• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    產(chǎn)普魯蘭酶菌株ZXYG5的分離鑒定及其普魯蘭酶活性

    2015-07-24 16:15:53孫會(huì)忠王小東宋月芹朱金峰李廣良孫明輝侯小改
    關(guān)鍵詞:普魯蘭產(chǎn)酶煙草

    孫會(huì)忠,王小東,宋月芹,朱金峰,李廣良,孫明輝,侯小改

    (1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ,河南洛陽(yáng)471003;2.河南省煙草公司漯河市公司 ,河南漯河462000),

    產(chǎn)普魯蘭酶菌株ZXYG5的分離鑒定及其普魯蘭酶活性

    孫會(huì)忠1,王小東1,宋月芹1,朱金峰2,李廣良2,孫明輝2,侯小改1

    (1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ,河南洛陽(yáng)471003;2.河南省煙草公司漯河市公司 ,河南漯河462000),

    通過(guò)以支鏈淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基和以普魯蘭糖為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基復(fù)篩 ,從煙草甲(Lasioderma serri-corne)腸道中分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株 ,編號(hào)為ZXYG5.該菌株在以普魯蘭糖為碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基35℃、160 r?min-1條件下發(fā)酵42 h時(shí) ,普魯蘭酶活性達(dá)到最大值4.2 U?mL-1.通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡的形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA保守序列分析 ,將菌株ZXYG5初步鑒定為泛菌屬Pantoea sp. ,命名為Pantoea sp.ZXYG5.該菌株具有較高的初始產(chǎn)普魯蘭酶活性 ,可作為常規(guī)誘變育種和全基因組育種的良好備選菌株.

    普魯蘭酶;腸道細(xì)菌;分離;16S rDNA;酶活性

    淀粉酶主要分為4大類 ,分別是α-淀粉酶(α-amylase ,EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(β-amylase ,EC3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase ,EC3.2.1.3)和脫支酶(isoamylase ,EC3.2.1.9).普魯蘭酶(pullulanase ,EC3.2. 1.41)屬于脫支酶范疇 ,它只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1 ,6糖苷鍵 ,使支鏈淀粉脫支形成長(zhǎng)短不一的直鏈淀粉[1].自然界的淀粉大多含有80%的支鏈淀粉[2],所以 ,普魯蘭酶是淀粉高效利用不可缺少的關(guān)鍵酶 ,是微生物功能酶研究的熱點(diǎn)之一[3-5].但不同來(lái)源的普魯蘭酶對(duì)底物的作用專一性不同 ,因此 ,普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選分離工作一直在進(jìn)行.截至目前 ,除了丹麥NOVO公司成功研發(fā)的由酸性普魯蘭芽孢桿菌生產(chǎn)的普魯蘭酶外[6],文獻(xiàn)報(bào)道的絕大多數(shù)野生菌株活性普遍較低 ,即使是通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌株[7-9],也遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到理想的發(fā)酵產(chǎn)酶效果.所以 ,篩選分離發(fā)酵產(chǎn)酶活性較高的產(chǎn)普魯蘭酶菌株仍然是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的工作.

    資料顯示 ,動(dòng)物腸道菌在發(fā)酵產(chǎn)酶方面往往更具優(yōu)勢(shì) ,而且在產(chǎn)酶活性、生物安全等方面也更容易得到保障[10].昆蟲(chóng)是一個(gè)種類多、數(shù)量龐大的生物群體 ,從其腸道中分離各類有益菌也逐漸得到重視[11 ,12].煙草甲(Lasioderma serricorne)是一種隸屬竊蠹科(Anobiidae)的世界性昆蟲(chóng)[13],該蟲(chóng)具有取食廣泛、生存能力強(qiáng)的特點(diǎn) ,主要以幼蟲(chóng)蛀食貯存期煙葉、糧粒、藥材等農(nóng)資而完成生活史發(fā)育.迄今為止 ,關(guān)于煙草甲內(nèi)生細(xì)菌來(lái)源的產(chǎn)普魯蘭酶菌株分離鑒定方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.基于以上背景 ,本文擬以煙草甲為試驗(yàn)材料 ,分離鑒定產(chǎn)普魯蘭酶菌株 ,旨在豐富高效產(chǎn)普魯蘭酶菌株生物資源庫(kù).

