開設(shè)“流式細(xì)胞術(shù)”實(shí)驗(yàn)課 提高研究生實(shí)踐能力

張 英， 李 莉， 任林柱， 郝林琳， 楊 舉， 張麗穎， 黎宏宇

(吉林大學(xué) a. 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院； b. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院; c. 人力資源與社會(huì)保障處, 吉林 長(zhǎng)春 130062)

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開設(shè)“流式細(xì)胞術(shù)”實(shí)驗(yàn)課 提高研究生實(shí)踐能力

張 英a， 李 莉a， 任林柱a， 郝林琳a， 楊 舉b， 張麗穎a， 黎宏宇c

(吉林大學(xué) a. 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院； b. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院; c. 人力資源與社會(huì)保障處, 吉林 長(zhǎng)春 130062)

流式細(xì)胞術(shù)是一門新興的實(shí)驗(yàn)科學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究與臨床檢測(cè)等領(lǐng)域。根據(jù)科研的需要，面向獸醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)的研究生開設(shè)了流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)課，幫助學(xué)生深入了解了流式細(xì)胞儀的工作原理、操作方法及應(yīng)用。課程中設(shè)置了“PLA2G7-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA-109細(xì)胞與PK-15細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)”和“小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及B細(xì)胞的檢測(cè)”兩個(gè)教學(xué)范例。在課程中讓學(xué)生親自參與樣本的制備，包括細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、小鼠外周血的采集、單細(xì)胞懸液的制備、細(xì)胞染色、樣本過濾、流式樣本的上機(jī)操作、數(shù)據(jù)的獲取與分析等，培養(yǎng)了學(xué)生的動(dòng)手能力及獨(dú)立操作機(jī)器的能力。并與研究生以后的科研實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，提高了學(xué)生獨(dú)立思考、分析問題、解決問題的能力，幫助研究生在未來的實(shí)驗(yàn)研究中科學(xué)規(guī)劃和使用流式細(xì)胞儀。

流式細(xì)胞術(shù)； 獸醫(yī)學(xué)； 研究生； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)

0 引 言

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù)，是一項(xiàng)對(duì)被熒光素染色的生物顆粒如各種單細(xì)胞、微生物及各種人工微球等，在激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下，對(duì)其進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，以及對(duì)特定群體進(jìn)行分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析新技術(shù)，具有很強(qiáng)的實(shí)踐性和技術(shù)性。在醫(yī)學(xué)高等院校及科研機(jī)構(gòu)中應(yīng)用越來越普遍，隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展與完善，應(yīng)用領(lǐng)域已從細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)等基礎(chǔ)研究擴(kuò)大到腫瘤學(xué)、藥物性、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等各個(gè)方面[1-3]。

獸醫(yī)學(xué)院的研究生主要研究方向有生物化學(xué)與分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、胚胎生物學(xué)、預(yù)防獸醫(yī)學(xué)、臨床獸醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)等，根據(jù)學(xué)院的科研需求，吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部購(gòu)進(jìn)一臺(tái)美國(guó)BD公司，型號(hào)為AriaⅡ的流式細(xì)胞儀，并在研究生的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)課程中率先開設(shè)了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)課，幫助學(xué)生了解了FCM的基本原理及應(yīng)用領(lǐng)域，拓寬了科研思路，提高了科研實(shí)踐能力和綜合素質(zhì)。

1 流式細(xì)胞儀

1.1 工作原理

流式細(xì)胞儀是一種綜合了激光技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、光電測(cè)量技術(shù)等各學(xué)科的知識(shí)為一體的大型精密儀器。其主要由流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，激光光源與光束形成系統(tǒng)，信號(hào)檢測(cè)、存貯、光電轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及細(xì)胞分選系統(tǒng)5部分組成[4]。

將單細(xì)胞懸液樣本，經(jīng)不同的熒光染料染色后置于流式管中，樣本在一定的壓力下進(jìn)入流動(dòng)室，在鞘液的的包裹下成單行排列，并以一定流速經(jīng)過噴嘴通過激光聚焦區(qū)，在激光束的照射下，產(chǎn)生熒光信號(hào)和散射光信號(hào)。光信號(hào)通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片后，經(jīng)PMT接收轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為能被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，計(jì)算機(jī)對(duì)采集的各種信號(hào)用相應(yīng)的軟件進(jìn)行分析處理，以一維直方圖、二維、三維散點(diǎn)圖或等高線圖及數(shù)據(jù)表等形式顯示出來[3]。散射光信號(hào)包括前向角散射光(Forward Scatter，F(xiàn)SC)及側(cè)向角散射光(Side Scatter，SSC)。FSC主要反映細(xì)胞大小，SSC主要反映細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射情況及細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)濃度或者所測(cè)細(xì)胞表面抗原的強(qiáng)度大小。

