熟蛋殼膜微觀(guān)形貌及其拉曼光譜分析

狄 伶

(上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240)

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熟蛋殼膜微觀(guān)形貌及其拉曼光譜分析

狄 伶

(上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240)

為了有效利用熟蛋殼膜，初步檢測(cè)了其微觀(guān)形貌和表面分子基團(tuán),評(píng)價(jià)其回收可利用性。模擬烹調(diào)工藝，制備熟蛋殼膜；使用掃描電鏡觀(guān)察熟蛋殼膜微觀(guān)形貌；使用拉曼光譜儀檢測(cè)熟蛋殼膜表面分子基團(tuán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熟蛋殼膜在經(jīng)過(guò)高溫烹煮后仍然保持纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。殼膜纖維輕微溶脹，但未塌陷成片。熟蛋殼膜表面分子基團(tuán)拉曼光譜信號(hào)減少，蛋白質(zhì)主要發(fā)生構(gòu)象改變。初步推斷熟蛋殼膜具有可回收可利用性。

熟蛋殼膜； 拉曼光譜； 微觀(guān)形貌

0 引 言

人們?cè)谌粘Ｉ钪邪l(fā)明了很多食用雞蛋的方法，其中最簡(jiǎn)單、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值獲取率最高的為煮雞蛋[1]，因此熟雞蛋殼在廢棄蛋殼中占有相當(dāng)?shù)谋壤Ｎ覈?guó)是禽蛋產(chǎn)業(yè)大國(guó)，每年的禽蛋產(chǎn)量高達(dá)數(shù)千萬(wàn)t，相應(yīng)產(chǎn)生的廢棄蛋殼高達(dá)數(shù)百萬(wàn)t。這些棄置蛋殼直接造成了環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)。目前，對(duì)廢棄蛋殼的綜合利用正逐漸受到海內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2-3]。

雞蛋由外至內(nèi)依次是蛋殼、蛋殼膜(Eggshell Membranes，EM)、蛋清和蛋黃。由此在各組分間形成3個(gè)界面，分別是：①蛋殼與蛋殼膜的界面；②蛋殼膜與蛋清的界面；③蛋清與蛋黃的界面。我們?cè)诜治龅皻つr(shí)，定義其殼面，即與蛋殼的界面為外殼膜(Eggshell Membranes Towards Eggshell，EMEs)；定義其蛋面，即與蛋清的界面為內(nèi)殼膜(Eggshell Membranes Towards Egg，EME)[4]。蛋殼富含碳酸鈣(約93%)，外形圓潤(rùn)質(zhì)地堅(jiān)硬；蛋殼膜富含蛋白質(zhì)(約90%)，質(zhì)地柔軟具有通透性，兩者共同包繞保護(hù)卵內(nèi)容物[5-6]。蛋白質(zhì)在一定的物理、化學(xué)因素作用下，會(huì)發(fā)生空間構(gòu)象改變，從而引發(fā)理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失，這種現(xiàn)象即是蛋白質(zhì)變性[7]。研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋在沸水中烹煮超過(guò)10 min，內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列的理化變化(這種過(guò)程即熱變性)，然而變性的蛋白質(zhì)更易被人體的消化酶分解，利于吸收[8]。

熟蛋殼膜富含蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)烹煮工藝也發(fā)生熱變性。為了有效利用熟蛋殼膜資源，我們使用掃描電鏡觀(guān)察熟蛋殼膜(Cooked Eggshell Membranes，CEM)的微觀(guān)形貌，并對(duì)其表面分子基團(tuán)進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，初步分析熟蛋殼膜的回收可利用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

(1) 材料與設(shè)備。材料：取市售草雞蛋待用。設(shè)備：低真空超高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號(hào)Nova NanoSEM 230，美國(guó)FEI公司)；離子濺射儀(型號(hào)E-1045，日本Hitachi公司)；色散型共聚焦拉曼光譜儀(型號(hào)Senterra R200-L，德國(guó)Bruker Optics公司)。

