一種基于感光干膜-銦錫氧化物電極的簡易細(xì)胞阻抗傳感器實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息同時檢測*

李 遠(yuǎn),胡 帆,廖 娟,胡禮儀,劉北忠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

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一種基于感光干膜-銦錫氧化物電極的簡易細(xì)胞阻抗傳感器實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息同時檢測*

李 遠(yuǎn),胡 帆,廖 娟,胡禮儀,劉北忠*

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

加工一種基于感光干膜-銦錫氧化物DFP-ITO(Dry Film Photoresist-Indium Tin Oxide)電極的細(xì)胞阻抗生物傳感器并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息同時檢測。35 μm厚的感光干膜層壓在ITO導(dǎo)電玻璃表面上作為絕緣層,通過照相制版技術(shù)在感光干膜絕緣層上蝕刻不同直徑圓孔;以DFP-ITO作為工作電極,通過夾具和測量小池與Ag/AgCl參比電極、Pt絲對電極相連構(gòu)成三電極阻抗測量系統(tǒng);考察了不同直徑DFP-ITO工作電極阻抗譜特征;通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察了感光干膜細(xì)胞生物相容性;通過光學(xué)顯微鏡和阻抗譜技術(shù)分別對接種在DFP-ITO電極上人肺癌細(xì)胞株A549粘附、增殖過程中的形態(tài)學(xué)和阻抗信息進(jìn)行檢測和分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同直徑DFP-ITO電極具有相似的阻抗特性;充分固化的感光干膜表面適宜A549細(xì)胞粘附且無明顯的細(xì)胞毒性;基于DFP-ITO電極構(gòu)建的細(xì)胞阻抗傳感器能夠通過光學(xué)顯微鏡獲取A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù),同時通過阻抗譜技術(shù)能夠解析A549細(xì)胞粘附、增殖過程中的細(xì)胞質(zhì)膜電容、細(xì)胞-細(xì)胞間隙電阻、細(xì)胞-ITO電極間隙電阻變化。本文發(fā)展了基于DEP-ITO電極的細(xì)胞阻抗傳感器結(jié)構(gòu)簡單,可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息的雙通道獲取,未來可用于細(xì)胞生理病理學(xué)行為和藥物細(xì)胞毒性研究。

生物傳感器;電化學(xué)阻抗檢測;感光干膜;銦錫氧化物;阻抗;細(xì)胞形態(tài)學(xué)

細(xì)胞阻抗傳感器作為一種具有連續(xù)性、無侵襲性特點(diǎn)的體外細(xì)胞分析技術(shù)能夠?qū)?xì)胞粘附、增殖、凋亡等生物學(xué)行為進(jìn)行檢測[1-3],在藥物篩選[4]、毒物測試[5]、細(xì)胞生理參數(shù)分析[6]等領(lǐng)域中得到廣泛研究及應(yīng)用。細(xì)胞阻抗傳感器技術(shù)最先由Giaever和Keese等報(bào)道[7],該技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞阻抗生物傳感器由一對金材質(zhì)的雙電極系統(tǒng)構(gòu)建,包括一個面積為250μm直徑的工作電極和一個大面積的對電極。當(dāng)細(xì)胞在電極表面發(fā)生形態(tài)學(xué)改變時,細(xì)胞作為具有頻率依賴性的電學(xué)元件,它的存在導(dǎo)致系統(tǒng)的阻抗譜發(fā)生改變,通過對系統(tǒng)阻抗譜進(jìn)行解析來獲取細(xì)胞對應(yīng)的生物學(xué)行為,該技術(shù)被稱為電子細(xì)胞-基底阻抗傳感技術(shù)ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)。盡管基于ECIS技術(shù)的細(xì)胞阻抗傳感器具有測量細(xì)胞-細(xì)胞粘附、細(xì)胞-基質(zhì)粘附、細(xì)胞膜性質(zhì)等功能而被廣泛報(bào)道[8-9],然而以貴金屬金作為電極材料,不但成本高,而且透光性差,限制了基于光學(xué)手段的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

