正交試驗優(yōu)選虎杖總黃酮的提取工藝

陳林莉，方繼德，黎莉*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

正交試驗優(yōu)選虎杖總黃酮的提取工藝

陳林莉1，2，方繼德1，2，黎莉1，2*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

為了比較虎杖總黃酮的超聲法和冷浸法的提取效果，考察了乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間對虎杖總黃酮的影響，采用正交試驗，分別對超聲提取和冷浸提取虎杖總黃酮的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化.運用spss 19.0軟件，對正交試驗的數(shù)據(jù)進行了分析.結(jié)果表明，對虎杖總黃酮提取率影響最大的為料液比，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時間對其也有一定影響.虎杖中總黃酮最佳的提取工藝為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，超聲提取10m in.在該條件下，總黃酮提取率為19.31%.與冷浸法比較，超聲法提取虎杖中總黃酮具有較高的提取率，對進一步開發(fā)利用虎杖中總黃酮具有一定的指導(dǎo)作用.

虎杖；總黃酮；正交試驗；超聲法

0 引言

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根.我國大部分地區(qū)均產(chǎn)，主產(chǎn)于江蘇、江西、山東、四川等地［1］.虎杖具有瀉下、祛痰止咳、降壓、止血、鎮(zhèn)痛等藥理作用，它的主要成分包括虎杖苷、黃酮類、大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、多糖.據(jù)文獻報道，黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛、利膽保肝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)等作用［2－3］.現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物具有良好的抗病毒作用［4－5］.本研究采用正交試驗法，分別對超聲法和冷浸法提取虎杖總黃酮的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，同時對兩種提取方法的效果作了比較，為虎杖總黃酮的進一步開發(fā)利用奠定了一定的實驗基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ－250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF－6090真空干燥箱（上?，槴\實驗設(shè)備有限公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）.虎杖購于武漢市傳奇春天大藥房，產(chǎn)地四川，經(jīng)武漢工程大學(xué)黎莉教授鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根；蘆丁對照品（供UV法測定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080－201409）；其余試劑均為分析純.

1.2 正交試驗設(shè)計

通過預(yù)實驗，選定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，虎杖總黃酮含量為考察指標(biāo)，按照L9（33）正交表設(shè)計，超聲提取因素水平表見表1，冷浸提取因素水平表見表2.

表1 超聲提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction

表2 冷浸提取因素水平Table 2 Factors and levels of cold soak extraction

1.3 總黃酮含量測定

1.3.1 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品21.6 mg，加少量質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解后置于100 mL容量瓶中并定容，搖勻，即得蘆丁對照品溶液的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL－1.

1.3.2 測定吸收波長的確定精密量取上述蘆丁對照品溶液1mL，置于25mL容量瓶中，加蒸餾水至6mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液1mL，充分搖勻后靜置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%A l（NO3）3溶液1mL，搖勻，靜置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液10mL，再加蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15min，以未加蘆丁對照品試液作空白對照，于400~800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果顯示在500 nm處有最大吸收峰，故選擇500 nm為測定波長.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取蘆丁對照品溶液0、1、2、3、4、5、6m L，按照“1.3.2”步驟操作，以未加蘆丁對照品的試液作空白對照，在500 nm處測吸光度，縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過擬合得線性回歸方程為：A＝12.282C－0.020 1，R2＝0.999 6.結(jié)果表明蘆丁對照品在0.008～0.048mg·mL－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好.

1.3.4 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取干燥過孔徑0.425mm篩虎杖約1.00 g，按正交試驗表中條件提取，提取液過濾后定容至100mL容量瓶中，即得供試品溶液.

1.3.5 樣品含量測定精密量取上述供試品溶液0.5mL，按“1.3.3”項下方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程可計算總黃酮含量.

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗精密量取同一供試品溶液6份，每份0.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按“1.2.3”項下方法測定吸光度.結(jié)果，RSD＝1.456%，表明該方法有較好的精密度.

1.4.2 穩(wěn)定性試驗精密量取供試品溶液0.5mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.3.3”項下方法每隔5 min測定一次吸光度，共測6次.結(jié)果，RSD＝1.185%，表明樣品的穩(wěn)定性良好.

1.4.3 重復(fù)性試驗平行制備6份供試品溶液，按“1.3.3”項下方法測定吸光度.結(jié)果，RSD＝1.857%，表明該方法重復(fù)性較好.

1.4.4 加樣回收率試驗精密量取已知含量的供試品溶液6份，每份0.25mL，分別精密加入一定量的蘆丁對照品溶液，按“1.3.3”項下方法測定吸光度.結(jié)果，平均回收率為99.208%，RSD＝0.988%，表明該方法回收率高.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗結(jié)果及分析

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4.

