HMGB1基因蛋白特性及抑制劑研究進(jìn)展

丁軍穎，劉清泉

高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)是Goodwin Johns在小牛胸腺中發(fā)現(xiàn)的，分子量＜30 KD，含高比例帶電氨基酸，電泳時遷移率高，并因此得名。國際學(xué)術(shù)機構(gòu)將HMG分為HMGB1、HMGB2和 HMGB3，三者氨基酸序列一致性達(dá)80%。HMG幾乎表達(dá)于所有類型的組織細(xì)胞，胚胎組織尤為豐富。以一種與序列無關(guān)的方式結(jié)合在DNA上，對染色體重組非常重要，是C末端重復(fù)序列中兩個氨基酸殘基被置換［1］，并有維持核小體結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定染色質(zhì)和參與DNA重組等功能。

1 HMGB1的蛋白及基因結(jié)構(gòu)

HMGB1是HMG家族中含量最豐富的蛋白，平均每10～15個核小體中即含1個HMGB1。由215個氨基酸構(gòu)成，在不同物種之間具備高度保守性，人與鼠氨基酸序列同源性高達(dá)99%;大鼠與小鼠蛋白序列完全一致。人的HMGB1基因位于13q12染色體上，含TATA盒啟動子及數(shù)個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點——兩個同源的L型DNA結(jié)合區(qū)(A盒和B盒，約75個氨基酸)及含天冬氨酸與谷氨酸多重復(fù)序列的C末端:①A盒和B盒均由3個螺旋組成，帶正電，是HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū)，廣泛識別并結(jié)合DNA，通過改變構(gòu)象與DNA結(jié)合蛋白精確裝配，實現(xiàn)調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、重組和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能［2-3］。②B盒是引起炎性反應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，能刺激鼠巨噬細(xì)胞株(RAW264．7)釋放腫瘤壞死因子 α(TNF-α)，甚至致小鼠死亡［4］。已證實，含TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子與HMGB1的作用區(qū)域是B盒DNA結(jié)合域的前20個氨基酸殘基區(qū)(HMGB1 aa89 ～108)［5］;小鼠接種抗 HMGB1 B 盒抗體對盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的重度膿毒癥有明顯保護(hù)作用［4］，提示HMGB1 B盒可能是治療膿毒癥的靶點。③A盒位于序列末端，進(jìn)化高度保守，可競爭性抑制HMGB1致炎功能，類似全長HMGB1抗體的功能，對B盒有拮抗作用。④C末端是HMGB1結(jié)合受體的部位，通過與其他蛋白相互作用調(diào)節(jié)核內(nèi)HMGB1與DNA的親和力，實現(xiàn)相關(guān)生物學(xué)功能。⑤另外，HMGB1序列中存在一個與A盒和B盒結(jié)構(gòu)域同源的DNA結(jié)合基元，即HMG盒，既可提供與DNA二級結(jié)構(gòu)特異的結(jié)合位點，以非序列依賴方式疏松結(jié)合于DNA小槽內(nèi);也可提供非特異性DNA結(jié)合位點，是辨認(rèn)和結(jié)合變形DNA所必需的結(jié)構(gòu)［6］。

2 HMGB1的釋放方式

HMGB1幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞。在肝、腦組織細(xì)胞中，HMGB1表達(dá)于胞質(zhì)中;在其他組織細(xì)胞，多存在于胞核內(nèi)。正常生理情況下，HMGB1定位于核內(nèi)，表達(dá)量維持在基礎(chǔ)水平;受刺激后賴氨酸殘基發(fā)生乙?；揎棧龠M(jìn)HMGB1核漿轉(zhuǎn)移，并阻止其重新進(jìn)入胞核。其釋放方式主要有兩種:被動釋放和主動分泌［7］。

2.1 被動釋放 在凋亡細(xì)胞中，HMGB1因組蛋白廣泛去乙?；cDNA緊密結(jié)合，使其存留于凋亡小體內(nèi)而不被釋放至胞外，但當(dāng)被單核巨噬細(xì)胞吞噬后，發(fā)生二次壞死或組蛋白去乙酰化被阻斷，HMGB1則被動釋放至胞外。