銦錫氧化物(ITO)是一種具有良好透光性、生物相容性的導(dǎo)電材料,因此可作為一種電極材料構(gòu)建各種細(xì)胞生物傳感器[10-12]。ITO導(dǎo)電膜通過平面磁控技術(shù)濺射在玻璃表面,具有表面電阻均勻、良好透光率和熱穩(wěn)定性,市場上可獲得不同導(dǎo)電率的商品化ITO導(dǎo)電玻璃。ITO能夠在中性電解質(zhì)溶液中保持電勢穩(wěn)定性,因此可作為電極材料檢測培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞的電學(xué)特性,同時ITO電極材料良好的透光性能與光學(xué)顯微鏡集成,通過數(shù)字圖像技術(shù)獲取ITO電極上細(xì)胞的形態(tài)學(xué)信息[13]。此外,Gross等[14]將聚硅氧烷樹脂涂覆的ITO微電極用于記錄神經(jīng)元細(xì)胞峰電位;CHoi C K等[11]通過光刻技術(shù)和反應(yīng)離子蝕刻技術(shù)加工了光學(xué)透明的ITO氮化硅電極作為內(nèi)皮細(xì)胞阻抗生物傳感器。研究發(fā)現(xiàn)ITO電極材料比金電極具有更優(yōu)的透光性,能夠檢測細(xì)胞松弛素D對豬肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的響應(yīng)行為。盡管上述研究報(bào)道了ITO電極材料在細(xì)胞阻抗生物傳感器的應(yīng)用價(jià)值,但I(xiàn)TO電極加工需依賴昂貴的濺射和光刻設(shè)備,且工藝復(fù)雜,限制了ITO電極在細(xì)胞阻抗生物傳感器的制備及推廣。

感光干膜作為一種光聚合物材料主要應(yīng)用于印刷電路板工藝。相對于液體光刻膠,感光干膜具有諸多優(yōu)勢,如良好的適應(yīng)性,基材粘附性、平整性、感光材料均勻分布性、低曝光功耗及低成本[15]。更為重要的是,感光干膜光刻不需要超潔凈空間和昂貴的光刻設(shè)備,作為液態(tài)光刻膠的替代物還可應(yīng)用在微流體通道加工[16]、電鑄模具[17]等。

本文提出了一種基于感光干膜的ITO電極加工工藝,并將制備的感光干膜-ITO(DFP-ITO)電極作為細(xì)胞阻抗傳感器以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息的雙通道獲取。為此,首先表征了不同直徑的DFP-ITO電極阻抗特征,其次通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對感光干膜細(xì)胞生物相容性進(jìn)行評價(jià);在此基礎(chǔ)上,通過光學(xué)顯微鏡和電化學(xué)阻抗譜技術(shù)分別獲取了DFP-ITO電極表面上人肺癌細(xì)胞株A549粘附和增殖過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息。

1 方法和材料

1.1 感光干膜ITO電極加工

ITO導(dǎo)電玻璃購于珠海凱為光電科技有限公司(中國),ITO導(dǎo)電膜厚(220±30)nm,面電阻≤7 Ω/m2,玻璃基底厚度為1.1 mm。ITO導(dǎo)電玻璃分別用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗15 min,烘干待用。感光干膜型號為HQ-6100,購于長興化學(xué)工業(yè)股份有限公司,感光層厚度為35 μm,是一種低成本負(fù)性光刻膠。DFP-ITO電極加工流程示意如圖1所示:①感光干膜通過辦公覆膜機(jī)(100 ℃)壓貼在導(dǎo)電玻璃ITO膜表面,目測感光干膜與ITO膜緊密貼附且兩者間無氣泡;②矢量圖繪制軟件Coreldraw 12.0(Corel公司,Canada)繪制出ITO電極和引線接口圖案,通過噴墨打印機(jī)打印(ESPON 1390,Japan)以2 880 dpi分辨率打印在透明膠片上制成光掩膜,透過光掩膜對感光干膜進(jìn)行紫外照射30 s;③將照射后的感光干膜在30 ℃下用1%的碳酸鈉顯影5 min,使未經(jīng)紫外照射的ITO區(qū)域暴露,獲得DFP-ITO電極。隨后將電極用去離子水沖洗2次,60 ℃烘干,紫外照射60 s使感光膠完全固化。