(2) 實(shí)驗(yàn)方法。樣品的前處理：將洗凈的雞蛋放入水中浸泡1 min(防止蛋殼煮爆)，小火煮沸后溫火煮8 min。撈出煮熟的雞蛋在冷水中浸泡0.5 min，以便于剝離出蛋殼膜。熟蛋殼膜室溫干燥并保存。

電鏡觀(guān)察前使用離子濺射儀對(duì)待測(cè)面進(jìn)行噴金以降低生物樣品由于不導(dǎo)電而產(chǎn)生的荷電現(xiàn)象，噴金條件：15 mA，30 s(10 nm/min)；掃描電鏡參數(shù)：Accelerate voltage， 5 kV。

拉曼光譜檢測(cè)參數(shù)：激發(fā)器波長(zhǎng)為785 nm；激光功率100 mW；曝光時(shí)間和累積次數(shù)分別為2 s和2；光譜分辨率9 cm-1；實(shí)驗(yàn)采集的波數(shù)范圍為250～3 300 cm-1；原始光譜數(shù)據(jù)使用拉曼光譜儀自帶軟件OPUS 7.2作圖，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在前期工作中，我們使用掃描電鏡觀(guān)察了蛋殼及殼膜的微觀(guān)形貌[4]。蛋殼膜與蛋清相交處為一層纖維混蛋清結(jié)構(gòu)，由黏稠蛋清侵入蛋殼膜，受蛋殼膜多層纖維阻滯而成。在分離蛋殼膜時(shí)，蛋面的斷裂處主要產(chǎn)生在蛋清處，因此蛋殼膜的蛋面是一個(gè)相對(duì)光滑的表面。觀(guān)察到在與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，正是這種表面很難使細(xì)胞黏附于其上。然而，蛋殼膜的殼面斷裂處主要在蛋殼膜纖維處，因此暴露出大量的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(偶見(jiàn)脫落的蛋殼碎片)。

我們觀(guān)察到熟蛋殼膜的微觀(guān)形貌：①其殼面有較明顯的溶脹、塌陷現(xiàn)象(如圖1B)，這與生蛋殼膜遇水溶脹后的結(jié)構(gòu)相似，但溶脹程度有所不同。推測(cè)溶脹在一定溫變范圍內(nèi)比較迅速，隨著蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，溶脹趨勢(shì)有所減緩。因此形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷程度較低，并未完全塌陷成片呈封閉狀態(tài)；②熟蛋殼膜蛋面的微觀(guān)形貌比生蛋殼膜的更加粗糙(如圖1c，C)。我們推測(cè)這是由于水蒸汽分子在界面處的流通增加了界面的粗糙度。綜上：從熟蛋殼膜的微觀(guān)形貌來(lái)看，熟蛋殼膜保留了生蛋殼膜的多層纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，盡管發(fā)生了一定程度的溶脹和塌陷，并不影響自有結(jié)構(gòu)的保持。而熟蛋殼膜蛋面粗糙度的增加，我們認(rèn)為這種微觀(guān)形貌也許更利于細(xì)胞黏附。

(a,b,c)生蛋殼膜(A,B,C)熟蛋殼膜

圖1 蛋殼膜的微觀(guān)形貌

蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水鍵和氫鍵被破壞，亞基肽鏈結(jié)構(gòu)趨于松散，但并不導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鍵斷裂[8-9]。加熱超過(guò)100℃，蛋白質(zhì)分子雙螺旋結(jié)構(gòu)開(kāi)始展開(kāi)，其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-回旋隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu))隨之發(fā)生改變，其中α-螺旋明顯減少；加熱至120 ℃，蛋白質(zhì)分子充分展開(kāi)。

