不同微量元素對(duì)斑玉蕈菌絲生長及酶活的影響

孫淑靜 ,單書凱 ,李釗鋒 ,郭艷艷 ,陳文星 ,胡開輝

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ,福建福州350002)

不同微量元素對(duì)斑玉蕈菌絲生長及酶活的影響

孫淑靜 ,單書凱 ,李釗鋒 ,郭艷艷 ,陳文星 ,胡開輝

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ,福建福州350002)

低脂肪、低熱量的珍稀名貴食用菌[13].但斑玉蕈在生產(chǎn)過程中生產(chǎn)周期較長(120－150 d) ,菌體生長速度慢 ,原料利用率低 ,從而增加了生產(chǎn)成本 ,影響了生產(chǎn)企業(yè)的效益[14－15].本研究通過探索微量元素對(duì)斑玉蕈新品種閩真1號(hào)在不同培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲生長和基質(zhì)利用相關(guān)酶酶活的影響 ,為斑玉蕈實(shí)驗(yàn)室菌絲培養(yǎng)及通過微量元素調(diào)節(jié)菌絲生長速度、提高基質(zhì)降解效率方面的研究提供依據(jù).

通過在PDA加富培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加6種微量元素 ,探索不同條件下微量元素對(duì)斑玉蕈菌絲生長及基質(zhì)降解有關(guān)酶的酶活的影響.結(jié)果表明:PDA加富培養(yǎng)基中添加100、60、500、100 mg?L－1的微量元素Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋,顯著促進(jìn)菌絲生長；生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加100 mg?kg－1的Fe2＋和Cu2＋對(duì)菌絲生長有明顯的促進(jìn)作用 ,添加100 mg?kg－1Zn2＋對(duì)菌絲生長有抑制作用；生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加100 mg?kg－1的Cu2＋顯著提高漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的酶活 ,其酶活分別達(dá)到39.83、19.17和9.58 U?mL－1.表明每種微量元素對(duì)纖維素酶和木聚糖酶酶活的影響不顯著 ,在不同培養(yǎng)基中不同微量元素對(duì)斑玉蕈的菌絲生長及酶活的影響不同.

斑玉蕈；微量元素；菌絲生長速度；酶活

近年來 ,利用深層培養(yǎng)的真菌菌絲體來富集和轉(zhuǎn)化微量元素方面的研究引起人們關(guān)注[1－2],但微量元素對(duì)食用菌菌絲及酶活的影響的研究相對(duì)較少.微量元素對(duì)食用菌菌絲的生長速度和子實(shí)體的分化、發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)方面有重要影響[3－4].微量元素還是某些酶的必要因子 ,食用菌木質(zhì)素降解酶系高效降解食用菌培養(yǎng)基中的木質(zhì)素 ,為食用菌菌體的生長提供營養(yǎng) ,促進(jìn)菌體和子實(shí)體的生長發(fā)育[5－7].同時(shí)酶活的高低可以衡量菌絲的代謝能力[8],從而反映菌株對(duì)基質(zhì)的降解能力 ,影響食用菌的生產(chǎn)周期.因此 ,探索微量元素對(duì)食用菌菌絲生長、木質(zhì)素降解酶系酶活的影響 ,對(duì)提高基質(zhì)木質(zhì)素的降解率、縮短食用菌生產(chǎn)周期、提高生物學(xué)效率具有重要意義.已有微量元素對(duì)平菇[9]、金針菇[10]、猴頭菌[11]等生長發(fā)育的影響的相關(guān)研究報(bào)道.郭艷艷等[12]對(duì)不同營養(yǎng)條件下斑玉蕈的菌絲生長及與基質(zhì)利用相關(guān)的酶的產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究.但微量元素對(duì)斑玉蕈在不同培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲生長發(fā)育及基質(zhì)利用相關(guān)酶酶活影響的研究尚未見報(bào)道.

斑玉蕈Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow又名玉蕈 ,屬傘菌目口蘑科玉蕈屬 ,是一種高蛋白、

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 斑玉蕈閩真1號(hào) ,由福建農(nóng)林大學(xué)微生物工程實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA加富培養(yǎng)基包括200 g?L－1馬鈴薯、20 g?L－1葡萄糖、3 g?L－1酵母粉、3 g?L－1蛋白胨、1.5 g?L－1KH2PO4、1.5 g?L－1MgSO4?7H2O、20 g?L－1瓊脂 ,pH自然；生產(chǎn)培養(yǎng)基包括71%棉籽殼、23%麥麩、5%玉米粉、1%生石灰 ,含水量65%.