圖1 DFP-ITO電極加工流程示意圖

1.2 A549細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌上皮細(xì)胞A549由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞用含10%胎牛血清(杭州四季青)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco)中在37 ℃,5%二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期,0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化細(xì)胞,1 500 rad/min離心4 min,按1∶3進(jìn)行傳代。本文使用的A549細(xì)胞傳代次數(shù)為4至10代,使用時將A549細(xì)胞用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液制成不同濃度的細(xì)胞懸液。

1.3 感光干膜細(xì)胞相容性檢測

感光干膜的細(xì)胞生物相容性采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)流程:將感光干膜剪切為面積為8 mm×8 mm方片,按上述DFP-ITO電極加工流程對感光干膜進(jìn)行紫外照射、顯影處理后,放置于96孔板內(nèi),70%(v/v)濃度乙醇消毒。將100 μL A549細(xì)胞以濃度為2.5×105cells/mL接種在感光干膜表面,37 ℃、5%濃度二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁,用濃度為10 μmol/L羅丹明123(Sigma)的PBS溶液對細(xì)胞線粒體進(jìn)行熒光染色,倒置熒光顯微鏡(IX-71,奧林巴斯)觀察感光干膜表面上貼壁的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞熒光圖像;細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)流程:將100 μL A549細(xì)胞以濃度為5×104cells/mL密度接種在96孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h使細(xì)胞貼壁。隨后將感光干膜浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為實(shí)驗(yàn)組,同時以不含感光干膜的細(xì)胞孔為陰性對照組,只含感光干膜不含細(xì)胞的孔為空白組,每組設(shè)5個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48和72 h后,將感光干膜從孔中取出,并在每孔中加入10 μL Cell Counting Kit-8(CCK-8)分析液(碧云天生物技術(shù)公司),輕搖混勻,37%、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,多功能酶標(biāo)儀(Varioskan,Thermo Scientific)測定溶液在450 nm的吸光度。感光干膜細(xì)胞毒性定義為:細(xì)胞毒性(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 DFP-ITO電極上細(xì)胞形態(tài)學(xué)和電化學(xué)阻抗譜檢測

為便于細(xì)胞培養(yǎng)及電化學(xué)阻抗譜測量,將DFP-ITO電極和測量小池通過聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)夾具固定,使DFP-ITO電極置于測量小池底部,測量小池體積為500 μL。DFP-ITO電極測量小池組裝示意圖和實(shí)物圖如圖2所示。

圖2 DFP-ITO電極細(xì)胞培養(yǎng)及電化學(xué)阻抗譜測量小池,測量小池含4個獨(dú)立測量單元

在細(xì)胞加載到DFP-ITO電極前,用70%乙醇對測量小池消毒5 min,隨后用滅菌去離子水清洗測量小池2次;將200 μL A549細(xì)胞懸液以濃度2.5×105cells/mL加載到含DFP-ITO電極的測量小池內(nèi),放置在超凈臺內(nèi)室溫條件下靜止30 min后使細(xì)胞均勻沉降到電極表面,隨后放入37 ℃,5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),分別在2 h、24 h、48 h后將DFP-ITO電極取出放置到倒置熒光顯微鏡載物臺上進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和圖像獲取。

DFP-ITO電極上A549細(xì)胞阻抗信息通過電化學(xué)阻抗譜EIS(Electrochemical Impedance Spectroscopy)技術(shù)進(jìn)行測量。電化學(xué)阻抗譜測量采用了CS315電化學(xué)工作站(武漢科斯特儀器有限公司),電化學(xué)阻抗譜測量系統(tǒng)采用三電極系統(tǒng),以接種了細(xì)胞的DFP-ITO電極作為工作電極,將Ag/AgCl絲參比電極(直徑:0.5 mm,長度:10 mm)和鉑絲對電極(直徑:1.0 mm,長度:10 mm)插入測量小池內(nèi)進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測量。測量以0.01 mol/L PBS作為支持電解質(zhì)溶液,以幅值為10 mV正弦波為激勵信號,掃描頻率范圍為1 Hz～105Hz,阻抗譜測量數(shù)據(jù)用ZView 2.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果及討論

