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    中藥材天南星根腐病病原菌的分離與鑒定

    2015-04-17 13:57:41袁孟娟張薇董慧鈞
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:天南星毛霉根腐病

    袁孟娟 張薇 董慧鈞 等

    摘要:采用組織分離法、梯度稀釋法分離并純化出天南星根腐病的致病菌,并進(jìn)行病原菌致病性測(cè)定,通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定,確定天南星根腐病的主要致病菌是毛霉屬的卷枝毛霉。

    關(guān)鍵詞:天南星;根腐??;毛霉

    中圖分類號(hào): S435.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2015)01-0153-02

    收稿日期:2014-02-25

    基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金(編號(hào):ZR2013CQ019);聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(編號(hào):3010)。

    作者簡(jiǎn)介:袁孟娟(1990—),女,山東日照人,碩士研究生,主要從事生物制藥研究。E-mail:yuanmengjuan1990@163.com。

    通信作者:陳芳,博士,副教授,主要從事微生物制藥研究。E-mail:chenfang20045@163.com。天南星是一種重要的中藥材,具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫等功效,可用于治療頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、半身不遂、癲癇、驚風(fēng)、破傷風(fēng)等癥[1]。天南星根腐病是一種土傳病害,傳染性極強(qiáng),一株植株出現(xiàn)病癥,臨近的植株大多會(huì)被傳染,天南星根腐病病菌主要靠水傳播,波及范圍廣,如果不注意防治,將造成較大損失。植株感染天南星根腐病病菌后,首先出現(xiàn)褐色斑點(diǎn),周圍有黃色暈圈,最后葉片枯萎,植株死亡。根腐病對(duì)天南星產(chǎn)量、品質(zhì)影響極大。本研究從山東省茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地采集天南星根腐病病株,用組織分離法對(duì)天南星根腐病原菌進(jìn)行了分離純化與鑒定,觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀、孢子形狀,結(jié)合致病性測(cè)定及菌株分子生物學(xué)鑒定方法確定病原菌的種屬分類[2],并且在天南星根際土壤中分離得到大量具有拮抗活性的有益微生物,利用這些拮抗微生物對(duì)天南星土傳病害進(jìn)行生物防治,旨在為天南星根腐病的有效防治提供理論基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    天南星根腐病病株采自山東省茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地。

    1.2病原菌分離方法

    為降低腐生菌的干擾,以新鮮發(fā)病的植物組織作為分離材料,選取發(fā)病部位、健全部位之間(病健交界處)的組織進(jìn)行分離[3]。取天南星根腐病株的塊莖,掰開后用鑷子刮取斷面上的發(fā)病組織,均勻涂布在制好的培養(yǎng)基上。采用組織分離法分離病原菌,從病株刮取適量組織,用5%NaOCl溶液消毒3 min,無菌水洗2~3次,用滅菌濾紙吸干,分別接種到LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱中25~28 ℃倒置培養(yǎng)5 d,觀察菌落生長(zhǎng)狀況[4]。

    1.3病原菌純化方法

    在無菌條件下,從菌落邊緣部分挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)2 d,待菌絲長(zhǎng)出后進(jìn)行多次重復(fù)培養(yǎng),確定培養(yǎng)皿中無其他雜菌后進(jìn)行轉(zhuǎn)管,4 ℃冰箱保存。

    1.4天南星根腐病病原菌Tnx的形態(tài)學(xué)鑒定

    肉眼直接觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、色澤等。選擇生長(zhǎng)狀況良好的菌落挑取菌絲、孢子制成臨時(shí)裝片,在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、有無孢子等。若有孢子則進(jìn)一步觀察孢子形狀及多少、有無隔膜及隔膜數(shù)、產(chǎn)孢細(xì)胞類型、厚垣孢子的有無、子實(shí)體類型等,并測(cè)量孢子大小,對(duì)Tnx菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