1.2 機(jī)型介紹

流式細(xì)胞儀根據(jù)其功能主要分為臨床分析型流式細(xì)胞儀和科研分選型流式細(xì)胞儀兩種。分析型流式細(xì)胞儀包括美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur，F(xiàn)ACS Count，F(xiàn)ACS Canto II ，F(xiàn)ACS Verse；以及美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL，F(xiàn)C 500，Gallios，CyAn流式細(xì)胞儀等，只能用于流式分析，其自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握，主要用于臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，樣本被分析后最終進(jìn)入廢液桶；分選型流式細(xì)胞儀包括FACSVantage SE，F(xiàn)ACSAria I(II/III)，Influx及MoFlo XDP等，既可用于分析又可進(jìn)行分選，其功能齊全，應(yīng)用靈活，能夠分選回收樣品細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)功能試驗(yàn)，如PCR、FISH或繼續(xù)培養(yǎng)等。

2 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

在了解流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上，介紹流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用。FCM既可以檢測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括：測(cè)量細(xì)胞的大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度、核漿的比例、細(xì)胞表面積、DNA含量、RNA及蛋白質(zhì)含量；也可以檢測(cè)細(xì)胞功能包括：細(xì)胞表面及胞漿的特異性抗原、細(xì)胞因子、細(xì)胞活性、激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體等。隨著單克隆抗體技術(shù)、熒光化學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)作為一種快速細(xì)胞分析技術(shù)，應(yīng)用領(lǐng)域日益擴(kuò)展，越來越廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)及臨床實(shí)踐的各方面。包括淋巴細(xì)胞及其亞群測(cè)定、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期、淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、RNA測(cè)定、總蛋白測(cè)定、白血病免疫分型、HIV檢測(cè)、牛奶及化妝品中病原微生物的檢測(cè)、水質(zhì)檢測(cè)等[5-6]。在講解過程中，根據(jù)本學(xué)院研究生的科研方向，利用大量的流式細(xì)胞儀分析圖譜，重點(diǎn)講述流式細(xì)胞術(shù)在獸醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及動(dòng)物干細(xì)胞研究領(lǐng)域的中應(yīng)用，主要包括細(xì)胞因子檢測(cè)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、淋巴細(xì)胞檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。使學(xué)生能夠更加直觀、生動(dòng)、通俗易懂地了解流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用。

3 實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)

3.1 理論知識(shí)

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)課課程設(shè)置20學(xué)時(shí)，理論知識(shí)講解4學(xué)時(shí)、儀器培訓(xùn)4學(xué)時(shí)、流式樣品制備及上機(jī)操作12學(xué)時(shí)。目前，利用國(guó)家級(jí)動(dòng)物科技實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心平臺(tái)，已制作完成了“流式細(xì)胞術(shù)原理、操作與技巧”視頻，結(jié)合多媒體課件，主要講述流式細(xì)胞術(shù)原理、常用概念如通道、門等，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、顯示與分析、樣品的制備過程、熒光染料的選擇與使用、對(duì)照的設(shè)置、光譜重疊與補(bǔ)償調(diào)節(jié)及在操作過程中的具體注意事項(xiàng)等[7-8]。

3.2 儀器操作

FACSAria II是科研分選型流式細(xì)胞儀，較臨床機(jī)復(fù)雜。在實(shí)驗(yàn)開始前，組織學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀摩學(xué)習(xí)。結(jié)合儀器培訓(xùn)時(shí)的DV視頻，重點(diǎn)講解流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成及在系統(tǒng)中發(fā)揮的作用、儀器的開機(jī)程序及注意事項(xiàng)、FACS Diva Software軟件的使用方法、儀器的保養(yǎng)與維護(hù)、關(guān)機(jī)程序及注意事項(xiàng)等。并利用BD公司培訓(xùn)用的熒光微球先由教師示范流式樣本的上機(jī)操作過程及如何分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后學(xué)生在老師的指導(dǎo)下獨(dú)立練習(xí)儀器的使用方法，確保學(xué)生在實(shí)驗(yàn)前對(duì)儀器有充分的了解和掌握。

3.3 流式細(xì)胞樣品分析

結(jié)合研究生的科研需要，設(shè)計(jì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：① PLA2G7-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA-109細(xì)胞與PK-15細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)；② 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞類(CD3、CD4、CD8)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)。