2.2 主動分泌 HMGB1可由不同細(xì)胞主動分泌——活化的單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等。HMGB1因缺乏引導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)而不能以高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑分泌，需通過非經(jīng)典途徑——溶酶體分泌至胞外。已證實，HMGB1蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后可廣泛進(jìn)行修飾——糖基化、乙?；⒓谆土姿峄?，其中，乙?；土姿峄苷T導(dǎo)活化細(xì)胞主動分泌HMGB1。

值得注意的是由凋亡細(xì)胞被動釋放與活化免疫細(xì)胞主動分泌的HMGB1在分子修飾方面有明顯差異，后者表現(xiàn)為高乙?；?不同釋放方式的HMGB1蛋白因結(jié)構(gòu)不同而功能不同——凋亡細(xì)胞釋放的HMGB1具有誘導(dǎo)免疫耐受作用，而主動分泌的HMGB1則發(fā)揮促炎效應(yīng)［8］。另據(jù)報道，單純HMGB1無致炎活性，而與ssDNA、脂多糖和核小體等形成復(fù)合物后則有高致炎性——可分別激活Toll樣受體9(TLR9)、TLR4 和 TLR2［9］，提示存在兩種HMGB1分子形式，且二者作用亦不同。

3 HMGB1的生物學(xué)特性

3.1 核內(nèi)HMGB1 核內(nèi)HMGB1在DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。DNA復(fù)制時HMGB1作為基因調(diào)控蛋白，可避免DNA堿基錯配;轉(zhuǎn)錄時，與不同結(jié)構(gòu)DNA非特異性結(jié)合，促其局部空間構(gòu)象變化，使不同轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而改變其基因表達(dá)。

3.2 胞外HMGB1 胞外HMGB1與核內(nèi)HMGB1有不同的生物學(xué)功能。通過與受體RAGE、TLR2和TLR4等結(jié)合可激活胞內(nèi)信號，不僅對自身分泌有級聯(lián)放大效應(yīng)，還可調(diào)節(jié)其他炎性因子、血管黏附分子和細(xì)胞趨化因子等的分泌，對炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和維持起重要作用，是炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的核心。

3.2.1 炎性因子:胞外HMGB1作為炎性介質(zhì)因子可激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，使其表達(dá)釋放巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β、白介素(IL)-6、IL-8、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等，且這些因子多可與HMGB1相互誘生［1］，形成炎性環(huán)路，激發(fā)免疫炎性反應(yīng)的同時，維持慢性炎癥的持續(xù)過程，尤其在炎癥晚期HMGB1可參與創(chuàng)傷膿毒癥多器官損害及內(nèi)毒素致病過程。

3.2.2 黏附因子:HMGB1也是單核細(xì)胞黏附和穿越內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。單核細(xì)胞被激活后分泌HMGB1至細(xì)胞表面，與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞遷移、黏附和游出;還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素(E-Selectin/CD62E)和RAGE，從而調(diào)節(jié)和放大單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

3.2.3 凝血因子:HMGB1還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)和組織纖溶酶原激活物(t-PA)，在機體凝血－抗凝血的平衡中發(fā)揮作用，參與炎性組織的血栓形成和彌散性血管內(nèi)凝血過程［10］。

3.2.4 趨化因子:HMGB1還可與細(xì)胞表面趨化因子CXCL12結(jié)合，促進(jìn)趨化因子受體(CXCR4)構(gòu)象重排和炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮促炎效應(yīng)［11］。

3.2.5 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子:HMGB1還可介導(dǎo)核因子κB(NF-κB)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的激活，廣泛參與機體各類炎性免疫反應(yīng)［12-13］。