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    煙草甲:采自河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院煙草研究室烤煙倉(cāng)儲(chǔ)室.

    固體分離培養(yǎng)基:蛋白胨8 g?L-1,酵母提取物6 g?L-1,支鏈淀粉3 g?L-1,NaCl 5 g?L-1,瓊脂粉18 g?L-1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

    鑒別培養(yǎng)基:蛋白胨6 g?L-1,酵母提取物4 g?L-1,NaCl 5 ,普魯蘭糖2 g?L-1,瓊脂粉18 g?L-1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

    LB種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g?L-1,酵母粉5 g?L-1,NaCl 5 g?L-1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

    產(chǎn)酶培養(yǎng)基:普魯蘭糖3 g?L-1,酵母粉10 g?L-1,KH2PO40.5 g?L-1,K2HPO40.5 g?L-1,FeSO40.01 g?L-1,MgSO47H2O 0.5 g?L-1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選 從倉(cāng)儲(chǔ)烤煙上挑取8頭4齡健康煙甲蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng) ,先饑餓24 h ,用無(wú)菌水沖洗 ,然后用滅菌細(xì)線將分別口器和肛門(mén)兩端綁扎.接著用75%乙醇進(jìn)行體表浸泡消毒3 min ,再用0.1 mol?L-1升汞消毒3 min ,在超凈工作臺(tái)中將消毒后的蟲(chóng)體固定于蠟盤(pán)解剖 ,取腸道 ,并劃破 ,用無(wú)菌水沖洗內(nèi)容物 ,收集于滅菌離心管.加入0.5 mL無(wú)菌水稀釋后 ,分別取20 μL、50 μL、80 μL不同體積稀釋液涂布于固體分離培養(yǎng)基 ,恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后 ,選取典型菌落連續(xù)進(jìn)行3次平板劃線純化 ,并將純化菌種斜面4℃保存.

    通過(guò)固體分離培養(yǎng)基初篩后 ,將初篩菌株轉(zhuǎn)接于普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基.30℃恒溫培養(yǎng)48 h ,滴加盧氏碘液 ,將具有水解圈者初步確定為具有普魯蘭酶活性菌株.

    1.2.2 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的產(chǎn)酶活性測(cè)定 粗酶液制備:將具有水解圈菌株接種到裝有50 mL LB種子培養(yǎng)基的三角瓶中 ,35℃、160 r?min-1搖床培養(yǎng)16 h ,然后取6 mL轉(zhuǎn)接于裝有75 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中 ,相同條件下?lián)u床培養(yǎng)58 h ,期間每隔4 h取樣1次 ,發(fā)酵上清液即為粗酶液.

    采用DNS法對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活性測(cè)定[14].

    1.2.3 菌株的鑒定 應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察[15];生理生化指標(biāo)測(cè)定方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行[16 ,17].菌株的16S rDNA分析:將ZXYG5菌株接種于LB液體培養(yǎng)基 ,37℃ ,200 r? min-1搖床培養(yǎng)12 h ,獲取菌液.采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver.2.0試劑盒提取ZXYG5基因組DNA.

    16S rDNA PCR擴(kuò)增引物為:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ,反向引物:1492R:5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR擴(kuò)增體系(20 μL):10×Ex Taq PCR buffer 2 μL ,dNTP(10 mmol? mL-1)1.6 μL ,正、反向引物(20 μm?mL-1)各1 μL ,DNA模板1 μL ,Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL ,雙蒸水13.2 μL.擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s ,50℃退火45 s ,72℃延伸1 min 40 s ,循環(huán)30次;72℃最終延伸10 min.目的片段長(zhǎng)度為1.5 kb左右 ,PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳 ,目的條帶采用TaKa-Ra MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0進(jìn)行膠回收 ,回收產(chǎn)物與TaKaRa pMDTM18-T Vecter連接 ,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞 ,37℃培養(yǎng)過(guò)夜 ,經(jīng)藍(lán)白斑篩選 ,挑選陽(yáng)性克隆搖菌 ,測(cè)序由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成.

