先鋒霉素、氨芐青霉素和頭孢西丁的耐藥性 ,輕微提高對(duì)氯霉素的耐藥性；ompC缺失則可增強(qiáng)菌株對(duì)頭孢菌素和頭孢西丁的耐藥性 ,而對(duì)氟諾沙星、氯霉素和四環(huán)素不敏感[17－18].但是 ,OmpC與OmpF并不僅是簡(jiǎn)單的抗生素通道 ,細(xì)菌還可以根據(jù)外界環(huán)境的變化 ,調(diào)節(jié)其表達(dá)以維持外膜通透性的動(dòng)態(tài)平衡.例如 ,在高滲透壓或高溫環(huán)境下 ,OmpC表達(dá)升高 ,而OmpF表達(dá)降低 ,從而減少分子質(zhì)量相對(duì)大的溶質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞[19].深入研究發(fā)現(xiàn) ,這一對(duì)外膜蛋白受細(xì)菌雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory sys-tem ,TCS)OmpR/EnvZ和CpxR/CpxA的綜合調(diào)控.Lin et al[20]發(fā)現(xiàn) ,這2對(duì)雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)在金霉素和萘啶酮酸抗生素刺激下 ,OmpC和OmpF的表達(dá)呈現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)模式.其中 ,在金霉素作用下 ,雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)綜合調(diào)控導(dǎo)致OmpC和OmpF的表達(dá)均降低；在萘啶酮酸作用下 ,OmpC表達(dá)明顯升高 ,而OmpF表達(dá)降低.

除了OmpC和OmpF家族蛋白 ,還有一些外膜蛋白參與了細(xì)菌對(duì)抗生素?cái)z入的控制 ,如結(jié)核桿菌(My-cobacterium tuberculosis)的CpnT以及銅綠假單胞菌的OprD等 ,但在這些方面的研究相對(duì)較少[21－22].

1.3 新耐藥相關(guān)外膜蛋白的發(fā)現(xiàn)

細(xì)菌外膜蛋白可以通過(guò)增加抗生素的外排和減少抗生素的進(jìn)入使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥特性 ,但有關(guān)外膜耐藥蛋白的種類、功能和特點(diǎn)還需要深入系統(tǒng)的研究.以大腸埃希氏菌為例 ,外膜蛋白的基因注釋至少有82個(gè) ,而目前報(bào)道具有耐藥功能的卻不多 ,這與有些外膜蛋白屬于低豐度蛋白或只在特定條件下表達(dá)等因素有關(guān)；此外 ,抗生素的不同抑菌機(jī)制也對(duì)研究造成了一定難度.

運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究細(xì)菌耐藥機(jī)制 ,使大規(guī)模尋找抗生素作用靶點(diǎn)和耐藥功能蛋白成為可能.我國(guó)學(xué)者利用基于2DE的外膜蛋白亞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)耐不同抗生素細(xì)菌的外膜蛋白功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究 ,發(fā)現(xiàn)在大腸埃希氏菌中 ,除了TolC、YhiU、OmpC和OmpF等常見耐藥功能蛋白以外 ,FimD、OmpT、Tsx、YfiO、OmpW、LamB、NlpB和FadL等多個(gè)外膜蛋白也與鈉啶酮酸、鏈霉素、金霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素的耐藥性相關(guān)[23－25].Peng et al[26]對(duì)抗氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素的銅綠假單胞菌外膜蛋白組分進(jìn)行比較 ,發(fā)現(xiàn)了11個(gè)耐藥相關(guān)外膜蛋白 ,其中10個(gè)外膜蛋白為以往報(bào)道.此外 ,國(guó)內(nèi)外學(xué)者還運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的OmpU、OmpN、VPA1644和VPA0526 ,鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)的OmpA、CarO和OmpW等耐藥相關(guān)外膜蛋白[27－28].