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 向PDA加富培養(yǎng)基中分別添加10 g?L－1的MnSO4?H2O、無水CaCl2、Na2MoO4? 2H2O、ZnCl2、FeSO4?7H2O、CuSO4?5H2O溶液 ,使其在PDA加富培養(yǎng)基中終濃度分別為20、60、100、500 mg?L－1,即每種微量元素設(shè)置4個(gè)濃度梯度.

向生產(chǎn)培養(yǎng)基中分別添加MnSO4?H2O、無水CaCl2、Na2MoO4?2H2O、ZnCl2、FeSO4?7H2O、CuSO4? 5H2O ,使其在生產(chǎn)培養(yǎng)基中的終濃度為100 mg?kg－1.以不添加以上物質(zhì)為對(duì)照 ,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.2.2 菌株生長速度的測定 將待測菌株分別接種于PDA加富培養(yǎng)基、含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培養(yǎng)基平板上 ,每種培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù) ,置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).從第3天起每隔1 d測其菌絲生長速度.將待測菌株分別接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基及含Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋微量元素的培養(yǎng)基試管中 ,每種培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù) ,置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ,從第10天起每隔10 d測其菌絲生長速度.

1.2.3 粗酶液的提取 分別將接種前以及菌絲長10、20、30、40 d時(shí)試管中的栽培料全部取出(接種前試管栽培料為32 g) ,在粉碎機(jī)里將其粉碎 ,混勻后 ,稱取10 g置250 mL三角瓶中 ,然后加入50 mL無菌水 ,置于24℃、110 r?min－1的搖床中浸提2 h ,過濾離心 ,取其上清液 ,即為粗酶液.

1.2.4 漆酶活性的測定 參照吳涓等[16]的方法 ,取2.7 mL HAc-NaAc緩沖液(pH＝4.5)、0.1 mL 1 mmol? L－1ABTS溶液、0.2 mL粗酶液 ,在30℃下 ,測定反應(yīng)開始前3 min的D420nm增量.設(shè)3個(gè)重復(fù) ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對(duì)照.

1.2.5 錳過氧化物酶酶活的測定 參照周金燕等[17]的方法 ,取1.5 mL酶液 ,含有終濃度為0.4 mmol?L－1的愈創(chuàng)木酚、0.1 mmol?L－1的H2O2、0.2 mmol?L－1的MnSO4及50 mmol?L－1的琥珀酸鈉緩沖體系(pH＝4. 5) ,以0.1 mmol?L－1的H2O2啟動(dòng)反應(yīng).在40℃下 ,測定反應(yīng)開始前3 min的D465nm增量.設(shè)3個(gè)重復(fù) ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對(duì)照.

1.2.6 木質(zhì)素過氧化物酶酶活的測定 參照莢榮等[18]的方法 ,取1.5 mL 0.2 mol?L－1酒石酸鈉緩沖液(pH＝3.0)、1.0 mL15 mmol?L－1藜蘆醇、0.6 mL酶液 ,以0.1 mL 15 mmol?L－1H2O2啟動(dòng)反應(yīng).在40℃下 ,測定反應(yīng)開始前1 min的D310nm的增量.設(shè)3個(gè)重復(fù) ,以去離子水作為空白對(duì)照.

1.2.7 纖維素酶酶活的測定 參照趙玉萍等[19]的方法 ,在具塞試管中加入(50±1)mg濾紙、1 mL酶液和1 mL 100 mmol?L－1HAc-NaAc緩沖液(pH＝4.6) ,置于50℃恒溫水浴鍋中保溫1 h ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水顯色5 min ,冷卻至室溫 ,加蒸餾水定容至25 mL ,測D520nm值.設(shè)3個(gè)重復(fù) ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對(duì)照.

1.2.8 木聚糖酶酶活的測定 參照劉蘋等[20]的方法 ,在具塞試管中加入1.5 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))木聚糖溶液、0.5 mL酶液 ,置于50℃恒溫水浴鍋中保溫20 min ,取出后立即加入3 mL DNS溶液 ,沸水顯色5 min ,冷卻至室溫 ,加蒸餾水定容至10 mL ,測D550nm值.設(shè)3個(gè)重復(fù) ,以滅活15 min的粗酶液作為空白對(duì)照.