    將測(cè)序獲得的ZXYG5的16S rDNA堿基序列提交NCBI進(jìn)行相似性比對(duì) ,并采用MEGA 6.06軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).菌株鑒定按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[18 ,19].

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離

    通過(guò)固體分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng) ,獲得一株水解圈大而顯著的菌株 ,編號(hào)為ZXYG5;將初篩菌株ZXYG5再通過(guò)普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng) ,進(jìn)一步明確該菌株具有較高的普魯蘭糖降解活性(圖1) ,故將ZXYG5確定為目標(biāo)菌株.

    2.2 菌株ZXYG5的產(chǎn)普魯蘭酶活性測(cè)定

    對(duì)ZXYG5菌株采用DNS法進(jìn)行普魯蘭酶活性測(cè)定 ,結(jié)果顯示 ,在ZXYG5菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶歷程中 ,發(fā)酵42 h時(shí) ,普魯蘭酶活性達(dá)到最高4.2 U?mL-1,說(shuō)明該菌株具有較高的產(chǎn)普魯蘭酶活性(圖2).與同類文獻(xiàn)資料相比 ,無(wú)論從產(chǎn)普魯蘭酶活性和發(fā)酵周期來(lái)看 ,ZXYG5菌株都具有一定的優(yōu)勢(shì) ,是下游研究良好的備選菌株 ,具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力.

    圖1 ZXYG5在普魯蘭糖平板上的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain ZXYG5 in pullulan plate

    圖2 ZXYG5菌株的普魯蘭酶活性Fig.2 Enzyme production of strain ZXYG5

    2.3 菌株ZXYG5的鑒定

    2.3.1 菌株ZXYG5的形態(tài)特征 ZXYG5菌株為桿型細(xì)菌 ,大小(0.5-1.6)μm×(0.8-2.5)μm ,無(wú)莢膜 ,能運(yùn)動(dòng).在LB平板上35℃培養(yǎng)48 h ,菌落近圓形 ,邊緣不整齊 ,直徑2-3 mm ,表面光滑 ,扁平 ,有黃色素產(chǎn)生(圖3A ,B).掃描電鏡下放大到60 000倍時(shí) ,可見(jiàn)菌體的兩端鈍圓 ,具周生鞭毛(圖3C).

    圖3 ZXYG5菌株的形態(tài)特征Fig.3 General characteristics of strain ZXYG5 colony

    2.3.2 ZXYG5菌株的生理生化鑒定 ZXYG5菌株的生理生化測(cè)定結(jié)果表明 ,結(jié)果與文獻(xiàn)[18]和[19]中泛菌屬(Pantoea)的描述基本一致(表1).

    表1 ZXYG5菌株的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果1)Table 1 Physiological and biochemical indexes of strain ZXYG5

    2.3.3 菌株ZXYG5的16S rDNA分析 通過(guò)測(cè)序 ,獲得ZXYG5菌株的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1501 bp ,序列號(hào)為KR362557.將基因序列提交NCBI(美國(guó)國(guó)家科技情報(bào)研究中心)的BLAST進(jìn)行在線相似性比對(duì) ,并選取相似度高的序列構(gòu)建ZXYG5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4).結(jié)果顯示 ,ZXYG5與腸桿菌科(Enter-obacteriaceae)泛菌屬(Pantoea)的Pantoea sp.GYPB18(JF346891)等聚為同一分支 ,且它們相似度達(dá)到83% ,說(shuō)明它們遺傳進(jìn)化關(guān)系最近 ,再綜合形態(tài)特征、生理生化特性 ,初步將菌株ZXYG5鑒定為泛菌Pan-toea sp. ,命名為Pantoea sp.ZXYG5.

