單核細(xì)胞增生李斯特菌的現(xiàn)代分子生物學(xué)分型檢測方法及研究進(jìn)展*

孔義華 綜述，焦彥朝 審校

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州凱里 556000;2.貴州出入境檢驗(yàn)檢疫局，貴陽 550004)

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·綜 述·

單核細(xì)胞增生李斯特菌的現(xiàn)代分子生物學(xué)分型檢測方法及研究進(jìn)展*

孔義華1綜述，焦彥朝2審校

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州凱里 556000;2.貴州出入境檢驗(yàn)檢疫局，貴陽 550004)

單核細(xì)胞增生李斯特菌； 脈沖場凝膠電泳； 基因芯片技術(shù)； DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法； 基因測序技術(shù)

根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》第9版將李斯特菌屬(listeria)分為2個群7個種，單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，簡稱LM)為其中1個菌種。LM為革蘭陽性球桿菌，廣泛存在于土壤和飼料中，健康人群、家養(yǎng)及野生動物都被認(rèn)為是該菌的攜帶者。LM對營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，在血平板上能形成狹窄透明的溶血環(huán)。并且LM對低溫有較強(qiáng)的耐受性，因此長期放置在冰箱內(nèi)的食物容易查出該菌。根據(jù)菌體抗原和鞭毛抗原，LM可分為16個血清型，包括1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。主要以血清型1/2a、1/2b和4b對人致病，約占全球該病病例數(shù)的90%[1]。

LM是一種典型的能夠寄生于巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞胞內(nèi)的寄生菌，一旦引起人畜共患傳染病的發(fā)生，其病死率高達(dá)20%～70%[2]。美國食品藥品管理局(FDA)規(guī)定即食食品中不得檢出LM，而世界衛(wèi)生組織將其列為20世紀(jì)90年代4大食源性致病菌之一。1997年3月和8月在我國云南省某縣一自然村內(nèi)先后兩次暴發(fā)動物源性李斯特菌病，造成村內(nèi)牲畜大量死亡，動物病死率約為100%，人群發(fā)病率分別為8.2%和8.6%[3]。近年來我國多次在美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等進(jìn)口肉類中檢測出李斯特菌。據(jù)加拿大公共衛(wèi)生署(PHAC)報(bào)道，加拿大每年約有100～140人感染LM，大約死亡30～50人。據(jù)美國食品藥品管理局(FDA)報(bào)道，美國每年約有2 500人感染LM，其病死率高達(dá)20%～30%。人群主要通過食用被LM污染的食物而致病，目前LM已被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致食源性傳染性疾病暴發(fā)流行和散發(fā)病例的重要致病菌。而細(xì)菌生物學(xué)分型、噬菌體分型和多位點(diǎn)酶電泳等傳統(tǒng)的血清學(xué)分型鑒定方法均不能將所有從食品、患者和環(huán)境中分離的LM進(jìn)行有效的分型檢測，不能滿足現(xiàn)代流行病學(xué)分子生物學(xué)調(diào)查研究的需要。因此，具有高分辨率、自動化、快速、穩(wěn)定和重復(fù)性好等特點(diǎn)的現(xiàn)代分子生物學(xué)分型方法就更加受到國內(nèi)外研究者的青睞，而相繼出現(xiàn)的脈沖場凝膠電泳(PFGE)、基因芯片技術(shù)、DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法及焦磷酸測序法則具有上述特點(diǎn)。本文現(xiàn)就針對LM的現(xiàn)代分子生物學(xué)分型檢測方法及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PFGE

隨著PFGE方法的不斷改進(jìn)和完善，該方法已經(jīng)用于沙門菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等常見病原體的分子流行病學(xué)調(diào)查和分子分型研究。近年來LM的檢測與分型也常采用PFGE。PFGE具有分辨率高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，能區(qū)分其他方法不能鑒別的菌株(包括LM的4b型)，因此被認(rèn)為是細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。在PFGE特定的電泳系統(tǒng)中，通過電場方向的不斷交替變換及適宜的脈沖時間等條件，包埋于凝膠中的細(xì)菌DNA大片段能夠得到很好的分離，形成清晰的圖譜。不同的脈沖時間其分離的DNA片段大小不同，脈沖時間5～40 s，可以分離(50～600)×103的DNA片段。此外，電壓、脈沖角度、電泳溫度、緩沖液離子濃度等也是不容忽視的條件。在制作凝膠包埋細(xì)菌時，細(xì)菌濃度對于能否得到高質(zhì)量、清晰的圖譜也至關(guān)重要，需要對其進(jìn)行嚴(yán)格的要求。為了能夠在最短的時間內(nèi)得到最好的電泳圖譜，許多研究者都致力于建立快速的PFGE分型方法，改進(jìn)該方法的各個環(huán)節(jié)。Briczinki等[5]研究報(bào)道，用快速PFGE法檢測1 d即可得到與其他分型方法完全一致的結(jié)果，提示PFGE的改進(jìn)可以提供一個方便、快速和準(zhǔn)確的細(xì)菌分子生物學(xué)分型方法。這對以后的細(xì)菌分子分型和分子流行病學(xué)調(diào)查起到了積極的推動作用。