1.4 外膜蛋白的其他耐藥功能

外膜及外膜蛋白常常被形容為進(jìn)出革蘭氏陰性細(xì)菌的一扇“門” ,通過(guò)進(jìn)入和外排系統(tǒng)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性.然而 ,近年來(lái)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)外膜蛋白還可能存在其他的耐藥途徑.Lin et al[23]對(duì)外膜蛋白LamB的耐藥功能進(jìn)行了深入研究 ,發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌的外膜蛋白LamB在耐藥菌株中的表達(dá)普遍下調(diào) ,缺失lamB導(dǎo)致金霉素在細(xì)胞內(nèi)積聚 ,菌株耐藥性升高4倍以上 ,其補(bǔ)救菌株可恢復(fù)到野生菌株的耐藥能力.報(bào)道顯示 ,LamB除了是抗生素的非特異通道外 ,還可能介導(dǎo)一個(gè)重要的負(fù)調(diào)耐藥機(jī)制 ,該蛋白有可能與其他蛋白相互作用而行使耐藥功能.Lin et al[29]通過(guò)免疫共沉淀及免疫印跡方法 ,成功發(fā)現(xiàn)了一個(gè)LamB的復(fù)合物蛋白Odp1.該蛋白是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1的組成部分 ,在調(diào)控糖酵解、TCA循環(huán)以及ATP生成等體內(nèi)重要生化代謝途徑中起限速酶的作用.在利用iTRAQ定量標(biāo)記研究大腸埃希菌應(yīng)對(duì)金霉素以及嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)應(yīng)對(duì)土霉素應(yīng)激時(shí) ,也發(fā)現(xiàn)LamB相關(guān)蛋白、Odp1以及能量生成相關(guān)基因表達(dá)下降的現(xiàn)象 ,進(jìn)一步證實(shí)LamB在耐藥中的負(fù)調(diào)作用可能普遍存在于自然進(jìn)化的耐藥菌中 ,且具有多物種、多重耐藥的特性[30－31].前人研究結(jié)果說(shuō)明LamB是細(xì)菌體內(nèi)的耐藥關(guān)鍵蛋白.其與Odp1相互作用 ,很可能通過(guò)限制糖類進(jìn)入細(xì)胞并參與能量代謝效應(yīng)的負(fù)調(diào)控 ,降低細(xì)菌體內(nèi)的能量代謝與NADH濃度 ,最終導(dǎo)致細(xì)菌耐藥.

綜上所述 ,外膜蛋白除了改變細(xì)胞外膜的通透性和啟動(dòng)主動(dòng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以外 ,還可能有很多新的耐藥功能等待探索.

2 蛋白相互作用平衡網(wǎng)絡(luò)

由于抑制TolC、OmpC及OmpF等外膜蛋白耐藥作用的新藥物不斷出現(xiàn) ,人們一度認(rèn)為抗生素耐藥的問(wèn)題已得到解決 ,但事實(shí)并非如此.研究發(fā)現(xiàn) ,即使是缺失tolC基因的菌株 ,在亞致死抗生素濃度下傳代培養(yǎng)一定代數(shù)后 ,又可以迅速獲得藥物抗性.Li et al[25]對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)的分析 ,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在耐藥過(guò)程中 ,并不只是幾個(gè)外膜蛋白發(fā)生了變化 ,而是形成了蛋白相互作用的動(dòng)態(tài)平衡網(wǎng)絡(luò) ,即當(dāng)一個(gè)重要外膜蛋白被抑制后 ,細(xì)菌為了生存 ,將調(diào)節(jié)外膜上的其他蛋白表達(dá) ,形成一個(gè)耐藥相關(guān)外膜蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) ,最終導(dǎo)致細(xì)菌耐藥.例如 ,在缺失tolC的大腸桿菌耐鏈霉素菌株中 ,OmpW和Dps表達(dá)升高 ,而OmpT和LamB表達(dá)下降；而在缺失lamB的耐藥菌株中 ,OmpW表達(dá)上升 ,FadL、OmpT和Dps表達(dá)均下降.由此表明 ,研究這些耐藥相關(guān)外膜蛋白在不同抗生素中的變化方式、相互作用網(wǎng)絡(luò)及其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制 ,對(duì)深入闡明細(xì)菌的耐藥新機(jī)制具有重要意義.