    圖4 基于16S rDNA基因序列的ZXYG5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of ZXYG5

    3 討論

    文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)普魯蘭酶微生物資源主要類群有:海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoactinomyces ethanolicus)、Bacillus flavocaldarius、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.Stearothermophilus)、多形擬桿菌(B.Thetaiotaomicron)、克雷伯肺炎菌(Kiebsiella.Pneumoniae)、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor sac-charolyticus)、嗜熱厭氧閃光桿菌(Fervidobacterium pennavorans)等[1 ,3 ,4],但真正用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株卻極少.原因主要有兩個(gè) ,一個(gè)是相當(dāng)一部分產(chǎn)酶菌株是從土壤中分離獲得 ,而許多土著野生菌株并不適合發(fā)酵產(chǎn)酶;二是很多菌株產(chǎn)酶活性大幅度提高的潛力有限 ,即使是通過(guò)基因操作構(gòu)建了表達(dá)工程菌 ,也往往達(dá)不到理想的發(fā)酵產(chǎn)酶效果.隨著交叉學(xué)科的不斷深入發(fā)展 ,人們已逐漸將篩選分離產(chǎn)普魯蘭酶菌株的范圍拓展到新的領(lǐng)域 ,如動(dòng)物內(nèi)生菌、植物內(nèi)生菌、極端環(huán)境、深海環(huán)境等 ,并已初見(jiàn)成效[2-4 ,7-8].郭宏文等[20]研究表明 ,產(chǎn)普魯蘭酶菌株P(guān)UG12的初始產(chǎn)酶活性為0.64 U?mL-1,發(fā)酵條件優(yōu)化后經(jīng)64 h發(fā)酵 ,酶活性達(dá)到2.45 U?mL-1;馬曉軍等[21]篩選出一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株Bacillus sp.SX-12 ,初始酶活性為2.42 U?mL-1,經(jīng)紫外線誘變后 ,經(jīng)48 h發(fā)酵培養(yǎng)酶活性提高到6.87 U?mL-1.本研究從煙草甲腸道分離出的菌株ZXYG5在未優(yōu)化發(fā)酵條件和誘變育種的情況下 ,菌株最高產(chǎn)普魯蘭酶酶活性就達(dá)到了4.2 U?mL-1,與部分同類文獻(xiàn)相比 ,產(chǎn)酶活性和發(fā)酵周期均具有一定優(yōu)勢(shì).另外 ,來(lái)源于動(dòng)物內(nèi)生性的產(chǎn)功能酶菌株 ,在酶活性的生物安全方面更容易得到保障[10],開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力更大 ,普魯蘭酶在食品、飼料領(lǐng)域使用廣泛 ,所以ZXYG5具有較大的開(kāi)發(fā)前景;從ZXYG5菌株多項(xiàng)分類鑒定結(jié)果的歸屬來(lái)看 ,還未見(jiàn)有泛菌屬產(chǎn)普魯蘭酶菌株的報(bào)道 ,因此 ,ZXYG5菌株的分離、鑒定及產(chǎn)酶活性的確定 ,豐富了產(chǎn)普魯蘭酶菌株誘變育種和全基因組育種的遺傳資源.

    [1]袁振宏.能源微生物學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社 ,2012:69-76.

    [2]孫劭靖 ,路福平 ,姜楠 ,等.一株耐熱普魯蘭酶菌株Anoxybacillus sp.LM14-2分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通報(bào) ,2011(9):136-140.

    [3]焦豫良 ,王淑軍 ,呂明生.GH57家族高溫淀粉普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與功能分析[J].微生物學(xué)報(bào) ,2011 ,51(1):447-454.

    [4]喬宇 ,丁宏標(biāo) ,王海燕.普魯蘭酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展 ,2011 ,1(3):189-194.

    [5]SUZUKI Y ,HATAGAKI K ,ODA H.A hyperthermostable pullulanase produced by an extreme thermophile ,Bacillus flavocal-darius KP 1228 ,and evidence for the proline theory of increasing protein thermostability[J].Appl Microbiol.Biotechnol ,1991 (34):707-714.

    [6]郭宏文 ,江成英 ,冮潔 ,等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選[J].科學(xué)研究 ,2008 ,29(9):52-55.

    [7]KANG J ,PARK K M ,CHOI K H ,et al.Molecular cloning and biochemical characterization of a heat stable typeⅠpullula-nase from Thermotoga neapolitan[J].Enzyme Microb Technol ,2011 ,48(3):260-266.