Howard等[6]在進(jìn)行PFGE的過程中采用限制性核酸內(nèi)切酶ApaⅠ、AscⅠ、NotⅠ和SmaⅠ對LM進(jìn)行酶切，可以獲得滿意的大片段DNA分子。其中ApaⅠ的分辨力強(qiáng)于SmaⅠ，其酶切后產(chǎn)生的條帶數(shù)目少于SmaⅠ，圖譜清晰易讀[7]。雖然ApaⅠ的分辨力也強(qiáng)于AscⅠ，但由于AscⅠ酶切后只產(chǎn)生8～14個DNA片段，較ApaⅠ酶切后產(chǎn)生的DNA片段數(shù)(18～23個)少，因此AscⅠ酶切后所得數(shù)據(jù)更易解釋。病原菌分子分型實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)(PulseNet)推薦，在使用PFGE鑒別LM的過程中聯(lián)合應(yīng)用限制性內(nèi)切酶可提高PFGE的分辨力。例如當(dāng)分析流行病學(xué)相關(guān)的菌株是否為同一型別時，可聯(lián)合使用ApaⅠ和AscⅠ酶將其區(qū)分(包括4b型)，且結(jié)果也易于觀察和解釋。PFGE已成為LM分型的最優(yōu)方法之一[8]。目前國內(nèi)外主要是采用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ或(和)AscⅠ對LM進(jìn)行PFGE分型。在美國1998年與2002年先后發(fā)生的2次由LM引起的暴發(fā)流行事件中，PulseNet實(shí)驗(yàn)室正是采用PFGE分型方法成功地追蹤到傳染源[9]。

然而，該方法也存在一定的局限性。在細(xì)菌基因變異的情況下，由于PFGE只能提供有限的遺傳信息，不能鑒別特點(diǎn)基因的存在和缺失。并且由于點(diǎn)突變、缺失或插入等單一基因事件的發(fā)生，PFGE在長期的流行病學(xué)研究中顯得并不穩(wěn)定。此外，限制性內(nèi)切酶只能對大多數(shù)血清型的LM菌株進(jìn)行酶切，雖然聯(lián)合應(yīng)用限制性內(nèi)切酶可以提高檢測的穩(wěn)定性，但卻導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)時間的延長。這些問題都有待進(jìn)一步的探討和解決。

2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種全新微量分析技術(shù)，有著自動化、高通量、集成化等突出特點(diǎn)，其在微生物重要基因(如抗藥基因、毒力基因、致病因子)的篩選監(jiān)測和基于細(xì)菌基因組的流行病學(xué)研究中得到了廣泛的研究，尤其是近年來基因芯片和液相芯片的研究。其原理：提取的生物標(biāo)本DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后與提前點(diǎn)樣于芯片表面的寡核苷酸雜交，最后通過檢測雜交信號的強(qiáng)度和分布來確定檢測樣品中特定微生物的存在和豐度。Chizhikov等[10]采用寡核苷酸芯片研究了大腸桿菌、志賀菌、LM及沙門菌株的抗原決定簇和毒力因子與其致病性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒力基因經(jīng)多重PCR擴(kuò)增后，結(jié)合基因芯片雜交篩選方法完全可以用于某些腸道致病菌的分析檢測。Wilson等[11]研發(fā)出一套可同時檢測18種致病菌(包括原核生物和真核生物)的多病原體識別微陣列，對炭疽桿菌的檢測極限可達(dá)10 fg。LM、大腸桿菌0157和沙門菌等致病菌是危害食品安全的主要致病菌，研發(fā)出快速、準(zhǔn)確、自動化的檢測方法已成為確保食品安全的重要任務(wù)。

Volokhov等[12]以LM的6個毒力因子基因(hly、inlB、plcA、plcB、clp、iap)為靶基因建立了檢測和鑒別LM的基因芯片技術(shù)，可簡便、迅速地檢測LM的6個基因型。Borucki等[13]采用585個探針建立了一個混合基因組芯片，通過對24株LM進(jìn)行分析表明，該芯片對主要致病血清型可以作出良好的分析，所得聚類結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化分支結(jié)果一致；此外，還可鑒別同一血清型的不同菌株，并發(fā)現(xiàn)了一些可用于流行病學(xué)研究的遺傳標(biāo)記。胡瑞等[14]利用多指標(biāo)同步分析(xMAP)液態(tài)芯片技術(shù)在4 h內(nèi)成功地檢測出了包括LM在內(nèi)的4種引起食源性疾病的重要病原菌，其靈敏度可高達(dá)200 cfu/mL。盡管基因芯片技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在檢測費(fèi)用較高、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用過程中的標(biāo)準(zhǔn)化及前期研發(fā)投入高昂等問題，但它已在病原菌的基因分型和菌種鑒定方面展示了非常廣闊的應(yīng)用前景[15]。