總之，胞外HMGB1可通過與炎性細(xì)胞因子、黏附和趨化因子等相互作用，在系列病理生理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。當(dāng)然，機體為了維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，染色體6q21基因編碼的膜糖蛋白(CD24)和內(nèi)皮細(xì)胞因子(TM)等多種HMGB1負(fù)調(diào)節(jié)受體也參與機體調(diào)節(jié)反應(yīng)，起抑制炎性反應(yīng)的作用。

4 HMGB1的受體及重要信號分子

4.1 RAGE HMGB1可與受體 RAGE、TLR4、TLR2和TLR9等結(jié)合。其中，RAGE具有很高的親和力［14-15］，是最早被鑒定的受體。1992年首次從胎牛肺內(nèi)皮組織中分離得到，分子量35 KD。人RAGE基因位于6p21．3，含有11個外顯子，其原始翻譯產(chǎn)物含404個氨基酸，屬跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域。其中，胞外域為配體結(jié)合部位，由321個氨基酸殘基組成，含V及兩個C型片段的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。V區(qū)是配體結(jié)合區(qū)，可介導(dǎo)相關(guān)免疫應(yīng)答效應(yīng)。RAGE是免疫球蛋白超家族的一員，可廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞和活化的內(nèi)皮細(xì)胞等［14-15］。一般RAGE為低表達(dá)，當(dāng)炎癥發(fā)生時，其配體(如HMGB1)表達(dá)增多，RAGE可隨之表達(dá)上調(diào)。HMGB1與 RAGE結(jié)合，可通過活化 Rho族蛋白Ras/Raf、Rac/CDC42、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及其相關(guān)蛋白p38抗體(p38)等觸發(fā)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最后激活NF-κB信號通路，促進(jìn)機體免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生和維持。

4.2 TLR 人類TLR家族成員現(xiàn)已確認(rèn)的有10個(TLR1～10)，是HMGB1除RAGE外的另一類主要受體，包括TLR2、TLR4和TLR9等。TLR蛋白由胞外區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)構(gòu)成，通過胞外區(qū)可識別配體——外源性病原微生物成分，如脂多糖及部分機體內(nèi)源性分子［16］。TLR介導(dǎo)的NF-κB通路現(xiàn)已基本明確:HMGB1與TLR結(jié)合，活化髓樣分化因子MyD88和髓樣分化因子接頭樣蛋白，進(jìn)而激活下游IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK-1，IRAK-2，IRAK-3/M，IRAK-4)，IL-1受體相關(guān)酶再與TNF-α、受體相關(guān)細(xì)胞因子-6和三聯(lián)復(fù)合物(由轉(zhuǎn)化生長因子激酶-1、轉(zhuǎn)化生長因子激酶-1相關(guān)蛋白-1及轉(zhuǎn)化生長因子和激酶-1相關(guān)蛋白-2組成)結(jié)合，而后復(fù)合物發(fā)生磷酸化，激活NF-κB抑制酶信號小體，釋放 NF-κB，促進(jìn) TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，形成多米勒骨牌效應(yīng)，即通過正反饋作用使炎性反應(yīng)放大并維持。當(dāng)缺失髓樣分化因子或抑制TLR2活性時，HMGB1與DNA的結(jié)合通過RAGE/TLR9途徑，HMGB1與核小體的結(jié)合則通過TLR2受體［17］。當(dāng) TLR2、TLR4和 RAGE 都被阻斷時，HMGB1刺激巨噬細(xì)胞仍有低水平的 NF-κB活性［18］，提示存在其他未知的 HMGB1受體及通路，有待進(jìn)一步研究證實。除了RAGE和TLR受體外，可能還存在其他受體與HMGB1信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)，這被相應(yīng)抗體只能阻斷HMGB1部分功能所證實。

5 抑制劑

基于HMGB1的特性和活化通路的研究，起負(fù)調(diào)節(jié)作用的抑制劑逐漸被關(guān)注。

5.1 受體型抑制劑 通過與HMGB1結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1的刺激活性，如胞膜上的CD24、血栓調(diào)節(jié)蛋白、抗 HMGB1抗體、抗 RAGE抗體、分泌型RAGE(sRAGE)、涎免凝集素受體復(fù)合物、凝血酶敏感素、CXCL12抑制劑和甘草素等［19］。