殼膜富含角蛋白，角蛋白的主要成分是含巰基的半胱氨酸(Cys)[10]。加熱使半胱氨酸鏈上的二硫鍵斷裂、硫基被氧化[11]。半胱氨酸包含3種骨架結(jié)構(gòu)，C-C-N骨架振動(dòng)出現(xiàn)在366 cm-1，C-C-S骨架變形出現(xiàn)在215 cm-1和98 cm-1。結(jié)合我們前期對(duì)蛋殼膜的拉曼光譜分析[12]，熟蛋殼膜的殼面和蛋面在<400 cm-1的范圍內(nèi)拉曼信號(hào)都減弱至消失(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明半胱氨酸的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變。此外，在蛋白質(zhì)和多肽的拉曼光譜中，S-S和C-C的伸縮振動(dòng)帶出現(xiàn)在500～700 cm-1[13]。其中C-C-S-S-C-C因峰值不同可能有三種構(gòu)型，分別是扭曲-扭曲-扭曲式((510±5) cm-1)、扭曲-扭曲-反式((525±5) cm-1)和反式-扭曲-反式((540±5) cm-1)構(gòu)象；C-S鍵有兩種構(gòu)象，分別是630～670 cm-1扭曲構(gòu)象和700～745 cm-1反式構(gòu)象[14-16]。如圖2所示：熟蛋殼膜的殼面和蛋面在600～750 cm-1處有較明顯的變化，說(shuō)明熟蛋殼膜主要發(fā)生C-S構(gòu)象的變化。此外，蛋殼膜還富含膠原蛋白，酰胺I的C=O伸縮振動(dòng)在1 669 cm-1和1 637 cm-1，酰胺II的N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)在1 557 cm-1，酰胺III帶的N-H彎曲振動(dòng)譜線(xiàn)在1 267 cm-1和1 245 cm-1[13]，熟蛋殼膜在這些波數(shù)范圍均無(wú)明顯變化。由苯丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的芳香基團(tuán)引起的強(qiáng)拉曼光譜吸收主要體現(xiàn)于800～1 100 cm-1，苯丙氨酸的特征吸收頻率為1 004 cm-1、1 033 cm-1，甲基和亞甲基的振動(dòng)在1 451 cm-1、2 900～3 000 cm-1[10]。熟蛋殼膜在800～1 000 cm-1拉曼信號(hào)有較明顯變化，我們推測(cè)芳香基團(tuán)發(fā)生了氧化。熟蛋殼膜在1 400～1 500 cm-1、1 600～1 700 cm-1、2 800～3 000 cm-1均無(wú)明顯變化。綜上：熟蛋殼膜不管是蛋面還是殼面，其表面分子基團(tuán)主要發(fā)生構(gòu)象變化。芳香基團(tuán)決定親脂疏水性，熟蛋殼膜芳香基團(tuán)拉曼信號(hào)的減弱也許也許更利于細(xì)胞黏附。

圖2 蛋殼膜在785 nm光源下的拉曼光譜圖

3 結(jié) 語(yǔ)

熟蛋殼在廢棄蛋殼中占有相當(dāng)?shù)谋壤瑸榱擞行Ю眠@部分資源，使用掃描電鏡和拉曼光譜儀初步觀(guān)察分析熟蛋殼膜的回收可利用性。經(jīng)過(guò)高溫烹煮，熟蛋殼膜發(fā)生了熱變性，其形貌和理化性能相應(yīng)發(fā)生改變。輕微溶脹的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和部分表面分子基團(tuán)的氧化并不制約熟蛋殼作為組織工程材料的適用性。我們推測(cè)熟蛋殼膜的熱變性可能更利于其與細(xì)胞的互作，值得進(jìn)一步分析研究。

[1] 范志紅. 雞蛋怎么吃最健康 [N]. 百科知識(shí) 2012(5):36-37.

[2] 楊 理, 閆清華, 馬孝琴, 等. 雞蛋殼再資源化的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用前景 [J]. 農(nóng)產(chǎn)品加， 2009(10):136-138.

