FK228和雷帕霉素協(xié)同促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯*

彭曉丹， 諸夢露， 高綠芬, 劉婷婷， 劉 艷， 歐陽媛， 李若玢， 劉禮飛， 李 譯， 劉曉宇， 鄭曉鶴△, 林紹強(qiáng),△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325035； 2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632； 3浙江海正藥業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 臺州 318000)

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·論 著·

FK228和雷帕霉素協(xié)同促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯*

彭曉丹1▲， 諸夢露1▲， 高綠芬2, 劉婷婷1， 劉 艷2， 歐陽媛2， 李若玢2， 劉禮飛3， 李 譯3， 劉曉宇3， 鄭曉鶴3△, 林紹強(qiáng)1,2△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632；3浙江海正藥業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 臺州 318000)

目的： 探討組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)FK228和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)聯(lián)合應(yīng)用對體外人乳腺癌細(xì)胞株生長和凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制。方法: 以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435和MCF-7為研究對象，經(jīng)不同濃度的FK228和雷帕霉素處理后，磺酰羅丹明B(SRB)比色法檢測腫瘤細(xì)胞的生長抑制率，計(jì)算兩藥的聯(lián)合指數(shù)；Western blotting檢測乳腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白、周期調(diào)控蛋白以及核酸相關(guān)蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果: (1) FK228或雷帕霉素單獨(dú)使用時(shí)均抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑制率與時(shí)間、劑量呈正相關(guān)；當(dāng)總抑制率為50%～70%時(shí)聯(lián)合指數(shù)(CI)值小于1，提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)；(2) 聯(lián)合用藥后，凋亡蛋白表達(dá)較單藥使用組明顯升高(P<0.05)；同時(shí)，p-Akt 蛋白表達(dá)下降，活化的caspase-3表達(dá)上調(diào)；(3) 聯(lián)合用藥后，周期調(diào)控蛋白表達(dá)較單藥使用組明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；聯(lián)合用藥后出現(xiàn)更為顯著的H2AX的磷酸化和H3的乙酰化(P<0.05)。結(jié)論: FK228和雷帕霉素聯(lián)合給藥能協(xié)同促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，具有良好的抗腫瘤前景。

FK228； 雷帕霉素； 乳腺癌； 協(xié)同作用

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，是全世界排名第二的腫瘤疾病，每年有近50萬女性患者死于乳腺癌[1]。盡管乳腺癌的診斷和治療水平有很大的提高，但是乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然相對較高，這就需要我們進(jìn)行更多的研究，開發(fā)更好的治療方法用于乳腺癌的治療，提高患者的生存質(zhì)量和延長患者的生存期[2]。

FK228是從紫色素桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的環(huán)四肽類組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylases inhibitors，HDACi)，是新型的抗腫瘤藥物[3]。FK228能夠選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，改變細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致連接DNA的組蛋白乙酰化，使細(xì)胞周期停滯，同時(shí)能引起DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。在體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)K228單獨(dú)用藥對多種腫瘤細(xì)胞如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和前列腺癌細(xì)胞等具有很強(qiáng)的殺傷作用。體外研究結(jié)果表明，F(xiàn)K228與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合，表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效應(yīng)[5-6]。

雷帕霉素(rapamycin, Rapa)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的特異性抑制劑，是番薯鏈霉菌中提取出來的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑[7]。在動物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素是一種療效好，低毒，無腎毒性的新型免疫抑制劑并有抗腫瘤作用[8-9]。在乳腺癌治療中，mTOR抑制劑結(jié)合激素治療表現(xiàn)出顯著的治療效果[10]。mTOR信號通路PI3K-AKT-mTOR與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Kumar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K能夠維持DNA穩(wěn)定性以及修復(fù)DNA損傷。

FK228和雷帕霉素在影響DNA和調(diào)控細(xì)胞周期蛋白方面具有不同的抗腫瘤機(jī)制，由此我們推測兩者可能在抗腫瘤作用上具有協(xié)同作用。本文就FK228和雷帕霉素對乳腺癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了體外研究，并探究這2種藥物的協(xié)同作用，為臨床聯(lián)合用藥治療乳腺癌提供了一定的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