    [8]LI Y R ,ZHANG L ,NIU D D ,et al.Cloning ,expression ,characterization ,and biocatalytic investigation of a novel Bacilli thermostable typeⅠpullulanase from Bacillus sp.CICIM 263[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2012 ,60(44): 11164-11172.

    [9]RüDIGER A ,JORGENSEN P L ,Antranikian G.Isolation and characterization of a heat-stable pullulanase from the hyperther-mophilic archaeon Pyrococcus woesei after cloning and expression of its gene in Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol ,1995 ,61(2):567-575.

    [10]徐麗華 ,婁愷 ,張華 ,等.微生物資源學(xué)(第二版)[M].北京:科學(xué)出版社 ,2010:243-249.

    [11]王在貴 ,楊文靜 ,劉朝良 ,等.家蠶腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的分離與鑒定及其發(fā)酵條件[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) ,2011 ,19(1): 149-156.

    [12]王保軍 ,劉纓 ,姜嘉 ,等.蝎子腸道內(nèi)微生物多樣性研究[J].微生物學(xué)報(bào) ,2007 ,47(5):888-893.

    [13]袁鋒 ,張雅林 ,馮紀(jì)年 ,等.昆蟲(chóng)分類學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 ,2006:360-361.

    [14]魏丙卓 ,孫杰.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究[J].武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào) ,2008 ,4(8):174-177.

    [15]謝家儀 ,董光軍 ,劉振英.掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J].電子顯微學(xué)報(bào) ,2005 ,24(4):440-440.

    [16]劉國(guó)生.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社 ,2007:141-155.

    [17]黃亞?wèn)| ,時(shí)小燕.微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社 ,2013:67-80 ,198-216.

    [18]陶天申 ,楊瑞馥 ,東秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社 ,2007:313-322.

    [19]陳瑜.臨床常見(jiàn)細(xì)菌、真菌鑒定手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社 ,2009:62-70.

    [20]郭宏文 ,江成英 ,冮潔 ,等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選[J].食品研究與開(kāi)發(fā) ,2008 ,29(9):52-55.

    [21]馬曉軍 ,張曉君 ,王銳 ,等.堿性普魯蘭酶產(chǎn)生菌選育和發(fā)酵條件的研究[J].西北植物學(xué)報(bào) ,2002 ,22(4):883-888.

    (責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

    Isolation ,identification and enzyme activity of pullulanase-producing strain ZXYG5

    SUN Hui-zhong1,WANG Xiao-dong1,SONG Yue-qin1,ZHU Jin-feng2,LI Guang-liang2,SUN Ming-hui2,HOU Xiao-gai1
    (1.College of Agriculture ,Henan University of Science and Technology ,Luoyang ,Henan 471003 ,China;2.Henan Tobacco Companies Luohe branch ,Luohe ,Henan 462000 ,China)

    After being inoculated with amylopectin and pullulan as sole carbon source successively ,strain ZXYG5 with potential of pullulanase production was isolated from gut of tobacco beetle(Lasioderma serricorne).The optimal fermentation condition was 35℃ ,160 r?min-1and 42 h with maximum pullulan yield of 4.2 U?mL-1.Subsequent standard morphological observation ,physio-logical and biochemical property analysis ,and 16S rDNA sequencing test indicated strain ZXYG5 was Pantoea sp. ,and was named Pantoea sp.ZXYG5.Strain ZXYG5 with satisfactory initial pullulanase activity can be used as a good alternative to conventional mu-tation and genome breeding.

    pullulanase;gut bacteria;isolation;16S rDNA;enzyme activity

    Q939.9

    A

    1671-5470(2015)06-0629-05

    10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.012

    20150-02-25

    2015-05-12

    河南省煙草公司科學(xué)研究與技術(shù)項(xiàng)目(HYKJ2012M04、HYKJ201302);河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(4024-13480045、4026-13480047);上海煙草集團(tuán)責(zé)任有限公司項(xiàng)目(SZBCW2014-00830).