3.3.1 儀器、試劑與材料

生物安全柜，流式細(xì)胞儀，倒置顯微鏡，水平離心機(jī)，二氧化碳培養(yǎng)箱，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，移液器(200 μL 、1 mL)，1640培養(yǎng)基，DMEM(Hyclone)；PLA2G7-EGFP質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，ECA-109細(xì)胞及PK-15細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室保存)，脂質(zhì)體2000， PI(500 ug/mL)，F(xiàn)ITC - Anti-Mouse CD19(BD公司)，動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液，昆明鼠。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)1：PLA2G7-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA-109細(xì)胞與PK-15細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)(4學(xué)時(shí))。

(1) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備：提前1天將ECA-109細(xì)胞及PK-15細(xì)胞用無抗生素培養(yǎng)液接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)到70%左右即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

(3) 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：細(xì)胞用1 mL無血清培養(yǎng)液漂洗一次，再加入300 μL無血清培養(yǎng)液。

(4) 轉(zhuǎn)染：取A/B混合液15 μL緩慢加到12孔板中，搖勻，37℃培養(yǎng)4 h后，更換10 % DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5) 轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，收獲細(xì)胞，PBS漂洗一次，并重懸于PBS中，密度為5×105～1×106cells/mL。

(6) 流式檢測(cè)，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的ECA-109細(xì)胞及PK-15細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)2：小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及B細(xì)胞的檢測(cè)(8學(xué)時(shí))。

(1) 小鼠摘除眼球采血，置于肝素抗凝的1.5 mL離心管中，用等體積的PBS稀釋全血。

隨著我國(guó)城市化進(jìn)程不斷加快，城市基礎(chǔ)設(shè)施和公共設(shè)施需求增長(zhǎng)強(qiáng)勁，地方政府作為主要投資主體在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)承擔(dān)了大量的城市建設(shè)和投資任務(wù).很多地方政府在自身財(cái)力不夠的情況下四處舉債，承受了巨大的資金壓力和還貸風(fēng)險(xiǎn).為了扼制這種勢(shì)頭，進(jìn)入新世紀(jì)尤其是2002年以后，國(guó)家出臺(tái)了一系列的政策法規(guī)，特別是《預(yù)算法》中明文規(guī)定，不允許地方政府直接舉債和提供擔(dān)保.在這種大趨勢(shì)下，作為地方政府對(duì)外政策性投融資平臺(tái)的各類城市建設(shè)投資公司(下稱城投公司)應(yīng)運(yùn)而生.

(2) 在5 mL的離心管中加入一定量的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的血液加到分離液的上方，室溫，2 000～2 500 r/min離心20～30 min。

(3) 離心結(jié)束后，將血漿層與分離液層之間的較薄較致密的白膜層吸到另一個(gè)離心管中，用PBS/1640稀釋，混勻，1 000～1 500 r/min離心5～10 min，重復(fù)1到2次。

(4) 細(xì)胞計(jì)數(shù)，用100 μL PBS將淋巴細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106cells/mL。

(5) 加入10 μL FITC - Anti-Mouse CD19(0.25 mg/mL)。

(6) 4℃，避光孵育30min。

(7) 離心去上清， PBS/BSA 洗細(xì)胞2～3次，用200 μL PBS將淋巴細(xì)胞重懸，加入4 μL PI染料(500 μg/mL)，孵育5～10 min。

(8) 相同方法，分別制備空白管和各染色抗體單染對(duì)照管及實(shí)驗(yàn)組樣本管。

(9) 流式上機(jī)檢測(cè)。

3.3.3 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)1 PLA2G7-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA-109細(xì)胞與PK-15細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)。

綠色熒光蛋白(GFP)是一種天然熒光蛋白，它在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠發(fā)出綠色熒光，是一種比較理想的熒光標(biāo)記蛋白。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)是在野生型GFP的基礎(chǔ)上對(duì)其基因進(jìn)行改造，顯著提高了其在動(dòng)物細(xì)胞中的熒光效能，大大增強(qiáng)了該報(bào)告分子的靈敏度，使EGFP非常適用于流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析[9-11]。為確定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，分別將含有報(bào)告基因EGFP的質(zhì)粒PLA2G7-EGFP轉(zhuǎn)染ECA-109細(xì)胞與PK-15細(xì)胞。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后ECA-109細(xì)胞中熒光信號(hào)強(qiáng)度(46.1%)明顯高于PK-15細(xì)胞(14.6%)。圖1、圖3為FSC-SSC物理參數(shù)圖，確定待檢測(cè)的細(xì)胞群；圖2、圖4為EGFP單參數(shù)直方圖(峰圖)，“P2”門為表達(dá)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的情況。

