產(chǎn)普魯蘭酶菌株ZXYG5的分離鑒定及其普魯蘭酶活性

孫會(huì)忠,王小東,宋月芹,朱金峰,李廣良,孫明輝,侯小改

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ,河南洛陽(yáng)471003；2.河南省煙草公司漯河市公司 ,河南漯河462000),

產(chǎn)普魯蘭酶菌株ZXYG5的分離鑒定及其普魯蘭酶活性

孫會(huì)忠1,王小東1,宋月芹1,朱金峰2,李廣良2,孫明輝2,侯小改1

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ,河南洛陽(yáng)471003；2.河南省煙草公司漯河市公司 ,河南漯河462000),

通過(guò)以支鏈淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基和以普魯蘭糖為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基復(fù)篩 ,從煙草甲(Lasioderma serri-corne)腸道中分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株 ,編號(hào)為ZXYG5.該菌株在以普魯蘭糖為碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基35℃、160 r?min－1條件下發(fā)酵42 h時(shí) ,普魯蘭酶活性達(dá)到最大值4.2 U?mL－1.通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡的形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA保守序列分析 ,將菌株ZXYG5初步鑒定為泛菌屬Pantoea sp. ,命名為Pantoea sp.ZXYG5.該菌株具有較高的初始產(chǎn)普魯蘭酶活性 ,可作為常規(guī)誘變育種和全基因組育種的良好備選菌株.

普魯蘭酶；腸道細(xì)菌；分離；16S rDNA；酶活性

淀粉酶主要分為4大類 ,分別是α-淀粉酶(α-amylase ,EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(β-amylase ,EC3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase ,EC3.2.1.3)和脫支酶(isoamylase ,EC3.2.1.9).普魯蘭酶(pullulanase ,EC3.2. 1.41)屬于脫支酶范疇 ,它只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1 ,6糖苷鍵 ,使支鏈淀粉脫支形成長(zhǎng)短不一的直鏈淀粉[1].自然界的淀粉大多含有80%的支鏈淀粉[2],所以 ,普魯蘭酶是淀粉高效利用不可缺少的關(guān)鍵酶 ,是微生物功能酶研究的熱點(diǎn)之一[3－5].但不同來(lái)源的普魯蘭酶對(duì)底物的作用專一性不同 ,因此 ,普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選分離工作一直在進(jìn)行.截至目前 ,除了丹麥NOVO公司成功研發(fā)的由酸性普魯蘭芽孢桿菌生產(chǎn)的普魯蘭酶外[6],文獻(xiàn)報(bào)道的絕大多數(shù)野生菌株活性普遍較低 ,即使是通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌株[7－9],也遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到理想的發(fā)酵產(chǎn)酶效果.所以 ,篩選分離發(fā)酵產(chǎn)酶活性較高的產(chǎn)普魯蘭酶菌株仍然是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的工作.

資料顯示 ,動(dòng)物腸道菌在發(fā)酵產(chǎn)酶方面往往更具優(yōu)勢(shì) ,而且在產(chǎn)酶活性、生物安全等方面也更容易得到保障[10].昆蟲(chóng)是一個(gè)種類多、數(shù)量龐大的生物群體 ,從其腸道中分離各類有益菌也逐漸得到重視[11 ,12].煙草甲(Lasioderma serricorne)是一種隸屬竊蠹科(Anobiidae)的世界性昆蟲(chóng)[13],該蟲(chóng)具有取食廣泛、生存能力強(qiáng)的特點(diǎn) ,主要以幼蟲(chóng)蛀食貯存期煙葉、糧粒、藥材等農(nóng)資而完成生活史發(fā)育.迄今為止 ,關(guān)于煙草甲內(nèi)生細(xì)菌來(lái)源的產(chǎn)普魯蘭酶菌株分離鑒定方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.基于以上背景 ,本文擬以煙草甲為試驗(yàn)材料 ,分離鑒定產(chǎn)普魯蘭酶菌株 ,旨在豐富高效產(chǎn)普魯蘭酶菌株生物資源庫(kù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草甲:采自河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院煙草研究室烤煙倉(cāng)儲(chǔ)室.