    孫會(huì)忠(1976-) ,男 ,副教授 ,博士.研究方向:生物資源學(xué).Email:huizhong66@163.com.通訊作者王小東(1978-) ,男 ,副教授 ,博士.研究方向:煙草學(xué).Email:lylhsys@126.com.

    猜你喜歡
    普魯蘭產(chǎn)酶煙草
    煙草具有輻射性?
    普魯蘭糖生物合成和分子量調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展
    食品與藥品(2020年1期)2020-03-10 03:25:00
    煙草依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)
    纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化探討
    煙草中茄酮的富集和應(yīng)用
    一株降解β-胡蘿卜素細(xì)菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化
    南大西洋熱液區(qū)沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析和產(chǎn)酶活性鑒定
    響應(yīng)面法優(yōu)化出芽短梗霉利用木糖產(chǎn)普魯蘭糖發(fā)酵培養(yǎng)基
    煙草鏡頭與歷史真實(shí)
    聲屏世界(2014年6期)2014-02-28 15:18:09
    普魯蘭酶酶法制備玉米抗性淀粉工藝優(yōu)化
    建设人人有责人人尽责人人享有的 | 伦理电影大哥的女人| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品久久久久久久久av| 国产精品久久视频播放| 亚洲国产精品国产精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲综合色惰| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲国产成人一精品久久久| www.av在线官网国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲av免费在线观看| 欧美成人a在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产高清三级在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| eeuss影院久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲四区av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 18+在线观看网站| 天堂中文最新版在线下载 | 99久久中文字幕三级久久日本| 一夜夜www| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产色爽女视频免费观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品一区二区性色av| 又大又黄又爽视频免费| 69人妻影院| 国产亚洲一区二区精品| 欧美高清成人免费视频www| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产精品专区欧美| 天天躁日日操中文字幕| 极品教师在线视频| 99久久九九国产精品国产免费| 免费看a级黄色片| 久久精品综合一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 成人综合一区亚洲| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产在视频线精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人亚洲精品一区在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 久久精品人妻少妇| 亚洲av一区综合| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲性久久影院| 日韩人妻高清精品专区| 床上黄色一级片| 男插女下体视频免费在线播放| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 九草在线视频观看| 少妇丰满av| 69人妻影院| 国产v大片淫在线免费观看| 人妻一区二区av| 神马国产精品三级电影在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美精品一区二区大全| 激情 狠狠 欧美| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美日本视频| 在线观看一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 欧美潮喷喷水| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 又爽又黄无遮挡网站| 91狼人影院| 精品人妻视频免费看| av在线天堂中文字幕| 美女高潮的动态| 亚洲,欧美,日韩| 免费高清在线观看视频在线观看| 日本免费a在线| 亚洲成人一二三区av| 欧美人与善性xxx| av国产免费在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品自拍成人| 国产综合精华液| 国产v大片淫在线免费观看| 99久久九九国产精品国产免费| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久97久久精品| 国产精品一二三区在线看| 国内精品宾馆在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 白带黄色成豆腐渣| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 特级一级黄色大片| 国产真实伦视频高清在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品99久久久久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产乱人偷精品视频| 九九在线视频观看精品| or卡值多少钱| 直男gayav资源| 99视频精品全部免费 在线| 国产一区二区三区av在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产乱来视频区| 免费观看精品视频网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产69精品久久久久777片| 亚洲最大成人中文| 日韩中字成人| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 美女国产视频在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本三级黄在线观看| 插逼视频在线观看| 深夜a级毛片| 综合色av麻豆| 99久久人妻综合| 亚洲最大成人中文| 久久这里只有精品中国| 乱系列少妇在线播放| 99热这里只有是精品50| 精品一区二区三区人妻视频| 成人特级av手机在线观看| 久久久久精品性色| 午夜视频国产福利| 日韩精品青青久久久久久| 青青草视频在线视频观看| 午夜激情福利司机影院| 中文资源天堂在线| 美女大奶头视频| 成人漫画全彩无遮挡| 91精品国产九色| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 精品一区在线观看国产| 青春草国产在线视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久久末码| 日本一本二区三区精品| 精品一区二区三区人妻视频| 国产视频首页在线观看| 国产在视频线精品| 免费av观看视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品女同一区二区软件| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产老妇女一区| 国产成人福利小说| 人妻少妇偷人精品九色| 少妇的逼水好多| 一区二区三区高清视频在线| 国国产精品蜜臀av免费| 国产成人aa在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美精品专区久久| 舔av片在线| 熟女人妻精品中文字幕| 97超碰精品成人国产| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 99久国产av精品| 人妻一区二区av| 国产av在哪里看| 久久久精品欧美日韩精品| 精品人妻熟女av久视频| 尾随美女入室| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 赤兔流量卡办理| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲国产欧美人成| 乱系列少妇在线播放| 成人综合一区亚洲| av在线蜜桃| 一级片'在线观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 禁无遮挡网站| 国产一区有黄有色的免费视频 | 日日撸夜夜添| 禁无遮挡网站| 久久久精品免费免费高清| 日本免费在线观看一区| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品国产av蜜桃| 看十八女毛片水多多多| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看无遮挡的男女| av黄色大香蕉| av.