3 DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法

DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法(LAMP)是一種連續(xù)、恒溫、基于酶反應(yīng)的，可用于細(xì)菌和病毒的定性檢測的新型核酸擴(kuò)增方法，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)。其原理：針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在65 ℃左右恒溫保存幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，且1 h內(nèi)可擴(kuò)增靶基因至1010倍。反應(yīng)過程不會受到反應(yīng)混合物的影響且受非靶序列DNA分子的影響較小。同時，在等溫條件下擴(kuò)增，不會因溫度的改變而造成時間損失，并且模板也不需要進(jìn)行熱變性，從而保證了LAMP擴(kuò)增的高效特異性。LAMP具有操作快捷、簡便、實(shí)驗(yàn)裝置簡單、費(fèi)用低廉和可以通過肉眼判斷目的基因擴(kuò)增與否等優(yōu)點(diǎn)。在李斯特菌屬中保守且特有的是編碼李斯特菌溶血素(LLO)的hly基因。馬保華等[16]使用商業(yè)化的LAMP試劑盒在進(jìn)口凍肉中檢出7份LM陽性的樣品，并與常規(guī)檢驗(yàn)方法進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，表明采用LAMP技術(shù)檢測LM的準(zhǔn)確率可達(dá)100%。易海華等[17]采用LAMP與PCR方法同時檢測LM的hly基因并進(jìn)行對比，結(jié)果顯示LAMP比PCR的靈敏度高100倍以上。但是該方法所需要設(shè)計(jì)的引物數(shù)量相對較多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尤其在病原體出現(xiàn)高度變異的時候難以進(jìn)行。同時，在設(shè)計(jì)引物時還必須考慮靶序列的片段和莖環(huán)結(jié)構(gòu)等因素。此外，該方法每次反應(yīng)只能檢測一個病原菌，其陽性反應(yīng)也并不單是呈現(xiàn)單條帶，容易出現(xiàn)拖尾和一些低分子質(zhì)量的條帶，且一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增就不易鑒別。

4 焦磷酸測序技術(shù)

在細(xì)菌鑒定分型的分子生物學(xué)方法中，能夠提供核酸堿基序列資料的分子診斷技術(shù)成為細(xì)菌鑒定分型的金標(biāo)準(zhǔn)。在利用Sanger法的DNA測序技術(shù)中，所測DNA長度可達(dá)1 000 bp。但是在實(shí)際工作中，如果引物選擇恰當(dāng)，只需要通過分析已知DNA序列片段中的幾十對堿基即可滿足細(xì)菌分型檢測的需要[18]，而近幾年發(fā)展起來的焦磷酸測序技術(shù)就能達(dá)到該要求。

焦磷酸測序技術(shù)是一種準(zhǔn)確、快速、實(shí)時進(jìn)行短片段DNA序列分析的方法，是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的技術(shù)。在DNA聚合酶、熒光素酶、腺三磷酸雙磷酸酶和硫酸化酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度達(dá)到測定DNA序列的目的。新發(fā)展的焦磷酸測序技術(shù)無須對DNA片段進(jìn)行熒光標(biāo)記，也無須進(jìn)行電泳，因此相應(yīng)的儀器系統(tǒng)就不需要熒光分子的激發(fā)和檢測裝置[19]。李秀娟等[20]在用焦磷酸測序技術(shù)對LM的hly基因保守序列進(jìn)行測序時發(fā)現(xiàn)第7個堿基的A與G置換，從而可以建立用焦磷酸測序技術(shù)對LM進(jìn)行分子分型的方法。盡管用該方法進(jìn)行分型有可能分型的種類較少，但是通過測序、分型一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)就能完成，并且其結(jié)果可靠、穩(wěn)定、操作簡單，極大地減少了常規(guī)檢測和分型的工作量。

5 展 望

由于LM分布廣，適應(yīng)能力強(qiáng)，對人類威脅較大，能使人致病的最小致病濃度尚不清楚，因此研發(fā)簡單快速、靈敏高效、成本低、自動化程度高的檢測技術(shù)顯得非常重要。但是，目前還沒有一種方法可以同時兼?zhèn)湟陨蟽?yōu)點(diǎn)。病原微生物的高通量檢測技術(shù)是近年發(fā)展起來的前沿技術(shù)，在病原微生物的檢測分型和預(yù)防控制領(lǐng)域具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。由于其所需樣品和劑量較少、快速省時、診斷結(jié)果精確、自動化操作程度較高，適宜用于食源性病原微生物的診斷與分型。PFGE、LAMP、基因芯片技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)等檢測方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，對這些技術(shù)在病毒、細(xì)菌的分型檢測及傳染病監(jiān)控等方面的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了大量研究。相信隨著研究的不斷進(jìn)展和深入，這些高通量診斷分型技術(shù)和方法會不斷完善，在食源性傳染病病原體檢測分型方面起到更加重要的作用。

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A

1672-9455(2015)06-0843-03

2014-07-26

2014-10-17)