固體分離培養(yǎng)基:蛋白胨8 g?L－1,酵母提取物6 g?L－1,支鏈淀粉3 g?L－1,NaCl 5 g?L－1,瓊脂粉18 g?L－1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

鑒別培養(yǎng)基:蛋白胨6 g?L－1,酵母提取物4 g?L－1,NaCl 5 ,普魯蘭糖2 g?L－1,瓊脂粉18 g?L－1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

LB種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g?L－1,酵母粉5 g?L－1,NaCl 5 g?L－1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

產(chǎn)酶培養(yǎng)基:普魯蘭糖3 g?L－1,酵母粉10 g?L－1,KH2PO40.5 g?L－1,K2HPO40.5 g?L－1,FeSO40.01 g?L－1,MgSO47H2O 0.5 g?L－1,蒸餾水定容 ,pH 7.0.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選 從倉(cāng)儲(chǔ)烤煙上挑取8頭4齡健康煙甲蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng) ,先饑餓24 h ,用無(wú)菌水沖洗 ,然后用滅菌細(xì)線將分別口器和肛門(mén)兩端綁扎.接著用75%乙醇進(jìn)行體表浸泡消毒3 min ,再用0.1 mol?L－1升汞消毒3 min ,在超凈工作臺(tái)中將消毒后的蟲(chóng)體固定于蠟盤(pán)解剖 ,取腸道 ,并劃破 ,用無(wú)菌水沖洗內(nèi)容物 ,收集于滅菌離心管.加入0.5 mL無(wú)菌水稀釋后 ,分別取20 μL、50 μL、80 μL不同體積稀釋液涂布于固體分離培養(yǎng)基 ,恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后 ,選取典型菌落連續(xù)進(jìn)行3次平板劃線純化 ,并將純化菌種斜面4℃保存.

通過(guò)固體分離培養(yǎng)基初篩后 ,將初篩菌株轉(zhuǎn)接于普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基.30℃恒溫培養(yǎng)48 h ,滴加盧氏碘液 ,將具有水解圈者初步確定為具有普魯蘭酶活性菌株.

1.2.2 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的產(chǎn)酶活性測(cè)定 粗酶液制備:將具有水解圈菌株接種到裝有50 mL LB種子培養(yǎng)基的三角瓶中 ,35℃、160 r?min－1搖床培養(yǎng)16 h ,然后取6 mL轉(zhuǎn)接于裝有75 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中 ,相同條件下?lián)u床培養(yǎng)58 h ,期間每隔4 h取樣1次 ,發(fā)酵上清液即為粗酶液.

采用DNS法對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活性測(cè)定[14].

1.2.3 菌株的鑒定 應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察[15]；生理生化指標(biāo)測(cè)定方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行[16 ,17].菌株的16S rDNA分析:將ZXYG5菌株接種于LB液體培養(yǎng)基 ,37℃ ,200 r? min－1搖床培養(yǎng)12 h ,獲取菌液.采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver.2.0試劑盒提取ZXYG5基因組DNA.

16S rDNA PCR擴(kuò)增引物為:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ,反向引物:1492R:5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR擴(kuò)增體系(20 μL):10×Ex Taq PCR buffer 2 μL ,dNTP(10 mmol? mL－1)1.6 μL ,正、反向引物(20 μm?mL－1)各1 μL ,DNA模板1 μL ,Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL ,雙蒸水13.2 μL.擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s ,50℃退火45 s ,72℃延伸1 min 40 s ,循環(huán)30次；72℃最終延伸10 min.目的片段長(zhǎng)度為1.5 kb左右 ,PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳 ,目的條帶采用TaKa-Ra MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0進(jìn)行膠回收 ,回收產(chǎn)物與TaKaRa pMDTM18-T Vecter連接 ,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞 ,37℃培養(yǎng)過(guò)夜 ,經(jīng)藍(lán)白斑篩選 ,挑選陽(yáng)性克隆搖菌 ,測(cè)序由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成.