乳腺癌MDA-MB-435及MCF-7細(xì)胞株購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco；磺基羅丹明B鈉鹽、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、碘化丙啶(pyridine iodide, PI)、雷帕霉素購自Sigma；FK228由浙江海正藥業(yè)股份有限公司王繼棟博士饋贈；caspase-3 活性檢測試劑盒購自碧云天；Bcl-2 抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、cyclin D1抗體、cyclin E抗體、β-actin 抗體和鼠Ⅱ抗、兔Ⅱ抗均購自Santa Cruz；anti-acetyl-histone H3、anti-phospho-histone H2AX購自Millipore；cleaved-PARP購自Cell Signaling。

2 主要儀器

DL-CJ-1N醫(yī)用超凈工作臺；Olympus CK40倒置相差顯微鏡；Model550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；流式細(xì)胞儀(BD)；曝光儀(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435用含10% FBS的L15培養(yǎng)基、MCF-7用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。

3.2 磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB)比色法 MDA-MB-435、MCF-7以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為4組：FK228組、雷帕霉素組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)。FK228組藥物濃度以100 nmol/L為最高濃度，4倍梯度稀釋，設(shè)5個(gè)濃度；雷帕霉素組藥物濃度以1 800 nmol/L為最高濃度，2倍梯度稀釋，設(shè)5個(gè)濃度；聯(lián)合組為單獨(dú)給藥組的藥物聯(lián)合。各組各濃度分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物作用24 h、48 h、72 h后分別用SRB法檢測細(xì)胞抑制率，采用聯(lián)合指數(shù)( combination index，CI)表示。抑制率按公式：細(xì)胞的增殖抑制率(%)=[對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值]/對照組A值×100%。CI值的計(jì)算參見參考文獻(xiàn)[12-13]。

3.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期 MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，培養(yǎng)24 h后，用冷PBS 洗滌2 次，收集各組處理后的細(xì)胞，用冰預(yù)冷的75% 乙醇固定，PBS 洗滌、離心，加入含有0.1% RNaseA 的PBS 于37℃水浴1 h后用含10 mg /L PI的PBS染色至少20 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

3.4 Western blotting檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，用12% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉后，加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌，再加對應(yīng)的Ⅱ抗，孵育1 h，TBST 洗滌。加入ECL顯影液，用凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄。

3.5 Caspase-3活性檢測 MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，加入裂解液在冰上裂解細(xì)胞10 min。按照試劑盒操作說明加入各反應(yīng)體系，37℃孵化2 h，在405 nm處測定吸光度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 單獨(dú)應(yīng)用FK228與雷帕霉素和聯(lián)合應(yīng)用兩藥對乳腺癌細(xì)胞生長的影響

FK228在較低濃度就具有較強(qiáng)的殺傷作用，濃度增加，抑制率逐漸增強(qiáng)，并且聯(lián)合給藥組抑制率大于單獨(dú)給藥組(P<0.05)。FK228、雷帕霉素對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435、MCF-7體外的抑制作用隨時(shí)間推移抑制率增加，見圖1。

Figure 1.The inhibitory rate of MCF-7 and MDA-MB-435 treated with FK228,Rapa and FK228 combined with Rapa. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFk228+Papa.

圖1 FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞的抑制率

2 FK228與雷帕霉素合用的CI值

CI=(D)A/(Dx)A+(D)B/(Dx)B+(D)A×(D)B/[(Dx)A×(Dx)B]。其中(D) A 為藥物A在聯(lián)合應(yīng)用A、B兩藥產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)A藥的濃度；(D) B為藥物B在聯(lián)合應(yīng)用A、B兩藥產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)B藥的濃度；(Dx) A 為藥物A單獨(dú)產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)A藥的濃度；(Dx) B為藥物B單獨(dú)產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)B藥的濃度。CI值大于1時(shí)兩藥拮抗，小于1時(shí)協(xié)同。本實(shí)驗(yàn)中，在總抑制率為50%～70%時(shí)的CI值小于1，協(xié)同效應(yīng)顯著，由此顯示FK228與雷帕霉素的協(xié)同作用明顯，見圖2。

Figure 2.The CI of MCF-7 and MDA-MB-435 for the drug treatments at 30% effective dose(ED30), ED50 and ED70. Mean±SD.n=3.