    1.5天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學(xué)鑒定

    用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。采用引物 NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)、NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)對(duì)供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:Template(基因組DNA 20~50 ng/μL)0.5 μL,5×buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL,F(xiàn)(10 μmol/L)0.5 μL,R(10 μmol/L)0.5 μL,并加ddH2O至25 μL。PCR循環(huán)條件:預(yù)變性(98 ℃,3 min)→變性(98 ℃,25 s)→退火(55 ℃,25 s)→延伸(72 ℃,1 min)→修復(fù)延伸(72 ℃,10 min)→終止反應(yīng)(4 ℃,∞),30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照記錄,得到目的條帶后,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。用所獲菌株的rDNA-NS序列信息同GenBank中的序列信息進(jìn)行同源性比對(duì),確定病原菌的種類。

    1.6天南星根腐病病原菌Tnx的致病性鑒定

    采用根部切傷接種法接種,將分離的病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,從培養(yǎng)基上刮取菌絲,制成孢子懸浮液,在顯微鏡下用孢子計(jì)數(shù)器將孢子懸浮液濃度調(diào)至106個(gè)/mL接種健康植株根部,接種量為10 mL/株,每處理重復(fù)3次,設(shè)清水作為對(duì)照,定期觀察并記錄發(fā)病情況。接種植株出現(xiàn)癥狀后,比較其癥狀是否與田間癥狀一致,再次進(jìn)行病原菌分離,比較分離前后得到的病原菌菌落形態(tài)、色澤、孢子等特征是否一致[5]。2結(jié)果與分析

    2.1天南星根腐病病原菌Tnx的分離純化結(jié)果

    分離純化得到的病原菌見圖1。

    2.2天南星根腐病病原菌Tnx的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

    天南星的根腐病原菌生長(zhǎng)速度比其他病原真菌快,一般接種后1~2 d即可觀察到白色菌落,呈圓形,孢子長(zhǎng)出后略呈黑色,孢子在顯微鏡下呈橢圓狀(圖2、圖3)。

    2.3天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學(xué)鑒定

    測(cè)序結(jié)果表明,天南星根腐病病原菌Tnx 18S rDNA為 1 354 bp,Blast比對(duì)結(jié)果表明,該序列與毛霉屬相似度達(dá)99%。

    2.4天南星根腐病病原菌Tnx致病性鑒定

    經(jīng)根部切傷接種法接種的天南星植株表現(xiàn)出根腐病的一系列癥狀,與田間癥狀一致。從病組織上再次進(jìn)行病原菌分離得到的病原菌與先前分離的病原菌菌落形態(tài)一致。對(duì)照組天南星植株不出現(xiàn)根腐病的癥狀,從其植株中分離不出根腐病病原菌(圖4、圖5)。

    3結(jié)論

    通過對(duì)天南星根腐病原菌病情調(diào)查,得知天南星根腐病是由真菌引起的一種土傳病害,近年來傳播蔓延較快,嚴(yán)重影響天南星的產(chǎn)量、質(zhì)量。本研究對(duì)天南星根腐病原菌的分離到了一種病原菌Tnx,經(jīng)過分子生物學(xué)18S rDNA鑒定,得知該病原菌為卷枝毛霉。

    參考文獻(xiàn):

    [1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1995:63.

    [2]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1979:560-646.

    [3]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京:農(nóng)業(yè)出版社,1979:110-155.

    [4]Uddin W,Knous T R. Fusarium apecies associated with crown rot of alfalfa in Nevada[J]. Plant Disease,1991,75(1):51-55.

    [5]Hietala A M,Sen R B,Lilja A. Anarnorphic and teleomorphic characteristics of a uninucleate Rhizoctonia solani isolated from the roots nursery gorwn conifer seedlings[J]. Mycological Research,1994,98(9):1044-1050.孫華尊,李友軍,黃明,等. 豆麥輪作模式下保護(hù)性耕作對(duì)冬小麥田雜草群落的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(1):155-157.

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