3 外膜蛋白抑制細(xì)菌耐藥策略

面對(duì)當(dāng)前嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥形勢(shì) ,舊抗生素和同類型抗生素已達(dá)不到抑菌的效果 ,人們亟需開發(fā)新型抑菌機(jī)制的藥物.鑒于細(xì)菌外膜蛋白在耐藥中的重要作用 ,近年來(lái)開發(fā)了以多種外膜蛋白為藥物靶點(diǎn)的抗耐藥菌藥物.

3.1 增強(qiáng)細(xì)菌外膜蛋白通透性的藥物

研究證實(shí) ,許多藥物在還未進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部就被細(xì)菌外膜蛋白通道擋在作用靶點(diǎn)之外 ,一些諸如多黏菌素、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素可以通過(guò)增加外膜蛋白的通透性達(dá)到抗菌作用.一些小分子物質(zhì)也具有類似功能 ,如精胺可以抑制大腸桿菌OmpF的通道 ,尸胺通過(guò)抑制離子通道降低細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素和頭孢菌素Ⅱ的耐藥性[32－33].

3.2 抑制細(xì)菌外排泵功能的藥物

近年來(lái)發(fā)展了一系列抑制外排泵功能的藥物.根據(jù)其作用機(jī)理分為以下幾類.

(1)干擾外排泵組裝的抑制劑.外排泵系統(tǒng)一般由外膜、質(zhì)膜和周質(zhì)空間蛋白復(fù)合物組成.抑制外排泵上相關(guān)蛋白的合成或占據(jù)其功能位點(diǎn) ,外排系統(tǒng)就無(wú)法行使其功能.例如 ,Globomycin可以抑制結(jié)核桿菌AcrAB-TolC中AcrA前體的形成 ,從而阻斷了外排泵的功能[34].

(2)阻斷外排泵能量來(lái)源的抑制劑.除ABC型外排泵是依賴ATP水解驅(qū)動(dòng)外 ,其余外排泵系統(tǒng)均是由質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)驅(qū)動(dòng) ,因此破壞質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的來(lái)源可以使外排系統(tǒng)崩潰.羰基氰化氯苯腙(CCCP)可以破壞跨膜電化學(xué)梯度 ,是體外試驗(yàn)常用的強(qiáng)電子解偶聯(lián)劑 ,對(duì)NepAB、EmrAB、MexAB、AcrAB以及SdeAB等復(fù)合物均有抑制作用[35－36].但是由于其副作用較強(qiáng) ,臨床上選用與其作用機(jī)制相同且毒性較小的奧美拉唑(omeprazole)和蘭索拉唑(lansoprazole)為質(zhì)子泵抑制劑[37].

(3)直接抑制或競(jìng)爭(zhēng)外排泵系統(tǒng)的抑制劑.苯丙氨酸－精氨酸－β－萘酰胺(PAβN)是常見的廣譜性外排泵抑制劑 ,其可以與抗生素競(jìng)爭(zhēng)RND家族外排泵 ,使抗生素集聚在細(xì)胞內(nèi) ,達(dá)到殺菌效果.此類抑制劑還包括抑制銅綠假單胞菌AcrB和MexB的MC-207、110及其衍生物 ,以及抑制產(chǎn)氣腸桿菌等細(xì)菌AcrAB的喹啉衍生物等[38－39].

(4)抑制藥物特異外排泵的藥物.Tet泵是由質(zhì)粒編碼 ,表達(dá)在細(xì)菌膜上的特異外排泵.研究發(fā)現(xiàn) ,13-CPTC是米諾環(huán)素衍生物 ,可以與四環(huán)素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Tet外排泵 ,并堵塞該泵 ,從而提高四環(huán)素在胞內(nèi)的濃度[40].