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件 ,采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微量元素對(duì)菌絲生長的影響

2.1.1 PDA加富培養(yǎng)基平板上菌絲的生長速度 由圖1、2可知 ,在PDA加富培養(yǎng)基平板上 ,不同微量元素對(duì)閩真1號(hào)菌絲生長的影響不同 ,同一微量元素在不同濃度下對(duì)閩真1號(hào)菌絲生長的影響也不同. Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋對(duì)菌絲的生長有促進(jìn)作用 ,其添加量分別為100、60、500、100 mg?L－1時(shí) ,菌絲直徑分別為7.18、7.15、7.28、7.13 cm ,與對(duì)照(6.92 cm)相比差異顯著；Cu2＋對(duì)菌絲生長有明顯的抑制作用 ,當(dāng)其質(zhì)量濃度為20 mg?L－1時(shí) ,菌絲直徑為5.74 cm ,與對(duì)照(6.92 cm)相比差異極顯著；Zn2＋對(duì)菌絲生長影響不大 ,只有當(dāng)其質(zhì)量濃度為500 mg?L－1時(shí)對(duì)菌絲生長有顯著的抑制作用.

圖1 添加不同微量元素的PDA加富培養(yǎng)基平板上菌絲直徑Fig.1 The mycelia diameter on enriched PDA media with different concentration and different trace elements

圖2 添加不同微量元素的PDA加富培養(yǎng)基平板上菌絲的生長速度Fig.2 The mycelia growth rates on enriched PDA media with different trace elements

2.1.2 生產(chǎn)培養(yǎng)基中菌絲的生長速度 在生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加100 mg?kg－1不同金屬離子 ,由表1和圖3可知:在第36天 ,Mn2＋、Fe2＋、Cu2＋對(duì)菌絲生長有顯著的促進(jìn)作用 ,Zn2＋對(duì)菌絲生長有抑制作用 ,在添加30和36 d后 ,菌絲高度分別為4.93、6.70 cm ,與對(duì)照(6.82、8.33 cm)相比 ,差異顯著；而Ca2＋、Mo6＋對(duì)菌絲生長的影響不顯著.表明在PDA加富培養(yǎng)基上添加不同微量元素對(duì)閩真1號(hào)菌絲生長的影響是不同的 ,特別是Cu2＋對(duì)不同營養(yǎng)條件下菌絲生長速度影響的差異性較大.

表1 添加不同微量元素的生產(chǎn)培養(yǎng)基中菌絲高度1)Table 1 The mycelia height in production media with different trace elementscm

2.2 不同微量元素對(duì)酶活的影響

2.2.1 不同微量元素對(duì)漆酶酶活的影響 生產(chǎn)培養(yǎng)基中 ,在菌絲生長起始階段檢測不到漆酶；當(dāng)菌絲長至第30天時(shí) ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Fe2＋、Cu2＋的生產(chǎn)培養(yǎng)基中可以檢測到漆酶 ,但酶活較低；當(dāng)菌絲生長40 d后 ,漆酶酶活增大；添加Mn2＋和Fe2＋后漆酶酶活分別為18.67和19.68 U?L－1,與對(duì)照(17.00 U?L－1)相比差異顯著(P<0.05).添加Ca2＋、Mo6＋和Zn2＋抑制漆酶酶活 ,漆酶酶活分別為1.25、2.42和1.00 U?L－1,與對(duì)照(17.00 U?L－1)相比差異顯著(P<0.05).添加Cu2＋的生產(chǎn)培養(yǎng)基中 ,漆酶酶活最高 ,為39.83 U?L－1,是對(duì)照的2.34倍.由此可知 ,100 mg?kg－1的Cu2＋對(duì)漆酶的分泌有促進(jìn)作用 ,是漆酶的一個(gè)激活劑.

2.2.2 不同微量元素對(duì)錳過氧化物酶活酶活的影響

由圖4可看出 ,在菌絲生長初期檢測不到錳過氧化物酶；當(dāng)菌絲長至第20天時(shí) ,可以檢測到錳過氧化物酶 ,各金屬離子對(duì)錳過氧化物酶酶活沒有顯著性影響；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加 ,錳過氧化物酶酶活逐漸增大.但在整個(gè)菌絲生長過程中 ,錳過氧化物酶酶活都比較低 ,與對(duì)照相比 ,在第40天添加Cu2＋對(duì)錳過氧化物酶酶活有顯著的促進(jìn)作用；而Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋、Zn2＋對(duì)錳過氧化物酶酶活有顯著的抑制作用.