5.2 抑制HMGB1釋放的抑制劑 丙酮酸乙酯可抑制HMGB1釋放，有抗炎作用［20］;小檗堿能明顯抑制脂多糖激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放HMGB1［21］;雙環(huán)醇也可抑制 HMGB1 釋放，進(jìn)而下調(diào) NF-κB 和蛋白 P65 的磷酸化［22］。

5.3 抑制HMGB1表達(dá)的抑制劑 沒食子兒茶素在盲腸結(jié)扎穿刺導(dǎo)致的小鼠敗血癥模型中，能抑制HMGB1表達(dá)［23］;小檗堿能明顯抑制脂多糖激活后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞HMGB1 mRNA的表達(dá)［21］。

5.4 抑制HMGB1核漿轉(zhuǎn)移的抑制劑 煙堿能通過與膠質(zhì)細(xì)胞α7 nAChR特異結(jié)合而影響HMGB1從核內(nèi)向核外轉(zhuǎn)移［24］。芍藥苷也有抑制HMGB1核漿轉(zhuǎn)移的功效［25］。大黃素則對 LPS激活后RAW264．7細(xì)胞中 HMGB1的釋放、mRNA表達(dá)和蛋白核漿轉(zhuǎn)移均有抑制作用［26］;另外，具有抑制HMGB1活性或釋放作用的還有HMGB1 A盒蛋白、正丁酸鈉、胎球蛋白、槲皮素、順鉑、抗凝血酶Ⅲ及中藥成分如丹參酮或小檗堿等［27］。

綜上所述，HMGB1的受體 RAGE、TLR2和TLR4等分子可介導(dǎo)HMGB1參與免疫應(yīng)答，其抑制劑則可通過不同環(huán)節(jié)阻抑或影響HMGB1的生物學(xué)功能。目前圍繞HMGB1受體和抑制劑的相關(guān)信號通路尚不完全明晰，值得進(jìn)一步探索。

［1］ Thirugnanam S，Munirathinam G，Veerapathran A，et al．Cloning and characterization of high mobility group box protein 1(HMGB1)of wuchereria bancrofti and brugia malayi［J］．Parasitol Res，2012，111(2):619-627．

［2］ Churchill M E，Klass J，Zoetewey D L．Structural analysis of hmgd-dna complexes reveals influence of intercalation on sequence selectivity and dna bending［J］．J Mol Biol，2010，403(1):88-102．

［3］ Joshi SR，Sarpong Y C，Peterson R C，et al．Nucleosome dynamics:HMGB1 relaxes canonical nucleosome structure to facilitate estrogen receptor binding［J］．Nucleic Acids Res，2012，40(20):10161-10171．

［4］ Zhou H，Ji X，Wu Y，et al．A dual-role of Gu-4 in suppressing HMGB1 secretion and blocking HMGB1 pro-inflammatory activity during inflammation［J］．PLoS One，2014，9(3):e89634．

［5］ Li J，Kokkola R，Tabibzadeh S，et al．Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1［J］．Mol Med，2003，9(1-2):37-45．

［6］ Merkle T，Grasser K D．Unexpected mobility of plant chromatin-associated HMGB proteins［J］．Plant Signal Behav，2011，6(6):878-880．

［7］ Pisetsky D S．The expression of HMGB1 on microparticles released during cell activation and cell death in vitro and in vivo［J］．Mol Med，2014，20:158-163．

［8］ Kazama H，Ricci J E，Herndon J M，et al．Induction of immunological tolerance by apoptotic cells requires caspase-dependent oxidation of high-mobility group box-1 protein［J］．Immunity，2008，29(1):21-32．

