γ干擾素釋放試驗(yàn)與結(jié)核菌素試驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值

崔 丹，趙 杰，李志惠

我國(guó)是結(jié)核感染高發(fā)國(guó)家，每年約25萬人死于結(jié)核病，是其他各類傳染病死亡人數(shù)的2倍［1］。臨床上很多肺結(jié)核患者起病隱匿，無典型臨床癥狀。目前，作為診斷肺結(jié)核的有效指標(biāo)為病原學(xué)檢測(cè)，然而抗酸染色檢出率很低，結(jié)核菌培養(yǎng)耗時(shí)太長(zhǎng)，故而臨床上仍有很多菌陰肺結(jié)核患者被誤診或漏診。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)是多年來一直沿用的診斷結(jié)核分枝桿菌感染的方法，在我國(guó)，仍作為輔助診斷菌陰肺結(jié)核的重要指標(biāo)之一。但由于其抗原純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)與卡介苗的抗原成分有某些相同導(dǎo)致其特異性差，且TST檢測(cè)與人體免疫功能密切相關(guān)，在人體免疫功能低下時(shí)其敏感性大大降低［2］。因此，提高肺結(jié)核的診斷率需要更為快速、有效的免疫學(xué)指標(biāo)。

γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRAs)通過檢測(cè)外周血中結(jié)核菌抗原特異性IFN-γ的T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-Spot．TB)，已用于臨床對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。據(jù)報(bào)道，其是快速敏感的方法，在診斷結(jié)核性疾病中有重要的參考價(jià)值［3］。在美國(guó)，疾病預(yù)防控制中心推薦可用IGRAs替代TST 檢測(cè)［4］?；诖?，本文用T-Spot．TB方法及TST方法對(duì)2013年1月—2013年12月入住我科的230例菌陰肺結(jié)核患者和我院體檢中心200例體檢者平行檢測(cè)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，探討其診斷菌陰肺結(jié)核的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 臨床資料 選取2013年1—12月入住河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科的菌陰肺結(jié)核230例為結(jié)核組，其中男119例，女111例，年齡18～80(36．20±18.32)歲。隨機(jī)選取同期河北省胸科醫(yī)院體檢中心體檢者200例為對(duì)照組，其中男111例，女89例，年齡25 ～80(32．12 ±16．04)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 結(jié)核組:診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部結(jié)核病臨床診療指南，菌陰肺結(jié)核診斷符合:①典型的肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn);②抗結(jié)核治療有效;③臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾病;④支氣管肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌;⑤支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變;⑥結(jié)核菌素(PPD 5TU)試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性;血清抗結(jié)核抗體陽(yáng)性;⑦痰結(jié)核分枝桿菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和探針檢測(cè)呈陽(yáng)性;⑧肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變。其中1～5項(xiàng)為主要指標(biāo)。

1.2.2 對(duì)照組:均經(jīng)影像學(xué)及臨床表現(xiàn)除外活動(dòng)性結(jié)核病變。兩組均無合并糖尿病、HIV陰性、無風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、無嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，所有受試者均知情同意參與。

1.3 檢測(cè)方法 所有研究對(duì)象均同時(shí)進(jìn)行T-Spot．TB檢測(cè)及TST檢測(cè)，即留取IGRAs用血后立即行TST檢測(cè)。

1.3.1 T-Spot．TB檢測(cè):采用英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-Spot．TB試劑盒，基本步驟如下:于治療前分別取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5 ml立即進(jìn)行檢測(cè)(樣本采集后2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)完成檢測(cè))。外周血分離得到血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并制備成濃度為2．0×106/ml的細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，植物血凝素PHA作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)核菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10作為刺激抗原。每孔加入含2．5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，第2天洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，2～8℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min，去離子水終止反應(yīng)。通過CTL酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)記錄斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)＜6時(shí)，任一試驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，結(jié)果即為陽(yáng)性;若空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，任一試驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔斑點(diǎn)數(shù)結(jié)果即為陽(yáng)性。