2.2.3 不同微量元素對(duì)木質(zhì)素過氧化物酶酶活的影響 隨著菌絲培養(yǎng)時(shí)間的增加 ,木質(zhì)素過氧化物酶酶活先逐漸升高 ,隨后降低.在整個(gè)生長階段 ,木質(zhì)素過氧化物酶的活性都不高 ,在菌絲生長至第30天時(shí) ,酶活達(dá)到最大.添加Cu2＋的培養(yǎng)基中木質(zhì)素過氧化物酶的活性最高 ,達(dá)9.58 U?mL－1,與對(duì)照(6.77 U?mL－1)相比差異顯著 ,結(jié)果見圖5.

2.2.4 不同微量元素對(duì)纖維素酶酶活的影響 由圖6可看出 ,在整個(gè)菌絲生長階段 ,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加 ,纖維素酶酶活逐漸增大.與對(duì)照相比 ,添加Mn2＋、Ca2＋、Mo6＋對(duì)菌絲生長后期纖維素酶酶活有明顯的抑制作用；而添加Zn2＋、Fe2＋、Cu2＋對(duì)纖維素酶酶活有輕微的促進(jìn)作用 ,差異不顯著.

2.2.5 不同微量元素對(duì)木聚糖酶酶活的影響 在整個(gè)菌絲生長階段 ,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加 ,木聚糖酶酶活逐漸增大；但在菌絲生長后期 ,酶活會(huì)稍微降低 ,各種微量元素對(duì)木聚糖酶酶活影響不大.添加Zn2＋、Fe2＋對(duì)木聚糖酶活性有顯著的抑制作用 ,結(jié)果見圖7.在整個(gè)菌絲生長階段 ,木聚糖酶酶活比其他酶酶活大 ,表明木聚糖酶對(duì)菌絲后期的生長起著非常重要的作用.

圖3 添加不同微量元素的生產(chǎn)培養(yǎng)基中菌絲生長速度Fig.3 The mycelia growth rate in production media with different trace elements

圖4 不同微量元素對(duì)錳過氧化物酶酶活的影響Fig.4 Effect of different trace elements on the activities of manganese peroxidase

圖5 不同微量元素對(duì)木質(zhì)素過氧化物酶酶活的影響Fig.5 Effect of different trace elements on the activities of lignin peroxidase

圖6 不同微量元素對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of different trace elements on the activities of cellulase

3 討論

不同微量元素及同一微量元素在不同濃度下對(duì)斑玉蕈的菌絲生長和酶活的影響程度各不相同.PDA加富培養(yǎng)基中添加Zn2＋對(duì)菌絲生長影響不大 ,根據(jù)王宜磊[21]的報(bào)道 ,這有可能是Cl－的影響 ,而選用Zn-SO4會(huì)促進(jìn)平菇菌絲生長.在生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加Zn2＋,對(duì)菌絲生長有明顯的抑制作用 ,這可能是由于所添加的Zn2＋的濃度偏高 ,根據(jù)王曉光[22]的報(bào)道 ,低濃度的Zn2＋對(duì)菌絲體的生長有促進(jìn)作用 ,但高濃度的Zn2＋對(duì)菌絲體的生長有抑制作用.在PDA加富培養(yǎng)基中添加Cu2＋對(duì)菌絲生長有明顯的抑制作用 ,而在生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加Cu2＋對(duì)菌絲生長卻有顯著的促進(jìn)作用 ,可能是由于在PDA加富培養(yǎng)基中添加Cu2＋的濃度偏高.根據(jù)Poitou et al[9]和Hatvani et al[10]的報(bào)道 ,低濃度的Cu2＋對(duì)菌絲生長起促進(jìn)作用 ,高濃度的Cu2＋對(duì)菌絲的生長則起著抑制作用.在PDA加富培養(yǎng)基中添加Mn2＋,對(duì)菌絲生長有明顯的促進(jìn)作用 ,當(dāng)濃度為100 mg?L－1時(shí) ,促進(jìn)作用最顯著；但向生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加Mn2＋對(duì)菌絲生長影響不明顯.根據(jù)Niess et al[11]的報(bào)道 ,Mn2＋對(duì)糙皮側(cè)耳菌絲的生長有促進(jìn)作用.但Hatvani et al對(duì)香菇的研究[10]表明 ,在培養(yǎng)基中添加3.1 mmol?L－1MnSO4,對(duì)香菇菌絲生長有抑制作用 ,使其菌絲生長速度下降了50%.因此 ,Mn2＋對(duì)菌株生長速度的影響 ,與菌株的種類和培養(yǎng)菌株的基質(zhì)都有關(guān)系.