圖2 在ED30、ED50和ED70時(shí)MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞的CI值

3 FK228和雷帕霉素聯(lián)合給藥促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡

蛋白水平檢測顯示，與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞中FK228和雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)誘導(dǎo)促凋亡蛋白cleaved-PARP表達(dá)增多，caspase-3活性升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，下游通路中Akt的磷酸化水平降低，聯(lián)合用藥時(shí)較單獨(dú)用藥更為顯著，見圖3。

4 FK228和雷帕霉素聯(lián)合給藥使乳腺癌細(xì)胞周期調(diào)控蛋白改變

蛋白水平檢測顯示，與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞中FK228和雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1有所降低，聯(lián)合用藥時(shí)較單獨(dú)用藥更為明顯，見圖4。流式結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中當(dāng)FK228單獨(dú)作用時(shí)出現(xiàn)了G2/M期的上升，而雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)并無G2/M期的上升，聯(lián)合用藥后G2/M期的上升較單獨(dú)用藥更為明顯，在MDA-MB-435細(xì)胞中FK228和雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)均出現(xiàn)了G2/M期的上升，聯(lián)合用藥后G2/M期的上升較單獨(dú)用藥更為明顯，見圖5、表1。綜上所述，F(xiàn)K228和雷帕霉素聯(lián)合給藥后乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)更加顯著的G2/M期阻滯。

Figure 3.The effect of FK228(2 nmol/L) or/and Rapa(500 nmol/L) on the expression of cleaved-PARP, Bcl-2, p-Akt and caspase-3 activity in MCF-7 and MDA-MB-435 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖3 FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

Figure 4.The expression of cyclical proteins in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228(2 nmol/L), Rapa(500 nmol/L)and FK228 combined with Rapa using Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖4 MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后周期蛋白的表達(dá)

Figure 5.The detection of cell cycle in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228(2 nmol/L),Rapa(500 nmol/L)and FK228 combined with Rapa using flow cytometry.

圖5 MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后的流式周期分析

5 FK228和雷帕霉素聯(lián)合給藥促進(jìn)DNA損傷

H2AX蛋白的磷酸化和H3的乙?；瘯?dǎo)致DNA損傷。與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞中FK228單獨(dú)作用時(shí)出現(xiàn)H2AX的磷酸化和H3的乙酰化，雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)沒有明顯H2AX的磷酸化和H3的乙?；?，但兩者聯(lián)合用藥后出現(xiàn)更為顯著的H2AX的磷酸化和H3的乙?；?。由此說明FK228和雷帕霉素聯(lián)合給藥后能更顯著地促進(jìn)DNA損傷的產(chǎn)生，見圖6。

表1 MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后的流式周期分析

Table 1.The detection of cell cycle in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228 (2 nmol/L), Rapa (500 nmol/L) and FK228 combined with Rapa using flow cytometry (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1SG2/MMCF-7 Control64.20±3.4220.10±1.9110.90±1.34 FK22866.90±5.7510.80±3.4418.00±1.36*# Rapa75.20±4.6212.70±2.019.90±1.91# FK228+RAPA63.70±3.5710.40±2.0423.30±2.56*MDA-MB-435 Control74.50±2.999.70±2.7712.00±1.29 FK22864.80±4.2210.60±1.2221.50±3.64*# Rapa67.90±1.8912.60±1.5316.60±1.52*# FK228+Rapa59.60±1.3810.27±3.7129.80±4.66*

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

Figure 6.The expression of DNA repair proteins in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228 (2 nmol/L), Rapa (500 nmol/L) and FK228 combined with Rapa. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖6 MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯(lián)合用藥后DNA蛋白水平的表達(dá)