(5)特異性抗體抑制外排泵的藥物.如上所述 ,革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜蛋白是細(xì)菌多重耐藥系統(tǒng)的重要組成部分 ,如果以該蛋白作為靶點(diǎn) ,利用特異性抗體與靶點(diǎn)的結(jié)合 ,可對(duì)耐藥細(xì)菌起到明顯的抑制作用. Li et al[25]研究發(fā)現(xiàn) ,當(dāng)TolC抗體靶向耐鏈霉素或氯霉素的大腸埃希菌外膜TolC后 ,明顯提高了細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性 ,與缺失該蛋白的表現(xiàn)結(jié)果相似.以上研究說(shuō)明 ,特異外膜蛋白靶點(diǎn)的抗體配合低濃度抗生素可以有效抑制耐藥菌 ,是一種潛在的抑菌藥物 ,具有廣闊的應(yīng)用前景.

(6)適配體靶向抑制藥物.適配體(aptamer)是人工合成的一段隨機(jī)DNA、RNA或肽 ,其在足夠長(zhǎng)的序列下 ,理論上可以形成任何三維結(jié)構(gòu).因此 ,經(jīng)過(guò)幾次篩選后 ,可以找到與靶點(diǎn)特異性結(jié)合的核酸或肽段序列.相比抗體 ,適體技術(shù)可以高效、大規(guī)模篩選和生產(chǎn)特異靶點(diǎn)序列 ,且這些分子更容易進(jìn)入細(xì)胞 ,藥效更穩(wěn)定持久.該技術(shù)已被應(yīng)用于新型抑菌藥物的開發(fā)、特異配體序列的尋找以及生物大分子結(jié)構(gòu)與功能研究等多個(gè)領(lǐng)域[41].例如 ,Li et al[42]設(shè)計(jì)了與致病大腸桿菌K88 pili特異結(jié)合的DNA適配體 ,使病原菌鞭毛蛋白無(wú)法結(jié)合到宿主表面的受體 ,進(jìn)而不能入侵宿主 ,并且已經(jīng)在體外取得顯著效果.此外 ,陳伶利等[43]利用適配體技術(shù)篩選出23個(gè)與TolC特異結(jié)合的DNA序列 ,可作為外排泵的抑制劑.

3.3 新型抑菌策略

根據(jù)外膜蛋白是多種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出通道的特性 ,可將抗生素與細(xì)菌生存必需物質(zhì)偶聯(lián) ,“騙”過(guò)外膜屏障到達(dá)細(xì)胞內(nèi) ,從而增加胞內(nèi)抗生素濃度 ,該新型抑菌策略稱為“特洛伊木馬”策略.例如 ,鐵離子是細(xì)菌生命活動(dòng)必需的金屬元素 ,革蘭氏陰性細(xì)菌只能靠從外界環(huán)境攝取可以螯合鐵離子的鐵載體 ,并通過(guò)外膜蛋白特異通道運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi).含鐵蛋白缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡 ,細(xì)菌很難進(jìn)化出阻擋該類物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)的機(jī)制.事實(shí)上 ,這種方法早已在自然界中存在 ,一些細(xì)菌可以分泌與鐵離子螯合物共價(jià)結(jié)合的抗生素 ,通過(guò)特異外膜蛋白通道進(jìn)入胞內(nèi)從而起到殺菌作用 ,如白霉素等[44].根據(jù)此原理 ,科研人員將抗生素或納米殺菌材料與鐵載體人工偶聯(lián)在一起 ,研發(fā)出高效新型抗生素 ,這將是今后該領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方向[45].