圖7 不同微量元素對(duì)木聚糖酶酶活的影響Fig.7 Effect of different trace elements on the activities of xylanase

本研究結(jié)果表明 ,銅能提高漆酶的活性 ,這與劉杰在杏鮑菇中的研究一致[23].在菌絲整個(gè)生長階段 ,添加的100 mg?kg－1MnSO4?H2O對(duì)錳過氧化物酶酶活大小的影響不明顯 ,這可能是由于生產(chǎn)培養(yǎng)基中所添加的錳的濃度偏高.張連慧等[24]研究結(jié)果表明Mn2＋對(duì)菌體的生長很有利 ,但對(duì)菌體產(chǎn)錳過氧化物酶并無顯著影響.在生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加MnSO4?H2O ,使得木質(zhì)素過氧化物酶的酶活有所下降.李華鐘等[25]研究表明 ,適量的Mn2＋可提高木質(zhì)素過氧化物酶的活性 ,當(dāng)大量的Mn2＋被氧化成Mn3＋時(shí) ,會(huì)抑制木質(zhì)素過氧化物酶的表達(dá) ,本研究中所添加的Mn2＋濃度可能偏高.本研究結(jié)果也表明 ,Ca2＋對(duì)木聚糖酶有激活作用 ,Fe2＋、Zn2＋對(duì)木聚糖酶酶活有抑制作用 ,這與趙玉蓉[26]研究金屬離子對(duì)木聚糖酶活性影響的結(jié)果一致.

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Effects of trace elements on the mycelial growth and enzyme activities of Hypsizygus marmoreus

SUN Shu-jing ,SHAN Shu-kai ,LI Zhao-feng ,GUO Yan-yan ,CHEN Wen-xing ,HU Kai-hui
(College of Life Sciences ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Effects of trace elements on the mycelial growth rate and activities of some enzymes related to substrate degradation of Hypsizigus marmoreus were explored under different cultivation conditions by addition of six trace elements in enriched PDA media and production media.The results showed some metal ions(Mn2＋,Ca2＋,Mo6＋and Fe2＋)could significantly accelerate the mycelial growth in enriched PDA media with the concentration of 100 ,60 ,500 and 100 mg?L－1,respectively.Adding Fe2＋and Cu2＋in pro-duction media had remarkable promoting effects on mycelial growth.Zinc ion inhibited the growth of mycelia when it was added to production media.Copper ion supplementation(100 mg?kg－1)in production media was most beneficial to the activities of laccase ,manganese peroxidase and lignin peroxidase(reaching 39.83 ,19.17 and 9.58 U?mL－1,respectively).However ,there were no sig-nificant effects of all trace elements on the activities of cellulase and xylanase.It suggested that different trace elements had different effects on the mycelial growth of H.marmoreus and the activities of its related enzyme in different substrates.

Hypsizygus marmoreus；trace element；mycelial growth rate；enzyme activity

S63

A

1671-5470(2015)06-0639-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.014

2015－01－09

2015－06－15

福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)五新工程項(xiàng)目(閩發(fā)改委投資[2012]931號(hào))；福建省自然基金杰出青年項(xiàng)目(2014J06010)；福建農(nóng)林大學(xué)校杰出青年人才項(xiàng)目(xjq201209)；國家自然基金青年項(xiàng)目(31201669)；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20103515120015).

孫淑靜(1978－) ,女 ,副教授 ,博士.研究方向:食用菌遺傳育種、基因功能及酶學(xué).Email:shjsun2004＠126.com.通訊作者胡開輝(1962－) ,男 ,教授 ,博士生導(dǎo)師.研究方向:微生物生態(tài)和食用真菌.Email:hukaihui62＠126.com.