［9］ Bianchi M E．HMGB1 loves company［J］．JLeukoc Biol，2009，86(3):573-576．

［10］ Roussel B D，Mysiorek C，Rouhiainen A，et al．HMGB-1 promotes fibrinolysis and reduces neurotoxicity mediated by tissue plasminogen activator［J］．JCell Sci，2011，124(Pt 12):2070-2076．

［11］Schiraldi M，Raucci A，Munoz L M，et al．HMGB1 promotes recruitment of inflammatory cells to damaged tissues by forming a complex with cxcl12 and signaling via cxcr4［J］．J Exp Med，2012，209(3):551-563．

［12］He Z W，Qin Y H，Wang Z W，et al．HMGB1 acts in synergy with lipopolysaccharide in activating rheumatoid synovial fibroblasts via p38 mapk and nf-kappab signaling pathways［J］．Mediators Inflamm，2013，2013:596716．

［13］ Li X，Qin J．Modulation of toll-interleukin 1 receptor mediated signaling［J］．J Mol Med(Berl)，2005，83(4):258-266．

［14］ Todorova J，Pasheva E．High mobility group B1 protein interacts with its receptor RAGE in tumor cells but not in normal tissues［J］．Oncol Lett，2012，3(1):214-218．

［15］ Han SH，Kim Y H，Mook-Jung I．RAGE:the beneficial and deleterious effects by diverse mechanisms of actions［J］．Mol Cells，2011，31(2):91-97．

［16］ Dehbi M，Uzzaman T，Baturcam E，et al．Toll-like receptor 4 and high-mobility group box 1 are critical mediators of tissue injury and survival in a mouse model for heatstroke［J］．PLoSOne，2012，7(9):e44100．

［17］ Fernandez I，Harlow L，Zang Y，et al．Functional redundancy of myd88-dependent signaling pathways in a murine model of histidyl-transfer RNA synthetase-induced myositis［J］．J Immunol，2013，191(4):1865-1872．

［18］ Rosas-Ballina M，Goldstein R S，Gallowitsch-Puerta M，et al．The selective alpha7 agonist GTS-21 attenuates cytokine production in human whole blood and human monocytes activated by ligands for TLR2，TLR3，TLR4，TLR9，and RAGE［J］．Mol Med，2009，15(7-8):195-202．

［19］ Nativel B，Marimoutou M，Thon-Hon V G，et al．Soluble HMGB1 is a novel adipokine stimulating il-6 secretion through rage receptor in sw872 preadipocyte cell line:contribution to chronic inflammation in fat tissue［J］．PLoSOne，2013，8(9):e76039．

［20］梁旭陽．丙酮酸乙醋對人胰腺癌細(xì)胞的抑制作用［D］．濟南:山東大學(xué)，2011．

［21］陳國千，王婷婷，胡志剛，等．小檗堿抑制巨噬細(xì)胞HMGB1釋放及機理研究［J］．國際中醫(yī)中藥雜志，2009，31(2):103-104．

［22］ Luo Y，Zhang B，Xu D Q，et al．Protective effect of bicyclol on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice［J］．Pulm Pharmacol Ther，2011，24(2):240-246．

［23］ Li W，Ashok M，Li J，et al．A major ingredient of green tea rescues mice from lethal sepsis partly by inhibiting HMGB1［J］．PLoSOne，2007，2(11):e1153．

［24］張國英，趙中夫，劉明社，等．煙堿抑制RAW264．7細(xì)胞表達(dá)和釋放HMGB1的機制［J］．中國病理生理雜志，2010，26(1):37-41．

［25］常蘊青，趙中夫，劉明社．芍藥苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響［J］．長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，23(2):81-84．

［26］陳國千，陸焱，徐明．大黃素抑制高遷移率族蛋白B1胞外釋放及其機理［J］．江蘇醫(yī)藥，2010，36(1):53-55．

［27］ Tang D，Kang R，Xiao W，et al．Quercetin prevents lpsinduced high-mobility group box 1 release and proinflammatory function［J］．Am JRespir Cell Mol Biol，2009，41(6):651-660．