4 總結(jié)與展望

綜上所述 ,由于全球細(xì)菌耐藥的形勢(shì)日益嚴(yán)峻 ,了解細(xì)菌耐藥與調(diào)控新機(jī)制 ,設(shè)計(jì)藥物新靶點(diǎn)和抑菌新策略 ,已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題.現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn) ,革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜蛋白具有重要的耐藥功能.外膜蛋白可以通過(guò)控制外膜通道孔徑大小限制抗生素進(jìn)入細(xì)胞 ,還可以通過(guò)單體或復(fù)合物的方式形成外排系統(tǒng)將已進(jìn)入胞內(nèi)的抗生素泵出細(xì)胞外 ,前者的典型代表為OmpC和OmpF家族 ,后者有TolC家族及其復(fù)合物TolC-AcrAB.但是 ,很多外膜蛋白的耐藥功能及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.目前 ,通過(guò)高通量的組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了更多的耐藥相關(guān)差異蛋白及其調(diào)控機(jī)制 ,但這些蛋白是否具有耐藥功能 ,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.因此 ,分子生物學(xué)技術(shù)與多“組學(xué)”方法結(jié)合 ,特別是代謝組學(xué)的發(fā)展 ,將是今后細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的重要方向.此外 ,外膜蛋白介導(dǎo)的其他耐藥新機(jī)制以及耐藥導(dǎo)致外膜蛋白形成差異表達(dá)平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn) ,使有關(guān)細(xì)菌耐藥的內(nèi)在機(jī)理更加清晰 ,這揭示今后的耐藥治療更傾向于多種藥物的協(xié)同作用[46].

現(xiàn)有的外膜蛋白耐藥理論知識(shí) ,為新型抗耐藥菌藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ).目前已研發(fā)出各種抑制耐藥外排系統(tǒng)和增加外膜通透性的藥物；但是 ,該領(lǐng)域的研究還面臨諸多問(wèn)題 ,如藥物的理化性質(zhì)、溶解性、特異性 ,特別是對(duì)哺乳細(xì)胞的毒性問(wèn)題 ,都未得到很好的解決 ,因此多數(shù)藥物仍然處于科學(xué)研究階段 ,無(wú)法用于臨床[47].總之 ,細(xì)菌耐藥過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程 ,細(xì)菌采取進(jìn)化突變的策略快速產(chǎn)生耐藥性 ,但還有很多耐藥機(jī)制和復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

An review on the antibiotics resistance function of outer membrane protein in gram-negative bacterial and related antimicrobial strategies

LI Wan-xin1 ,2,SUN Li-na1 ,2,LIN Xiang-min1 ,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring ,Fujian Agriculture and Forestry University；2.Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology in Universities of Fujian Province ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

The emergence of bacterial resistance to drug use has posed serious problem worldwide.Generally ,the drug resistance ca-pability of gram-negative bacteria is stronger than that of gram-positive ,which is partially attributed to the antibiotics resistance of the outer membrane proteins(OMPs).It is well known that the specific OMPs efflux antibiotics out or inhibits uptakes of antibiot-ics ,while the regulation mechanism remains uncertain.With the development of modern science and technology ,especially the ap-plication of structure biology ,molecular biology and proteomics ,many progressive studies have unveiled the mechanisms underlying the antibiotic resistance of OMPs.This review focuses on the recent advances in the structure and antibiotic resistance mechanisms of OMP ,which provides helpful insight into manufacture of new OMPs-targeting antimicrobial drug.

outer membrane protein；antibiotics resistance mechanism；efflux pump system；antimicrobial strategy

Q93-3

A

1671-5470(2015)06-0561-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.001

2015－03－20

2015－07－02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470238、31200105).

李碗芯(1990－) ,女 ,碩士.研究方向:分子生態(tài)學(xué).Email:liwx2012＠126.com.通訊作者林向民(1977－) ,男 ,教授 ,博士生導(dǎo)師.研究方向:微生物學(xué)、分子生態(tài)學(xué).Email:xiangmin＠fafu.edu.cn.