在线天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美成人a在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜日本视频在线| 乱人视频在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 日本免费a在线| 男人狂女人下面高潮的视频| av在线蜜桃| 亚洲国产欧美人成| 免费黄色在线免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久韩国三级中文字幕| 内地一区二区视频在线| ponron亚洲| 六月丁香七月| 欧美高清成人免费视频www| 日韩欧美精品v在线| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精品一区二区性色av| 成人特级av手机在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 人妻一区二区av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一本一本综合久久| 中文字幕久久专区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av一区综合| 午夜精品国产一区二区电影 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国内精品宾馆在线| 成人一区二区视频在线观看| 中文天堂在线官网| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲综合色惰| 日韩一区二区三区影片| 1000部很黄的大片| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品一区蜜桃| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人国产麻豆网| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲精品久久久com| 伊人久久精品亚洲午夜| 草草在线视频免费看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久久久久久久大av| 欧美成人a在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品人妻少妇| 久久韩国三级中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲美女视频黄频| 水蜜桃什么品种好| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一级毛片久久久久久久久女| 日日啪夜夜爽| 成人毛片60女人毛片免费| 精品久久久久久久末码| 赤兔流量卡办理| 91av网一区二区| 一区二区三区免费毛片| av专区在线播放| 亚洲av男天堂| 又爽又黄无遮挡网站| 成年版毛片免费区| 久久久久久国产a免费观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久国产一区二区| 国产亚洲一区二区精品| 在线a可以看的网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 中文天堂在线官网| 六月丁香七月| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av福利一区| 午夜激情欧美在线| 国产男女超爽视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 天堂影院成人在线观看| 国产精品无大码| 国产精品久久视频播放| 午夜视频国产福利| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久网色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美性感艳星| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产精品sss在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 少妇人妻精品综合一区二区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av在线天堂中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩欧美精品v在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线观看一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 国产极品天堂在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 免费少妇av软件| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产亚洲最大av| 青春草视频在线免费观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久午夜福利片| 亚洲av成人精品一区久久| 日日啪夜夜撸| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线播放无遮挡| 色综合站精品国产| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久6这里有精品| 亚洲三级黄色毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 国内精品宾馆在线| 一个人看视频在线观看www免费| 亚州av有码| 超碰97精品在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲18禁久久av| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜日本视频在线| 国内精品宾馆在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费观看a级毛片全部| 亚洲最大成人手机在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲精品国产成人久久av| 赤兔流量卡办理| 日韩制服骚丝袜av| 美女高潮的动态| 亚洲电影在线观看av| 日本免费a在线| kizo精华| 亚洲av成人av| av线在线观看网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区三区av在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美+日韩+精品| 国产男人的电影天堂91| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品人妻熟女av久视频| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品久久久噜噜| 免费观看a级毛片全部| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲av国产av综合av卡| 婷婷色综合www| 特级一级黄色大片| 国产免费视频播放在线视频 | 五月玫瑰六月丁香| 国产单亲对白刺激| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 三级经典国产精品| 久久精品综合一区二区三区| 免费少妇av软件| 高清av免费在线| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产精品sss在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久久精品性色| 在线天堂最新版资源| 午夜亚洲福利在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产乱来视频区| 国产精品.