2.1 DFP-ITO電極的加工及阻抗表征

在細(xì)胞阻抗傳感器研究中,金電極具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、生物相容性而被廣泛用于檢測細(xì)胞粘附、增殖、腫瘤細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞對藥物響應(yīng)等信息[1-4,6]。其基本策略是將測量得到的阻抗數(shù)據(jù)譜數(shù)據(jù)與理論等效電路擬合來間接獲取細(xì)胞信息,具有無侵入性、連續(xù)性檢測的優(yōu)點(diǎn)[18]。然而,金材料電極透光性差,限制了金材料電極上細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察[10-13]。而事實(shí)上,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)是一類重要的細(xì)胞生物學(xué)行為信息,通過形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)能夠獲取細(xì)胞的增殖、凋亡、亞細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞蛋白表達(dá)等信息[19]。相比阻抗學(xué)數(shù)據(jù),形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)更為直觀、更易理解。因此,構(gòu)建一種能夠同時獲取細(xì)胞的阻抗信息和形態(tài)學(xué)的細(xì)胞阻抗生物傳感器將有助于提高生物傳感器的準(zhǔn)確性和多功能性。

ITO電極由于具有良好的導(dǎo)電性和透光性,因此具有作為電極材料具有實(shí)現(xiàn)細(xì)胞阻抗譜信息和形態(tài)學(xué)信息同時檢測的潛力而被研究報(bào)道[10-13]。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞阻抗譜信息采集,需要加工ITO工作電極。加工ITO電極主要采用兩類方法:一類是top-down途徑,即在ITO板上通過化學(xué)刻蝕加工出ITO電極[11];另一類是bottom-up途徑(approach),即在圖形化的基底上通過濺射方式加工出ITO電極[12]。然而,蝕刻和濺射形成的ITO電極接觸電阻較大,導(dǎo)致細(xì)胞阻抗傳感器靈敏度降低;另外,蝕刻和濺射途徑加工ITO電極采用液態(tài)光刻膠作為電極圖像犧牲層,以光刻技術(shù)為基礎(chǔ),加工工藝、成本較高。表1為文獻(xiàn)報(bào)道的采用ITO微電極構(gòu)建細(xì)胞阻抗生物傳感器涉及到的加工工藝及參數(shù)比較,可見本研究發(fā)展的以感光干膜作為絕緣層,以商品化ITO導(dǎo)電玻璃為基底,通過對感光干膜進(jìn)行選擇性紫外照射、顯影獲得ITO電極的方法不需要對ITO進(jìn)行刻蝕,降低了工藝復(fù)雜性和ITO電極的接觸電阻,且能夠獲得最小直徑為100μm的ITO電極。

表1 ITO電極構(gòu)建細(xì)胞阻抗生物傳感器比較

圖3 不同直徑DFP-ITO電極圖片和阻抗譜特征

構(gòu)建細(xì)胞阻抗生物傳感器需要考慮一系列重要參數(shù),其中工作電極面積是影響細(xì)胞阻抗傳感器靈敏度重要參數(shù)之一[20]。本研究首先加工了0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm和2 mm 4種不同直徑的DFP-ITO電極,結(jié)果如圖3(a)所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),0.5 mm直徑感光干膜ITO電極與參比電極間在支持電解質(zhì)溶液中出現(xiàn)過高的開路電位(open circuit potential),提示0.5mm直徑的DFP-ITO電極與電解質(zhì)溶液接觸阻抗大,推測其原因與感光干膜厚度和疏水性質(zhì)有關(guān)。圖3(b)為直徑分別為1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm的DFP-ITO電極阻抗譜,顯示不同直徑電極間的阻抗具有相似的頻率依賴特性,其整個頻率范圍內(nèi)電極阻抗值與直徑成反向關(guān)系,其原因在于ITO電極與電解質(zhì)溶解界面形成的電荷雙分子層有關(guān)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的金電極結(jié)果相似[20-21]。當(dāng)細(xì)胞在ITO電極表面粘附與鋪展時,由于面積小的ITO電極對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)出更高的靈敏性[20]。因此后續(xù)細(xì)胞阻抗測量實(shí)驗(yàn)選擇直徑為1.0 mm ITO電極。

2.2 感光干膜細(xì)胞生物相容性評價(jià)