[3] Tsai W T, Yang J M, Lai C W,etal. Characterization and adsorption properties of eggshells and eggshell membrane [J]. Bioresource Technology, 2006, 97:488-493.

[4] 狄 伶, 李 威, 何 琳. 久置蛋殼及其殼膜超微結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀(guān)察 [J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2012,31(10):299-301.

[5] 胡成西. 蛋殼的x-射線(xiàn)衍射實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 光散射學(xué)報(bào) 2006,18(3):282-287.

[6] 李琦章, 章玲玲, 章世元, 等. 中國(guó)6個(gè)地方雞種蛋殼質(zhì)量和超微結(jié)構(gòu)的比較 [J]. 遺傳育種, 2011,47(21):6-11.

[7] 盧 雁, 李向榮. 蛋白質(zhì)變性機(jī)理與變性時(shí)的熱力學(xué)參數(shù)研究進(jìn)展 [J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2005,17(5):906-910.

[8] 劉 珊, 劉曉艷. 熱變性對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的影響 [J]. 中國(guó)食品添加劑, 2016(6):108-112.

[9] 吳序櫟, 朱倩倩, 成小娟, 等. 光譜法研究雞蛋溶菌酶熱變性與免疫原性的關(guān)系 [J].分析化學(xué)研究報(bào)告, 2011,39(2):198-202.

[10] 張 雁, 尹利輝, 馮 芳. 胱氨酸、半胱氨酸及乙酰半胱氨酸的傅里葉變換拉曼光譜研究 [J]. 中國(guó)藥事, 2010，24(5):447-449.

[11] 趙群金, 徐桂端, 顏承農(nóng), 等. 生物熱分析研究1.四種天然氨基酸熱分解機(jī)理 [J]. 氨基酸和生物資源, 1997,19(4):6-9.

[12] 狄 伶, 何 琳. 雞蛋外殼膜的拉曼光譜觀(guān)察[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2012,31(10):296-298.

[13] 田 悅, 杜軍保. 二硫鍵和巰基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能中的作用及分析方法 [J]. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2007, 22(19):1499-1501.

[14] 湛海玲, 郭藝雯, 于偉東. 人工角蛋白膜的成分及致密性表征 [J]. 材料導(dǎo)報(bào)(研究篇), 2009，23(12):97-100.

[15] Carey P R. Biochemical applications of raman and resonance raman spectroscopies. A subsidiary of Harcourt brace Jovanovich [M]. New York: Acadamic Press, 1982.

[16] Bandekar J, Krimm S. Vibrational analysis of peptides, polypeptide, and proteins. VI. Assignment of β-turn modes in insulin and other proteins [J]. Biopolymers, 1980，19(1):31-36.

Microstructure Analysis of Cooked Eggshell Membrane and Its Raman Spectroscopy Detection

DILing

(Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Cooked eggshells occupy a considerable proportion of waste eggshells. After cooking, eggshell membranes thermal denaturize, physical and chemical properties change. In order to effectively use cooked eggshell membranes, we tested its microstructure and surface molecular groups. The microstructure and surface molecular groups of cooked eggshell membranes were detected, the recycling availability was preliminarily evaluated. By mimicking the cooking process cooked eggshell membranes were prepared. The microstructure was detected by SEM. The surface molecular groups were detected by Raman spectroscopy. It showed that cooked eggshell membranes remained fibrous mesh structure with slight swelling fibers, while the fibers did not collapse into pieces. The surface molecular groups decreased and it was mainly protein conformational change. We concluded that cooked eggshell membranes have recyclable availability.

cooked eggshell membrane; Raman micro-spectroscopy; microstructure

2014-08-01

狄 伶(1981-)，女，回族，寧夏固原人，博士，助理研究員，研究方向：醫(yī)用生物材料。

Tel.:021-34206175-221；E-mail：di_l@sjtu.edu.cn

O 657.37

A

1006-7167(2015)05-0039-03