圖1 PK-15 FSC-SSC 物理參數(shù)圖

圖2 EGFP轉(zhuǎn)PK-15 單參數(shù)直方圖

圖3 ECA-109 FSC-SSC 物理參數(shù)圖

圖4 EGFP轉(zhuǎn)ECA-109 單參數(shù)直方圖

實(shí)驗(yàn)2 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及B細(xì)胞的檢測(cè)。

小鼠血液中各種成分的比重存在差異，利用接近等滲的ficoll-hypaque混合溶液(又稱淋巴細(xì)胞分層液)作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。外周血單個(gè)核細(xì)胞密度略低于分層液，故位于分層液界面之上，這樣就可獲得PBMC。細(xì)胞表面抗原CD19在正常及惡性B淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，是B細(xì)胞發(fā)育過程中一個(gè)涵蓋階段較長(zhǎng)的最為可靠的表面標(biāo)記物。CD19+B淋巴細(xì)胞比例的變化反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，外周血中CD19+B淋巴細(xì)胞比例的降低可能由很多原因引起，包括CD19+B淋巴細(xì)胞生成異常，破壞或丟失增加及遷徙的異常[12-15]。并利用PI染料鑒定獲得的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力情況。

圖5 淋巴細(xì)胞 FSC-SSC物理參數(shù)圖

圖6 FITC / PI 雙參數(shù)散點(diǎn)圖

圖7 分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

在上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生親自參與樣本的制備，包括細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、小鼠外周血的采集、單細(xì)胞懸液的制備、細(xì)胞染色、樣本過濾、流式樣本的上機(jī)操作、數(shù)據(jù)的獲取與分析等，培養(yǎng)了學(xué)生的動(dòng)手能力及獨(dú)立操作機(jī)器的能力，讓學(xué)生更好的理解和掌握流式細(xì)胞術(shù)的原理與應(yīng)用。

4 結(jié) 語

流式細(xì)胞術(shù)是一門新興的實(shí)驗(yàn)科學(xué)技術(shù),，在獸醫(yī)學(xué)院研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)方面開設(shè)此實(shí)驗(yàn)課是一個(gè)新的嘗試。通過兩年的實(shí)踐，學(xué)生反饋情況良好。既提高了大型貴重儀器的利用率，也調(diào)動(dòng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，鍛煉了學(xué)生動(dòng)手操作的能力，更好地理解和掌握流式細(xì)胞術(shù)的原理與應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了教學(xué)和科研的有機(jī)結(jié)合。在教學(xué)中激發(fā)了學(xué)生的探索和實(shí)踐能力，使學(xué)生真正能把這門技術(shù)運(yùn)用于自己的課題研究之中。

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Setting Flow Cytometry Experiment Lesson to raise Graduates’ Practice Ability

ZHANGYinga,LILia,RENLin-zhua,HAOLin-lina,YANGJub,ZHANGLi-yinga,LIHong-yuc

(a. College of Animal Science; b. College of Veterinary Medicine; c. Human Resources and Social Security,Jilin University, Changchun 130062, China)

Flow cytometry is an emerging experimental science and technology, widely used in basic research and clinical testing and other scopes. According to research related to veterinary science-oriented graduate students, flow cytometry laboratory sessions were opened to help students understand the working principle of the flow cytometer, methods of operation and application. Two teaching courses "PLA2G7-EGFP plasmid expressing EGFP protein ECA-109 after PK-15 cells" and "detecting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and B cells isolated" were set up. In the curriculum, students were involved in the preparation of samples, including cell culture and transfection, mouse peripheral blood collection, preparation of single cell suspensions, cell staining. The sample was filtered stream samples machine operation, acquired data and analysis. It trained the students' practical ability and the ability to operate independently of the machine. Base on these lessons, experimental research and graduate ability later was combined to improve the students in thinking independently, and enhance their analyzing problems, problem-solving skills. It also helps students to use scientific planning and study of flow cytometry experiments in the future.

Flow cytometry; veterinary; graduate; experimental teach

2014-06-09

吉林大學(xué)教學(xué)改革項(xiàng)目(2013326)

張 英(1979-)，女，吉林九臺(tái)人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究，流式細(xì)胞儀的操作與管理。

Tel.：13504429639； E-mail:zhangying636@126.com

黎宏宇(1983-),男，吉林長(zhǎng)春人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事人力資源管理。Tel.:13843090842;E-mail:lihongyu@jlu.edu.cn

Q 291

A

1006-7167(2015)05-0182-04