1.3.2 TST檢測(cè)方法:對(duì)所有入選者皮內(nèi)注射5 IU(1∶2000)的人型PPD試劑(北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn))，72 h后觀察結(jié)果，有紅腫硬結(jié)且硬結(jié)直徑≥15 mm者或有水泡或破潰者判為PPD試驗(yàn)陽(yáng)性，否則判為陰性［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 18．0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用 χ2檢驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 T-Spot．TB檢測(cè)與TST檢測(cè)結(jié)果 結(jié)核組TSpot．TB檢測(cè)陽(yáng)性213例(92.61%)，對(duì)照組37例(18.50%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=200.79，P＜0.05)。結(jié)核組 TST檢測(cè)陽(yáng)性108例(46.96%)，對(duì)照組為63例(31.50%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.67，P＜0.05)。結(jié)核組TSpot．TB 檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于 TST(χ2=56．83，P ＜0.05)。

2.2 性別對(duì)檢出陽(yáng)性率的影響 結(jié)核組男性TSpot．TB 檢測(cè)陽(yáng)性109例(91．60%)，女性檢測(cè)陽(yáng)性104例(93．69%);男性 TST檢測(cè)陽(yáng)性 57例(47.90%)，女性檢測(cè)陽(yáng)性51例(45.95%)。兩種檢測(cè)方法在不同性別檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。

3 討論

結(jié)核病是目前全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球共有約1/3的人感染了結(jié)核分枝桿菌。盡管目前臨床抗結(jié)核治療方案愈來愈規(guī)范，但診斷肺結(jié)核的檢測(cè)手段仍無明顯進(jìn)展。痰的結(jié)核分枝桿菌檢查是確診活動(dòng)性肺結(jié)核的特異性方法，但由于檢測(cè)痰菌陽(yáng)性率較低，菌陰肺結(jié)核占據(jù)了活動(dòng)性肺結(jié)核的60%［6］，因此如何快速早期診斷及時(shí)治療菌陰肺結(jié)核，對(duì)我國(guó)結(jié)核病的防治工作非常重要。

TST檢測(cè)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染已近百年歷史，至今仍作為輔助診斷肺結(jié)核的重要指標(biāo)之一［7］。但由于TST所用的某些抗原成分與卡介苗及結(jié)核菌的某些抗原成分相同，而我國(guó)卡介苗接種率及結(jié)核感染率較高，TST檢測(cè)對(duì)于肺結(jié)核的診斷特異度較低。因此臨床上將判斷結(jié)核感染的TST檢測(cè)紅腫硬塊直徑提高到15 mm，以增加TST檢測(cè)的特異性，但檢出率卻大幅降低。本研究結(jié)果表明結(jié)核組TST陽(yáng)性檢出率為46．96%，對(duì)照組中陽(yáng)性檢出率為31．50%。提示TST仍可作為輔助診斷菌陰肺結(jié)核的方法。但有研究表明，TST不適宜HIV感染者、幼年兒童等結(jié)核感染高危人群［8］。

IGRAs也是通過檢測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌的方法。有研究表明，該技術(shù)已經(jīng)成為一種新的判斷結(jié)核分枝桿菌感染的快速輔助方法［9］。人體初次感染結(jié)核分枝菌后T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為記憶T淋巴細(xì)胞，當(dāng)人體再次感染結(jié)核分枝桿菌時(shí)會(huì)迅速產(chǎn)生效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。而IFN-γ是機(jī)體在免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子。IGRAs是利用結(jié)核特異抗原:早期分泌抗原靶6 kD(early secretory antigenic target 6000)ESAT-6、培養(yǎng)濾液蛋白10 kD(culture filtrate protein 10 000)CFP-10，通過ELISPOT檢測(cè)受試者體內(nèi)結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞來判斷受試者是否感染結(jié)核的新方法［10］。有研究結(jié)果表明，T-Spot．TB檢測(cè)的綜合敏感性為90%，即使在免疫力低下的人群中仍有較高的陽(yáng)性率［11-12］。本研究結(jié)果表明在菌陰肺結(jié)核的診斷方面，T-Spot．TB檢測(cè)陽(yáng)性率較TST 高，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相符［13］，此為 T-Spot．TB檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)之一。