討 論

實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)K228聯(lián)合雷帕霉素能協(xié)同殺傷人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-435、MCF-7)。FK228在其單獨(dú)用藥或與雷帕霉素聯(lián)合用藥均具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，并呈時(shí)間、劑量依賴性；同時(shí)，F(xiàn)K228聯(lián)合雷帕霉素增強(qiáng)p-H2AX和ac-H3等一些DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)。p-H2AX能在早期反應(yīng)DNA雙鏈的損傷，隨著DNA損傷的嚴(yán)重程度，p-H2AX呈線性增加，其中H2AX絲氨酸139以其獨(dú)特的羰基末端結(jié)構(gòu)能在1～3 min左右對DNA損傷作出應(yīng)答[14]。p-H2AX的持續(xù)激活，說明真核細(xì)胞受到藥物或者外界刺激，其雙鏈DNA開始受到損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。FK228作用于DNA組蛋白，使其乙酰化，影響正常的轉(zhuǎn)錄[16]，引起DNA損傷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在FK228與雷帕霉素聯(lián)合作用后，pH2AX的激活較單獨(dú)用藥更加顯著，說明FK228和雷帕霉素聯(lián)合用藥在一定程度上增強(qiáng)了DNA損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。雷帕霉素是mTOR特異性抑制劑，其抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制主要為影響因子的受體-PI3K-PTEN-Akt- mTOR(Raptor) 通路[17-18]，PI3K、PTEN以及Akt 與DNA損傷修復(fù)有關(guān)[19]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，F(xiàn)K228與雷帕霉素聯(lián)合作用后，Akt磷酸化水平明顯降低，而兩者單獨(dú)用藥時(shí)沒有表現(xiàn)出明顯磷酸化水平改變。在乳腺癌細(xì)胞或者其它腫瘤細(xì)胞中，p-Akt水平變化可以作為雷帕霉素及其衍生物作用效果的重要標(biāo)記[20]。因此我們推測，F(xiàn)K228與雷帕霉素可能協(xié)同影響Akt上游通路，共同誘導(dǎo)影響Akt的磷酸化，影響DNA損傷修復(fù)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

在許多腫瘤細(xì)胞中，HDACi包括FK228能下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控基因p21的表達(dá)，并且阻斷細(xì)胞周期蛋白/CDK的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞生長[21]。雷帕霉素及其衍生物能特異性地結(jié)合到mTOR，抑制細(xì)胞周期過程中特異性mRNA的轉(zhuǎn)錄，阻斷細(xì)胞從G1進(jìn)入到S期，從而影響細(xì)胞代謝，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，最終誘發(fā)凋亡[22]。流式結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K228和雷帕霉素在單獨(dú)用藥時(shí)，均出現(xiàn)不同程度的G2/M期阻滯，聯(lián)合用藥時(shí)表現(xiàn)出更顯著的周期阻滯。在周期相關(guān)蛋白檢測中發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合給藥后，出現(xiàn)了明顯的周期相關(guān)蛋白Cyclin A、Cyclin D1的表達(dá)下調(diào)。在我們研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K228與雷帕霉素的協(xié)同作用中主要以FK228的作用為主，雷帕霉素單用沒有顯著的周期阻滯作用，這可能與選擇的用藥劑量有關(guān)。

本研究中， FK228與雷帕霉素聯(lián)合作用后誘導(dǎo)促凋亡蛋白cleaved-PARP剪切增多，同時(shí)caspase-3 表達(dá)上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，這些信號通路的增強(qiáng)或減弱都促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡，說明兩者聯(lián)合用藥后其殺傷腫瘤細(xì)胞作用更加顯著。

FK228以及雷帕霉素這兩個(gè)特異性抑制劑是目前具有研究前景的抗癌藥物，尤其是針對非實(shí)體瘤。FK228作為孤兒藥，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤于2009年11月獲得FDA批準(zhǔn)上市，2011年FK228治療外周T細(xì)胞淋巴瘤也獲得批準(zhǔn)[15]。mTOR抑制劑雷帕霉素在臨床器官移植患者中廣泛使用，有較好的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)[23]，同時(shí)mTOR信號通路的異常失調(diào)也可能與腫瘤或者人類其它疾病相關(guān)[24]。最近研究發(fā)現(xiàn), 雷帕霉素及其衍生物CCI-779[25]、RAD001[26]和AP-23573[27]對包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有廣泛的抗腫瘤作用。但是，由于FK228和雷帕霉素的信號通路及其作用機(jī)制的復(fù)雜性，它們在治療乳腺癌中的進(jìn)展受到一定程度的限制。在本次研究中，F(xiàn)K228和雷帕霉素聯(lián)合用藥對于乳腺癌細(xì)胞起到更加顯著的抑制效果，它們的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用比單獨(dú)使用其中任何一種治療效果要強(qiáng)。雷帕霉素還可以提高細(xì)胞毒素劑的效果。我們的研究成果提供了它們在體外實(shí)驗(yàn)聯(lián)合用藥的依據(jù)。

[1] Bhatelia K, Singh K, Singh R. TLRs: Linking inflammation and breast cancer[J]. Cell Signal, 2014, 6 (11): 2350-2357.