由表3和表4得出，超聲法中RB＞RA＞RC，表明影響總黃酮提取率的因素順序為料液比＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時間.可知對總黃酮提取率的影響較大的是料液比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提取時間對總黃酮提取率的影響較小，但由于試驗次數(shù)較少，均未見顯著性差異.因此，超聲法最佳提取工藝為A3B3C1，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，提取時間10 min.

冷浸法中RB＞RA＞RC，表明影響總黃酮提取率的因素順序為料液比＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時間.可知對總黃酮提取率的影響較大的因素為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比，提取時間對總黃酮提取率的影響較小，但由于試驗次數(shù)較少，均未見顯著性差異.因此，冷浸法最佳提取工藝為A3B3C2，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，提取時間24 h.

由上述實驗結(jié)果可知，超聲法和冷浸法對總黃酮提取率的影響因素相似.但超聲法提取效果優(yōu)于冷浸法，且超聲提取時間較短，故虎杖總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、料液比為1∶50、超聲提取10min.

2.2 驗證試驗

準(zhǔn)確稱取干燥虎杖（過孔徑0.425 mm篩）約1.00 g，按超聲法最佳提取工藝A3B3C1平行操作3次，其總黃酮平均提取率為19.31%，RSD＝1.16%.驗證試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，表明該提取工藝穩(wěn)定可行.

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

3 結(jié)語

本實驗通過正交試驗分別考察了虎杖總黃酮的超聲法和冷浸法提取提取工藝，比較兩種總黃酮提取的工藝可以看出，超聲法提取效果優(yōu)于冷浸法，并獲得虎杖總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50、超聲提取10 min.在該條件下，總黃酮提取率為19.31%.本實驗優(yōu)選的虎杖中總黃酮的提取工藝操作簡單、提取率高，并為虎杖中總黃酮的后續(xù)開發(fā)研究提供了一定的實驗基礎(chǔ).

［1］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007.

GAO Xue－min.Chinese m edicine［M］.Beijing：China Press of Traditional Chinese Medicine，2007.（in Chinese）

［2］朱丹，袁芳，孟坤，等.黃酮類化合物的研究進展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（6）：387－388.

ZHU Dan，YUAN Fang，MENG Kun，et al.Research progress of flavonoids［J］.China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2007，22（6）：387－388.（in Chinese）

［3］黃河勝，馬傳庚，陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2000，25（10）：589－590.

HUANG He－sheng，MA Chuan－geng，CHEN Zhi－wu.A progress in pharmacological research of flavonoids［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2000，25（10）：589－590.（in Chinese）

［4］TAITA S，SALVATIA A L，DESIDERIB N.Antiviral activity of substituted homoisoflavonoids on enteroviruses［J］.Antiviral Research，2006，72（3）：252－225

［5］KIATA T S，PIPPENB R，YUSOF R，et al.Inhibitory activity of cyclohexenyl chalcone derivativsand flavonoids of fingerroot，Boesenbergiarotunda（L.），towards dengue－2 virus NS3 protease［J］.Bioorganic＆Medicinal Chem istry Letters，2006，16（12）：3337－3340.

Optim izing extraction technology of total flavonoids from Polygonum cuspidatum by orthogonal experiment

CHEN Lin－li1，2，F(xiàn)ANG Ji－de1，2，LI Li1，2
1.School of C hemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Key Laboratory for Green Chemical Process ofMinistry of Education，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

To compare the extraction rates between the ultrasonic method and the cold soak method of total flavonoids from Polygonum cuspidatum，the effects of ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rateswere explored.And the technological parameters of the ultrasonic method and the cold soakmethod were optimized by orthogonal experiment.Using software spss 19.0，the data of the orthogonal experiment were analyzed.The results show that the effect of solid－liquid ratio on the extraction rates of total flavonoids from Polygonum cuspidatum is the biggest，followed by the ethanol concentration and the extraction time.The optimal extraction conditions are ethanol concentration of 80%，solid－liquid ratio of 1∶50 and ultrasonic extraction of 10 min.Under the condition，the extraction rate of total flavonoids is 19.31%.Compared with the cold soak method，the ultrasonic method has a higher extraction rate，which is helpful to the further development and use of total flavonoids in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；total flavonoids；orthogonal experiment；ultrasonic method

TB35

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.12.002

1674－2869（2015）12－0006－04

本文編輯：張瑞

2015－11－02

武漢工程大學(xué)研究生教育創(chuàng)新基金（CX2014022）

陳林莉（1991－），女，湖北黃岡人，碩士研究生.研究方向：中藥活性成分及制劑.*通信聯(lián)系人