感光干膜是一種基于丙烯酸酯的光聚合物,除應(yīng)用于PCB工藝中,在其他細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中也有報(bào)道,如微流控芯片[15]。然而,感光干膜的細(xì)胞生物相容性卻未見報(bào)道。本研究從細(xì)胞粘附和細(xì)胞毒性考察了感光干膜細(xì)胞生物相容性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4(a)為A549細(xì)胞接種在感光干膜24 h細(xì)胞發(fā)生粘附的明場和熒光顯微圖片,結(jié)果顯示細(xì)胞能在感光干膜粘附并鋪展,羅丹明123對細(xì)胞線粒體熒光染色顯示粘附在感光干膜表面A549細(xì)胞具有良好的生物活性,該結(jié)果說明感光干膜可為A549細(xì)胞提供適宜的生長界面。

圖4(b)為兩種不同處理的感光干膜的細(xì)胞毒性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),未經(jīng)過后曝光步驟的感光干膜細(xì)胞毒性顯著高于經(jīng)過后曝光處理的感光干膜,且隨孵育時間延長,細(xì)胞毒性效率更為明顯,孵育72h兩種感光干膜的細(xì)胞毒性間比值約為4.86。該結(jié)果說明感光干膜的后曝光是影響其細(xì)胞毒性的關(guān)鍵因素,原因在于后曝光步驟能夠使感光分子完全聚合,避免未聚合的光敏分子在細(xì)胞培養(yǎng)時釋放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)液對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。同時,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過后曝光處理的感光干膜在培養(yǎng)液中浸泡24 h后開始出現(xiàn)軟化、表面開始皺褶,而后曝光處理的感光干膜形態(tài)未發(fā)生改變(數(shù)據(jù)未給出)。事實(shí)上,后曝光處理的感光干膜仍具有輕微的細(xì)胞毒性(72 h為12.6%),推測原因?yàn)楦泄飧赡の搅伺囵B(yǎng)液中蛋白分子對細(xì)胞生長造成輕微抑制。因此,細(xì)胞接種前用空白培養(yǎng)液對感光干膜進(jìn)行預(yù)孵育降低其對細(xì)胞生長抑制效應(yīng)。

圖4 感光干膜的細(xì)胞生物相容性

2.3 DFP-ITO電極上A549細(xì)胞粘附增殖行為的形態(tài)學(xué)和阻抗譜檢測

ITO作為電極材料構(gòu)建細(xì)胞阻抗生物傳感器最具吸引力的特點(diǎn)在于可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息的雙通道檢測。為對該技術(shù)進(jìn)行原理驗(yàn)證,本文構(gòu)建了基于DFP-ITO電極的細(xì)胞阻抗傳感器,并檢測了A549細(xì)胞的粘附、增殖過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息。圖5為A549細(xì)胞接種在ITO電極上2 h、24 h和48 h時的形態(tài)學(xué)顯微圖片,顯示A549細(xì)胞在ITO電極上均勻鋪展,通過顯微鏡能夠觀察到細(xì)胞的鋪展(2 h)、增殖(24 h)及細(xì)胞單層形成(48 h)。該結(jié)構(gòu)說明ITO作為電極材料適宜細(xì)胞粘附與增殖,其良好的透光性便于獲取細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。

當(dāng)A549細(xì)胞在DFP-ITO電極表面粘附和增殖時,細(xì)胞作為具有頻率依賴性的電學(xué)原件導(dǎo)致系統(tǒng)阻抗譜發(fā)生改變,因此可通過阻抗譜技術(shù)對DFP-ITO電極上細(xì)胞的粘附、增殖行為進(jìn)行檢測和解析。