[2] Zhang BN, Cao XC, Chen JY, et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of breast cancer [J]. Gland Surg， 2012, 1 (1):39-61.

[3] Furumai R, Matsuyama A, Kobashi N, et al. FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases[J]. Cancer Research， 2002, 62 (17):4916-4921.

[4] Kim JH, Bae SC. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs[J]. Am J Transl Res， 2011, 3 (2):166-179.

[5] Wilson AJ, Lalani AS, Wass E, et al. Romidepsin(FK228) combined with cisplatin stimulates DNA damage-induce cell death in ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2012, 127(3): 579-586.

[6] Adachi M, Zhang Y, Zhao X, et al. Synergistic effect of histone deacetylase inhibitors FK228 and m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamide with proteasome inhibitors PSI and PS-341 against gastrointestinal adenocarcinoma cells[J]. Clin Cancer Res， 2004, 10(11):3853-3862.

[7] Stephan S, Datta K, Wang E, et al. Effect of rapamycin alone and in combination with anti-angiogenesis therapy in an orthotopic model of human pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res， 2004, 10(20):6993-7000.

[8] Shen Y, Wang X, Xia W, et al. Antiproliferative and overadditive effects of rapamycin and FTY720 in pancreatic cancer cellsinvitro[J]. Transplant Proc， 2008, 40(5):1727-1733.

[9] 金 柱, 高安寶. 雷帕霉素對順鉑作用下人肺腺癌A549 及耐藥A549 /DDP 細(xì)胞增殖、侵襲、黏附及自噬凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(12):2120-2127.

[10]Paplomata E, O’Regan R. The PI3K/AKT/mTOR pathway in breast cancer: targets, trials and biomarkers[J]. Ther Adv Med Oncol， 2014, 6(4):154-166.

[11]Kumar A, Fernandez-Capetillo O, Carrera AC. Nuclear phosphoinositide 3-kinase beta controls double-strand break DNA repair[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2010, 107(16):7491-7496.

[12]Chou TC. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J]. Pharmacological Review， 2006, 58(3):621-681.

[13]許成芳, 李小毛, 李 田, 等. 雷帕霉素增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(11):2090-2095.

[14]Paull TT, Rogakou EP, Yamazaki V, et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage[J]. Curr Biol， 2000, 10(15):886-895.

[16]Thaler F, Mercurio C. Towards selective inhibition of histone deacetylase isoforms: what has been achieved, where we are and what will be next[J]. Chem Med Chem， 2014, 9(3):523-526.

[17]Shi YH, Fan J, Zhou J, et al. The study of the role PI3K/Akt/mTOR signaling pathways in the autophagy of liver cancer [J]. Chin J Digest Surg， 2007, 6(1):39-43.

[18]Liu P, Cheng H, Roberts TM,et al. Targeting the phosphoinsitide 3-kinase pathway in cancer[J]. Nat Rev Drug Discov， 2009, 8 (8):627-644.

[19]Kao GD, Jiang Z, Fernandes AM,et al. Inhibition of phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt signaling impairs DNA repair in glioblastoma cells following ionizing radiation[J]. J Biol Chem， 2007, 282(29):21206-21212.

[20]Meric-Bernstam F, Akcakanat A, Chen H, et al. PIK3CA/PTEN mutations and AKT activation as markers of sensitivity to allosteric mTOR inhibitors[J]. Clin Can-cer Res， 2012, 18(6): 1777-1789.

[21]Sandor V, Senderowicz A, Mertins S, et al. P21-depen-dent G1arrest with downregulation of cyclin D1 and upre-gulation of cyclin E by the histone deacetylase inhibitor FR901228[J]. Br J Cancer，2000, 83(6):817-825.