將測(cè)序獲得的ZXYG5的16S rDNA堿基序列提交NCBI進(jìn)行相似性比對(duì) ,并采用MEGA 6.06軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).菌株鑒定按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[18 ,19].

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離

通過(guò)固體分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng) ,獲得一株水解圈大而顯著的菌株 ,編號(hào)為ZXYG5；將初篩菌株ZXYG5再通過(guò)普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng) ,進(jìn)一步明確該菌株具有較高的普魯蘭糖降解活性(圖1) ,故將ZXYG5確定為目標(biāo)菌株.

2.2 菌株ZXYG5的產(chǎn)普魯蘭酶活性測(cè)定

對(duì)ZXYG5菌株采用DNS法進(jìn)行普魯蘭酶活性測(cè)定 ,結(jié)果顯示 ,在ZXYG5菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶歷程中 ,發(fā)酵42 h時(shí) ,普魯蘭酶活性達(dá)到最高4.2 U?mL－1,說(shuō)明該菌株具有較高的產(chǎn)普魯蘭酶活性(圖2).與同類文獻(xiàn)資料相比 ,無(wú)論從產(chǎn)普魯蘭酶活性和發(fā)酵周期來(lái)看 ,ZXYG5菌株都具有一定的優(yōu)勢(shì) ,是下游研究良好的備選菌株 ,具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力.

圖1 ZXYG5在普魯蘭糖平板上的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain ZXYG5 in pullulan plate

圖2 ZXYG5菌株的普魯蘭酶活性Fig.2 Enzyme production of strain ZXYG5

2.3 菌株ZXYG5的鑒定

2.3.1 菌株ZXYG5的形態(tài)特征 ZXYG5菌株為桿型細(xì)菌 ,大小(0.5－1.6)μm×(0.8－2.5)μm ,無(wú)莢膜 ,能運(yùn)動(dòng).在LB平板上35℃培養(yǎng)48 h ,菌落近圓形 ,邊緣不整齊 ,直徑2－3 mm ,表面光滑 ,扁平 ,有黃色素產(chǎn)生(圖3A ,B).掃描電鏡下放大到60 000倍時(shí) ,可見(jiàn)菌體的兩端鈍圓 ,具周生鞭毛(圖3C).

圖3 ZXYG5菌株的形態(tài)特征Fig.3 General characteristics of strain ZXYG5 colony

2.3.2 ZXYG5菌株的生理生化鑒定 ZXYG5菌株的生理生化測(cè)定結(jié)果表明 ,結(jié)果與文獻(xiàn)[18]和[19]中泛菌屬(Pantoea)的描述基本一致(表1).

表1 ZXYG5菌株的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果1)Table 1 Physiological and biochemical indexes of strain ZXYG5

2.3.3 菌株ZXYG5的16S rDNA分析 通過(guò)測(cè)序 ,獲得ZXYG5菌株的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1501 bp ,序列號(hào)為KR362557.將基因序列提交NCBI(美國(guó)國(guó)家科技情報(bào)研究中心)的BLAST進(jìn)行在線相似性比對(duì) ,并選取相似度高的序列構(gòu)建ZXYG5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4).結(jié)果顯示 ,ZXYG5與腸桿菌科(Enter-obacteriaceae)泛菌屬(Pantoea)的Pantoea sp.GYPB18(JF346891)等聚為同一分支 ,且它們相似度達(dá)到83% ,說(shuō)明它們遺傳進(jìn)化關(guān)系最近 ,再綜合形態(tài)特征、生理生化特性 ,初步將菌株ZXYG5鑒定為泛菌Pan-toea sp. ,命名為Pantoea sp.ZXYG5.