圖5 利用光學(xué)顯微鏡觀察DFP-ITO電極表面的A549細(xì)胞分別在2 h、24 h和48 h時的形態(tài)學(xué)信息

圖6 DFP-ITO電極上細(xì)胞粘附增殖行為電化學(xué)阻抗譜檢測

圖6(a)為A549細(xì)胞接種在DFP-ITO電極上0、2 h、24 h和48 h對應(yīng)的電化學(xué)阻抗譜復(fù)平面圖,可見A549細(xì)胞在ITO電極上的增殖導(dǎo)致系統(tǒng)阻抗譜高頻部分發(fā)生改變。在復(fù)平面圖擴(kuò)展標(biāo)度(expanded scales)中更清楚顯示A549細(xì)胞增殖導(dǎo)致系統(tǒng)阻抗譜的高頻部分形成半圓,且隨著細(xì)胞增殖高頻部分半圓直徑增大。該結(jié)果說明電極界面上細(xì)胞增殖導(dǎo)致電極界面上離子電荷轉(zhuǎn)移過程速度減慢,其原因與細(xì)胞質(zhì)膜電容特征有關(guān)[22]。另外,在低頻區(qū)域,A549細(xì)胞的增殖未對系統(tǒng)阻抗譜產(chǎn)生明顯變化,其原因在于細(xì)胞在低頻部分其電學(xué)特性為典型絕緣體,電極與電解質(zhì)溶液的離子電流主要通過細(xì)胞間隙進(jìn)行轉(zhuǎn)移而未穿過細(xì)胞,因此阻抗譜的低頻區(qū)域不能夠反映出細(xì)胞行為學(xué)變化。

為進(jìn)一步分析DFP-ITO電極上不同階段A549細(xì)胞的容抗特性,本研究采用了文獻(xiàn)[18]報(bào)道的細(xì)胞等效電路模型,如圖6(b)所示。細(xì)胞等效電路由一個RC并聯(lián)電路和一個R元件串聯(lián)組成,其中,R′s理論上解釋為細(xì)胞-電極的間隙電阻,Rcell解釋為細(xì)胞-細(xì)胞電阻,Ccell解釋為細(xì)胞質(zhì)膜的電容效應(yīng)。通過曲線擬合技術(shù)將系統(tǒng)阻抗譜半圓部分與細(xì)胞等效電路模型進(jìn)行擬合,A549細(xì)胞不同生長階段等效電路元件值如圖6(c)所示。從結(jié)果可知,隨著A549細(xì)胞在ITO電極界面的粘附和增殖,Ccell值緩慢增加,而Rcell值和R′s值逐漸增加。形成細(xì)胞單層后Ccell值約為2.8 nF,Rcell值約為754 Ω,約為216 Ω。同時,當(dāng)A549細(xì)胞從貼壁后(2 h)至形成細(xì)胞單層(48 h)間,Rcell值持續(xù)增加說明細(xì)胞-細(xì)胞間的間隙逐漸縮小,細(xì)胞融合度增加;R′s值持續(xù)增加則提示細(xì)胞-ITO電極間距離縮小,細(xì)胞粘附強(qiáng)度增強(qiáng)。相反,Ccell值對A549細(xì)胞的增殖至形成細(xì)胞單層的形態(tài)學(xué)變化不敏感。此外,仔細(xì)分析數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞接種(0 h)至細(xì)胞貼壁(2 h)間的各元件值改變較小,說明本系統(tǒng)對于該過程的細(xì)胞生物學(xué)行為檢測靈敏度不足,其原因在于本系統(tǒng)使用ITO電極面積(0.785 mm2)較大,A549細(xì)胞在ITO電極表面粘附不足以改變系統(tǒng)的阻抗譜。因此,在不影響電極透光性的前提下通過電極修飾提高檢測細(xì)胞阻抗傳感器檢測靈敏度還正在研究中。

綜上結(jié)果分析可知,以DFP-ITO電極為基礎(chǔ)構(gòu)建的細(xì)胞阻抗傳感器能夠耦合光學(xué)顯微成像技術(shù)和電化學(xué)阻抗譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗信息的同時檢測。在同一電極上獲取的細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和阻抗信息互為補(bǔ)充、驗(yàn)證,提高細(xì)胞信息檢測的全面性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種結(jié)構(gòu)簡單、易于加工的DFP-ITO電極細(xì)胞阻抗傳感器,通過對A549細(xì)胞粘附、增殖的形態(tài)學(xué)和阻抗信息的測量對構(gòu)建細(xì)胞阻抗傳感系統(tǒng)進(jìn)行原理性驗(yàn)證。研究采用感光干膜作為絕緣層降低ITO電極加工難度、成本和時間,且感光干膜表面適宜A549細(xì)胞粘附,對A549細(xì)胞生長且無明顯細(xì)胞毒副作用;細(xì)胞阻抗傳感器以ITO作為電極,通過光學(xué)顯微鏡可電極上A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)信息;利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)和細(xì)胞等效電路擬合能夠檢測DFP-ITO電極上A549細(xì)胞的粘附和增殖過程中阻抗信息;本文發(fā)展的DFP-ITO電極細(xì)胞阻抗傳感器結(jié)構(gòu)簡單、易于加工,能夠同時獲取細(xì)胞形態(tài)學(xué)和阻抗特征值,可在普通實(shí)驗(yàn)室推廣并用于細(xì)胞生理病理行為、藥物篩選等研究領(lǐng)域。