[22]Huang S, Houghton PJ. Inhibitors of mammalian target of rapamycin as novel antitumor agent: from bench to clinic [J]. Curr Opin Investig Drugs， 2002, 3(2):295-304.

[23]Shihab F, Christians U, Smith L, et al. Focus on mTOR inhibitors and tacrolimus in renal transplantation: Pharmacokinetics, exposure-response relationships, and clinical outcomes[J]. Transpl Immunol， 2014, 31(1):22-32.

[24]Watanabe R, Wei L, Huang J. mTOR signaling, function, novel inhibitors, and therapeutic targets[J]. J Nucl Med， 2011, 52(4):497-500.

[25]Chan S, Scheulen ME, Johnston S, et al. Phase II study of temsirolimus (CCI-779), a novel inhibitor of mTOR, in heavily pretreated patients with locally advanced or metastatic breast cancer[J]. J Clin Oncol， 2005, 23(23):5314-5322.

[26]Yee KW, Zeng Z, Konopleva M, et al. Phase I/II study of the mammalian target of rapamycin inhibitor everolimus (RAD001) in patients with relapsed or refractory hematologic malignancies[J]. Clin Cancer Res， 2006, 12(17):5165-5173.

[27]Nemunaitis J, Hochster HS, Lustgarten S, et al. A phase I trial of oral ridaforolimus (AP23573; MK-8669) in combination with bevacizumab for patients with advanced can-cers[J]. Clin Oncol (R Coll Radiol)， 2013, 25(6):336-342.

Combination therapy of FK228 with rapamycin synergistically promotes human breast cancer cell apoptosis by DNA damage and cell cycle arrest

PENG Xiao-dan1, ZHU Meng-lu1, GAO Lü-fen2, LIU Ting-ting1, LIU Yan2, OU-YANG Yuan2, LI Ruo-fen2, LIU Li-fei3, LI Yi3, LIU Xiao-yu3, ZHENG Xiao-he3, LIN Shao-qiang1, 2

(1WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;3ZhejiangHisunPharmaceuticalCompany,Taizhou318000,China.E-mail:tlshq@jnu.edu.cn;zhengxh@hisunpharm.com)

AIM: To investigate the depressant effect of FK228 combined with rapamycin on the human breast cancer cell line MCF-7 and MDA-MB-435. METHODS: FK228, a new histone deacetylase inhibitor, and rapamycin, the specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein, were used in the study. MCF-7 cells and MDA-MB-435 cells were exposed to different concentrations of FK228 and rapamycin. The inhibitory rate of cell growth was determined by SRB assay. Combination index (CI) was used to evaluate the interaction between FK228 and rapamycin. The expression of the apoptotic proteins, cycle proteins and nucleic acid proteins were detected by Western blotting. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. RESULTS: Both FK228 and rapamycin showed growth inhibitory effects on the breast cancer cell lines in a time- and dose-dependent manner. CI of the 2 drugs was less than 1 when the inhibitory rate of the cell growth was 50% effective dose (ED50)～ED70, indicating a synergistic effect. The combination therapy of FK228 with rapamycin increased the apoptotic proteins, and induced the down-regulation of phosphorylated Akt and over-expression of caspase-3 compared with a single use of the drugs. The combination therapy of FK228 with rapamycin reduced the cycle proteins, and the cell cycle was arrested in G2/M. The levels of phosphorylated H2AX and acetylated H3 were ob-viously increased after combination therapy. CONCLUSION: The combination therapy of FK228 with rapamycin inhibits the cell proliferation and increases apoptosis with a synergistic effect, which may become a new trend for treating endometrial cancer.

FK228; Rapamycin; Breast cancer; Synergistic effect

1000- 4718(2015)04- 0577- 08

2014- 12- 26

2015- 01- 27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81071751; No. 81172074)；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研啟動基金(2012)資助項(xiàng)目(No.11614103)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.001

△通訊作者 林紹強(qiáng) Tel: 020-38688511; E-mail:tlshq@jnu.edu.cn; 鄭曉鶴 Tel: 0576-88828271; E-mail:zhengxh@hisunpharm.com

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