久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久久中文| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产美女午夜福利| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产成人freesex在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 在线免费观看的www视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av不卡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久久欧美国产精品| 亚洲av男天堂| 99热这里只有是精品50| 久久99热这里只有精品18| 国产色爽女视频免费观看| 草草在线视频免费看| 丝袜喷水一区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品国产av蜜桃| 99热网站在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 只有这里有精品99| 国产单亲对白刺激| 国产av在哪里看| 亚洲国产色片| 免费观看在线日韩| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲成色77777| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品不卡视频一区二区| 一级片'在线观看视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 国产91av在线免费观看| 午夜福利在线在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 永久网站在线| 国产在视频线精品| 午夜日本视频在线| 国产美女午夜福利| 成人毛片60女人毛片免费| 高清欧美精品videossex| 黄色一级大片看看| 国产视频首页在线观看| 国产淫语在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 在线观看人妻少妇| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久精品性色| 亚洲欧美精品专区久久| 久久精品夜色国产| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩av不卡免费在线播放| 在线 av 中文字幕| 我的老师免费观看完整版| 久久午夜福利片| 两个人的视频大全免费| 一区二区三区乱码不卡18| 黄色一级大片看看| 欧美激情在线99| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色播亚洲综合网| 亚洲,欧美,日韩| 久久久精品94久久精品| 精品久久久噜噜| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产色婷婷99| 最近最新中文字幕免费大全7| av线在线观看网站| 精品国产三级普通话版| 亚洲人成网站高清观看| 色吧在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 一级毛片 在线播放| 久久这里有精品视频免费| av又黄又爽大尺度在线免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲综合色惰| 秋霞伦理黄片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美另类一区| 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇的逼好多水| 亚洲在线观看片| 激情 狠狠 欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色播亚洲综合网| 欧美不卡视频在线免费观看| av在线播放精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久久九九精品影院| 国产精品久久久久久久电影| 午夜免费激情av| 国产精品一区二区在线观看99 | 一级黄片播放器| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩精品有码人妻一区| 91精品国产九色| 精品午夜福利在线看| 国产成人精品一,二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美+日韩+精品| 国产高清有码在线观看视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 视频中文字幕在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 日韩欧美 国产精品| 久久久久网色| 久久国产乱子免费精品| 国产精品蜜桃在线观看| 精品国产三级普通话版| 成年av动漫网址| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕制服av| 久久这里只有精品中国| 久久精品夜色国产| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级av片app| 久久国产乱子免费精品| 又爽又黄无遮挡网站| 久久久午夜欧美精品| 国产亚洲一区二区精品| 91aial.com中文字幕在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲国产欧美在线一区| 观看免费一级毛片| 久久久久久伊人网av| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99热这里只有精品一区| 一级毛片 在线播放| 97超碰精品成人国产| 免费看美女性在线毛片视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲人成网站在线观看播放| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲经典国产精华液单| 最后的刺客免费高清国语| 国内精品美女久久久久久| 成年免费大片在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品伦人一区二区| 欧美精品国产亚洲| 人人妻人人看人人澡| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中文资源天堂在线| 一区二区三区四区激情视频| 国产高潮美女av| 国产成人aa在线观看| 久久久午夜欧美精品| 国产中年淑女户外野战色| 深夜a级毛片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 青青草视频在线视频观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 麻豆成人午夜福利视频| 国产av在哪里看| 国产成人精品一,二区| 丰满乱子伦码专区| 91狼人影院| 99久国产av精品国产电影| 国产永久视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网 | 视频中文字幕在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 男人舔奶头视频| 国产乱来视频区| 美女大奶头视频| 欧美潮喷喷水| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 大香蕉久久网| 六月丁香七月| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美日本视频| 成人午夜高清在线视频| av天堂中文字幕网| 日本黄色片子视频| 少妇丰满av| 日日啪夜夜爽| 69人妻影院| 高清午夜精品一区二区三区| 免费看日本二区| 日韩制服骚丝袜av| 不卡视频在线观看欧美|