由于T-Spot．TB檢測(cè)是以結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原ESAT-6和CFP-10為抗原，這些抗原的蛋白編碼位于結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)基因片段RD-1，該基因片段不存在非結(jié)核分枝桿菌及牛分枝桿菌(包含卡介苗)中［14］。而PPD是含200種蛋白的混合物，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介菌的共同抗原成分。由于結(jié)核分枝桿菌自身生長(zhǎng)特點(diǎn)以及卡介苗接種在我國(guó)的廣泛使用，TST對(duì)結(jié)核病診斷特異性不高。而T-Spot．TB檢測(cè)可有效避免假陽(yáng)性結(jié)果及篩查結(jié)核分枝桿菌感染［15］。另外，IGRA試驗(yàn)設(shè)置了陽(yáng)性與陰性對(duì)照，可除外患者基礎(chǔ)免疫狀態(tài)及污染所致的結(jié)果不準(zhǔn)確［16］，而且結(jié)核分枝桿菌IGRAs TSpot．TB檢測(cè)作為一種體外特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)技術(shù)與TST檢測(cè)相比無需回訪且結(jié)果判讀更為客觀。

本研究提示，IGRAs T-Spot．TB檢測(cè)較 TST在菌陰肺結(jié)核中檢出陽(yáng)性率更高。但由于IGRAs的檢測(cè)成本較高，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室及標(biāo)本采集要求較高，致使目前尚無法在基層醫(yī)院廣泛推廣使用;此外，由于臨床所獲研究樣本數(shù)量有限，IGRAs對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷價(jià)值尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。

［1］ 全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組．2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］．中國(guó)防癆雜志，2002，24(2):65-108．

［2］ 劉菲，張宗德，操敏，等．酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)和結(jié)核菌素試驗(yàn)在初治肺結(jié)核中的輔助診斷價(jià)值［J］．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(4):443-448．

［3］ Kim SH，Choi SJ，Kim H B，et al．Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis［J］．Arch Intern Med，2007，167(20):2255-2259．

［4］ Mazurck G H，Jereb J，Vernon A，et al．Updated guidelines for using Interferon Gamma Release Assay to detect Myeobaeterium tuberculosis infection-United Ststes，2010［J］．MMWR Recomm Rep，2010，59(RR-5):1-25．

［5］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分學(xué)會(huì)．肺結(jié)核診斷和治療指南［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24(2):116-119．

［6］ 楊新婷，李琦．γ-干擾素釋放試驗(yàn)在活動(dòng)性肺結(jié)核病中的診斷價(jià)值［J］．結(jié)核病與胸部腫瘤，2009(4):303-307．

［7］ 張向東，鄭蓉蓉，何水珍，等．TB-IGRA與TST檢測(cè)菌培養(yǎng)陽(yáng)性肺結(jié)核患者比較［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28(5):464-466．

［8］ 廉國(guó)利，王亞亭．干擾素釋放試驗(yàn)對(duì)兒童隱性結(jié)核感染的診斷價(jià)值［J］．臨床兒科雜志，2010，28(2):116-119．

［9］ 賈紅彥，蘭汀隆，劉菲，等．酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的輔助診斷價(jià)值［J］．北京醫(yī)學(xué)，2012，34(10):867-870．

［10］劉菲，張宗德，高孟秋，等．不同抗原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核病的輔助診斷價(jià)值比較［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32(11):838-841．

［11］ Pai M，Zwerling A，Menzies D．Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis oflatent tuberculosis infection:an update［J］．Ann intern Med，2008，149(3):177-184．

［12］駱寶建，呂平欣．γ干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用［J］．北京醫(yī)學(xué)，2012，34(9):840-842．

［13］熊勇超，侯月云，趙建忠，等．γ干擾素釋放試驗(yàn)在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染中的應(yīng)用［J］．中國(guó)防癆雜志，2012，34(9):613-616．

［14］ Alton B F，John A B．QuantiFERON-TB gold assays for tuberculosis infection［J］．Clin Microbiol Newsletter，2007，29(17):129-135．

［15］王蘭，梁艷，吳雪瓊，等．2009年駐京部隊(duì)入伍新兵結(jié)核感染及隨訪情況分析［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37(8):827-832．

［16］葛燕萍，肖和平．γ干擾素釋放試驗(yàn)與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)輔助檢測(cè)肺外結(jié)核病的比較［J］．中國(guó)防癆雜志，2014，36(3):194-197．