[1] Pradhan R,Rajput S,Mandal M,et al. Electric Eell-Substrate Impedance Sensing Technique to Monitor Cellular Behaviours of Cancer Cells[J]. RSC Advances,2014,4(19):9432-9438.

[2] Nguyen T A,Yin T I,Reyes D,et al. Microfluidic Chip with Integrated Electrical Cell-Impedance Sensing for Monitoring Single Cancer Cell Migration in Three-Dimensional Matrixes[J]. Analytical Chemistry,2013,85(22):11068-11076.

[3] Tran T B,Nguyen P D,Um S H,et al. Real-Time MonitoringinvitroCellular Cytotoxicity of Silica Nanotubes Using Electric Cell-Substrate Impedance Sensing(ECIS)[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology,2013,9(2):286-290.

[4] Liu Q,Yu J,Xiao L,et al. Impedance Studies of Bio-Behavior and Chemosensitivity of Cancer Cells by Micro-Electrode Arrays[J]. Biosensors and Bioelectronics,2009,24(5):1305-1310.

[5] 蘇凱麒,鄒玲,王琴,等. 基于細(xì)胞阻抗傳感器的腹瀉性毒素檢測系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào),2014,27(3):283-288

[6] 王天星,黎洪波,蘇凱麒,等. 基于細(xì)胞電阻抗傳感器的細(xì)胞多生理參數(shù)分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào),2014,27(12):1589-1595.

[7] Giaever I,Keese C R. Monitoring Fibroblast Behavior in Tissue Culture with an Applied Electric Field[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,1984,81(12):3761-3764.

[8] Heijink I H,Brandenburg S M,Noordhoek J A,et al. Characterisation of Cell Adhesion in Airway Epithelial Cell Types Using Electric Cell-Substrate Impedance Sensing[J]. European Respiratory Journal,2010,35(4):894-903.

[9] Asphahani F,Zhang M. Cellular Impedance Biosensors for Drug Screening and Toxin Detection[J]. Analyst,2007,132(9):835-841.

[10] Choi C K,Margraves C H,Jun S I,et al. Opto-Electric Cellular Biosensor Using Optically Transparent Indium Tin Oxide(ITO)Electrodes[J]. Sensors,2008,8(5):3257-3270.

[11] Choi C K,English A E,Jun S I,et al. An Endothelial Cell Compatible Biosensor Fabricated Using Optically Thin Indium Tin Oxide Silicon Nitride Electrodes[J]. Biosensors and Bioelectronics,2007,22(11):2585-2590.

[12] Moore E,Rawley O,Wood T,et al. Monitoring of Cell GrowthinvitroUsing Biochips Packaged with Indium Tin Oxide Sensors[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2009,139(1):187-193.

[13] Choi C K,English A E,Kihm K D,et al. Simultaneous Dynamic Optical and Electrical Properties of Endothelial Cell Attachment on Indium Tin Oxide Bioelectrodes[J]. Journal of Biomedical Optics,2007,12(6):064028-064028-8.

[14] Gross G W,Wen W Y,Lin J W. Transparent Indium-Tin Oxide Electrode Patterns for Extracellular,Multisite Recording in Neuronal Cultures[J]. Journal of Neuroscience Methods,1985,15(3):243-252.

[15] Vulto P,Glade N,Altomare L,et al. Microfluidic Channel Fabrication in Dry Film Resist for Production and Prototyping of Hybrid Chips[J]. Lab on a Chip,2005,5(2):158-162.

[16] Stephan K,Pittet P,Renaud L,et al. Fast Prototyping Using a Dry Film Photoresist:Microfabrication of Soft-Lithography Masters for Microfluidic Structures[J]. Journal of Micromechanics and Microengineering,2007,17(10):N69-N74.