圖4 基于16S rDNA基因序列的ZXYG5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of ZXYG5

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)普魯蘭酶微生物資源主要類群有:海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoactinomyces ethanolicus)、Bacillus flavocaldarius、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.Stearothermophilus)、多形擬桿菌(B.Thetaiotaomicron)、克雷伯肺炎菌(Kiebsiella.Pneumoniae)、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor sac-charolyticus)、嗜熱厭氧閃光桿菌(Fervidobacterium pennavorans)等[1 ,3 ,4],但真正用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株卻極少.原因主要有兩個(gè) ,一個(gè)是相當(dāng)一部分產(chǎn)酶菌株是從土壤中分離獲得 ,而許多土著野生菌株并不適合發(fā)酵產(chǎn)酶；二是很多菌株產(chǎn)酶活性大幅度提高的潛力有限 ,即使是通過(guò)基因操作構(gòu)建了表達(dá)工程菌 ,也往往達(dá)不到理想的發(fā)酵產(chǎn)酶效果.隨著交叉學(xué)科的不斷深入發(fā)展 ,人們已逐漸將篩選分離產(chǎn)普魯蘭酶菌株的范圍拓展到新的領(lǐng)域 ,如動(dòng)物內(nèi)生菌、植物內(nèi)生菌、極端環(huán)境、深海環(huán)境等 ,并已初見(jiàn)成效[2－4 ,7－8].郭宏文等[20]研究表明 ,產(chǎn)普魯蘭酶菌株P(guān)UG12的初始產(chǎn)酶活性為0.64 U?mL－1,發(fā)酵條件優(yōu)化后經(jīng)64 h發(fā)酵 ,酶活性達(dá)到2.45 U?mL－1；馬曉軍等[21]篩選出一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株Bacillus sp.SX-12 ,初始酶活性為2.42 U?mL－1,經(jīng)紫外線誘變后 ,經(jīng)48 h發(fā)酵培養(yǎng)酶活性提高到6.87 U?mL－1.本研究從煙草甲腸道分離出的菌株ZXYG5在未優(yōu)化發(fā)酵條件和誘變育種的情況下 ,菌株最高產(chǎn)普魯蘭酶酶活性就達(dá)到了4.2 U?mL－1,與部分同類文獻(xiàn)相比 ,產(chǎn)酶活性和發(fā)酵周期均具有一定優(yōu)勢(shì).另外 ,來(lái)源于動(dòng)物內(nèi)生性的產(chǎn)功能酶菌株 ,在酶活性的生物安全方面更容易得到保障[10],開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力更大 ,普魯蘭酶在食品、飼料領(lǐng)域使用廣泛 ,所以ZXYG5具有較大的開(kāi)發(fā)前景；從ZXYG5菌株多項(xiàng)分類鑒定結(jié)果的歸屬來(lái)看 ,還未見(jiàn)有泛菌屬產(chǎn)普魯蘭酶菌株的報(bào)道 ,因此 ,ZXYG5菌株的分離、鑒定及產(chǎn)酶活性的確定 ,豐富了產(chǎn)普魯蘭酶菌株誘變育種和全基因組育種的遺傳資源.

[1]袁振宏.能源微生物學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社 ,2012:69－76.

[2]孫劭靖 ,路福平 ,姜楠 ,等.一株耐熱普魯蘭酶菌株Anoxybacillus sp.LM14-2分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通報(bào) ,2011(9):136－140.

[3]焦豫良 ,王淑軍 ,呂明生.GH57家族高溫淀粉普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與功能分析[J].微生物學(xué)報(bào) ,2011 ,51(1):447－454.

[4]喬宇 ,丁宏標(biāo) ,王海燕.普魯蘭酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展 ,2011 ,1(3):189－194.

[5]SUZUKI Y ,HATAGAKI K ,ODA H.A hyperthermostable pullulanase produced by an extreme thermophile ,Bacillus flavocal-darius KP 1228 ,and evidence for the proline theory of increasing protein thermostability[J].Appl Microbiol.Biotechnol ,1991 (34):707－714.

[6]郭宏文 ,江成英 ,冮潔 ,等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選[J].科學(xué)研究 ,2008 ,29(9):52－55.

[7]KANG J ,PARK K M ,CHOI K H ,et al.Molecular cloning and biochemical characterization of a heat stable typeⅠpullula-nase from Thermotoga neapolitan[J].Enzyme Microb Technol ,2011 ,48(3):260－266.