[17] Leech P W,Wu N,Zhu Y. Application of Dry Film Resist in the Fabrication of Microfluidic Chips for Droplet Generation[J]. Journal of Micromechanics and Microengineering,2009,19(6):065019.

[18] Karimullah A S,Cumming D R S,Riehle M,et al. Development of a Conducting Polymer Cell Impedance Sensor[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2013,176:667-674.

[19] Pasqualato A,Palombo A,Cucina A,et al. Quantitative Shape Analysis of Chemoresistant Colon Cancer Cells:Correlation between Morphotype and Phenotype[J]. Experimental Cell Research,2012,318(7):835-846

[20] Yeon J H,Park J K. Cytotoxicity Test Based on Electrochemical Impedance Measurement of HepG2 Cultured in Microfabricated Cell Chip[J]. Analytical Biochemistry,2005,341(2):308-315.

[21] Huang X,Greve D W,Nguyen D D,et al. Impedance Based Biosensor Array for Monitoring Mammalian Cell Behavior[C]//Sensors,2003,Proceedings of IEEE. IEEE,2003,1:304-309.

[22] Ding L,Hao C,Zhang X,et al. Carbon Nanofiber Doped Polypyrrole Nanoscaffold for Electrochemical Monitoring of Cell Adhesion and Proliferation[J]. Electrochemistry Communications,2009,11(4):760-763.

李 遠(yuǎn)(1985-),男,重慶醫(yī)科大學(xué),博士研究生,主要研究方向?yàn)槲⒘骺匦酒凹?xì)胞生物傳感器,liyuan_1985999@163.com;

劉北忠(1970-),男,重慶醫(yī)科大學(xué),教授,主要研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)微納米技術(shù)與系統(tǒng)、腫瘤分子診療靶點(diǎn)篩選等,lbzemail@163.com。

A Simple Cellular Impedance Biosensor Based on Dry FilmPhotoresist-Indium Tin Oxide Electrode for Detecting CellularMorphology and Impedance Information Simultaneously*

LIYuan,HUFan,LIAOJuan,HULiyi,LIUBeizhong*

(Central Laboratory of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 402160,China)

This study describes the fabrication of a simple cellular impedance biosensor based on dry film Photoresist-indium tin oxide(DFP-ITO)electrode for detecting the cellular morphology and impedance information simultaneously. A dry film photoresist layer of 35 microns thickness was laminated on the surface of the ITO conductive glass as an insulating layer,and then circular holes with different diameters were etched on the insulation layer by photolithography technique. The exposed ITO electrode,as a working electrode,was connected to an Ag/AgCl reference electrode and a Pt counter electrode through a clamp and a measuring pool to constitute a Three-electrode impedance measurement system. The impedance of the DFP-ITO electrodes was investigated by impedance spectroscopy technology. The biocompatibility of the dry film photoresist was investigated by experiments of cell adhesion and cell toxicity. The biological behavior information about cell adhesion and proliferation of the A549 lung cancer on the DFP-ITO electrode was analyzed by optical microscope and impedance spectroscopy technology respectively. Results showed that the DFP-ITO electrodes with different diameters had similar impedance characteristics. Fully cured dry film photoresist could provide an appropriate surface for A549 cell adhesion and had no obvious cytotoxicity. The cellular impedance sensor based on the DFP-ITO electrode could be used to obtain the morphological data and analyze the changes of the cytoplasm membrane capacitance,cell-cell gap resistance and cell-ITO electrode gap resistance during the process of adhesion and proliferation of A549 cell by optical microscope and impedance spectrum technology respectively. The cellular impedance biosensor based on DFP-ITO electrode has a simple structure and can realize the Dual-channel acquisition of cell morphology and impedance information. It can be used in the fields of cellular physiological and pathological behavior and drug cytotoxicity in the future.

biosensor;electrochemical impedance detection;dry film photoresist;indium tin oxide;impedance;cell morphology

項(xiàng)目來源:重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(cstc2012jjA10046);重慶市永川區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)平臺項(xiàng)目(Ycstc,2014bf5001);重慶市級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410631012);重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科研與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(201413)

2014-12-19 修改日期:2015-03-01

C:7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.06.001

TP212.3

A

1004-1699(2015)06-0779-08