[8]LI Y R ,ZHANG L ,NIU D D ,et al.Cloning ,expression ,characterization ,and biocatalytic investigation of a novel Bacilli thermostable typeⅠpullulanase from Bacillus sp.CICIM 263[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2012 ,60(44): 11164－11172.

[9]RüDIGER A ,JORGENSEN P L ,Antranikian G.Isolation and characterization of a heat-stable pullulanase from the hyperther-mophilic archaeon Pyrococcus woesei after cloning and expression of its gene in Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol ,1995 ,61(2):567－575.

[10]徐麗華 ,婁愷 ,張華 ,等.微生物資源學(xué)(第二版)[M].北京:科學(xué)出版社 ,2010:243－249.

[11]王在貴 ,楊文靜 ,劉朝良 ,等.家蠶腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的分離與鑒定及其發(fā)酵條件[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) ,2011 ,19(1): 149－156.

[12]王保軍 ,劉纓 ,姜嘉 ,等.蝎子腸道內(nèi)微生物多樣性研究[J].微生物學(xué)報(bào) ,2007 ,47(5):888－893.

[13]袁鋒 ,張雅林 ,馮紀(jì)年 ,等.昆蟲(chóng)分類學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 ,2006:360－361.

[14]魏丙卓 ,孫杰.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究[J].武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào) ,2008 ,4(8):174－177.

[15]謝家儀 ,董光軍 ,劉振英.掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J].電子顯微學(xué)報(bào) ,2005 ,24(4):440－440.

[16]劉國(guó)生.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社 ,2007:141－155.

[17]黃亞?wèn)| ,時(shí)小燕.微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社 ,2013:67－80 ,198－216.

[18]陶天申 ,楊瑞馥 ,東秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社 ,2007:313－322.

[19]陳瑜.臨床常見(jiàn)細(xì)菌、真菌鑒定手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社 ,2009:62－70.

[20]郭宏文 ,江成英 ,冮潔 ,等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選[J].食品研究與開(kāi)發(fā) ,2008 ,29(9):52－55.

[21]馬曉軍 ,張曉君 ,王銳 ,等.堿性普魯蘭酶產(chǎn)生菌選育和發(fā)酵條件的研究[J].西北植物學(xué)報(bào) ,2002 ,22(4):883－888.

(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Isolation ,identification and enzyme activity of pullulanase-producing strain ZXYG5

SUN Hui-zhong1,WANG Xiao-dong1,SONG Yue-qin1,ZHU Jin-feng2,LI Guang-liang2,SUN Ming-hui2,HOU Xiao-gai1
(1.College of Agriculture ,Henan University of Science and Technology ,Luoyang ,Henan 471003 ,China；2.Henan Tobacco Companies Luohe branch ,Luohe ,Henan 462000 ,China)

After being inoculated with amylopectin and pullulan as sole carbon source successively ,strain ZXYG5 with potential of pullulanase production was isolated from gut of tobacco beetle(Lasioderma serricorne).The optimal fermentation condition was 35℃ ,160 r?min－1and 42 h with maximum pullulan yield of 4.2 U?mL－1.Subsequent standard morphological observation ,physio-logical and biochemical property analysis ,and 16S rDNA sequencing test indicated strain ZXYG5 was Pantoea sp. ,and was named Pantoea sp.ZXYG5.Strain ZXYG5 with satisfactory initial pullulanase activity can be used as a good alternative to conventional mu-tation and genome breeding.

pullulanase；gut bacteria；isolation；16S rDNA；enzyme activity

Q939.9

A

1671-5470(2015)06-0629-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.012

20150－02－25

2015－05－12

河南省煙草公司科學(xué)研究與技術(shù)項(xiàng)目(HYKJ2012M04、HYKJ201302)；河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(4024-13480045、4026-13480047)；上海煙草集團(tuán)責(zé)任有限公司項(xiàng)目(SZBCW2014-00830).

孫會(huì)忠(1976－) ,男 ,副教授 ,博士.研究方向:生物資源學(xué).Email:huizhong66＠163.com.通訊作者王小東(1978－) ,男 ,副教授 ,博士.研究方向:煙草學(xué).Email:lylhsys＠126.com.