西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優(yōu)良乳酸菌的篩選

楊曉丹，原現(xiàn)軍，郭剛,2，崔棹茗，李君風(fēng)，白晰，巴桑，邵濤*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),飼草調(diào)制加工與貯藏研究所,江蘇 南京 210095； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,山西 太谷030801；3.西藏日喀則地區(qū)草原工作站，西藏 日喀則 857000)

?

西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優(yōu)良乳酸菌的篩選

楊曉丹1，原現(xiàn)軍1，郭剛1,2，崔棹茗1，李君風(fēng)1，白晰1，巴桑3，邵濤1*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),飼草調(diào)制加工與貯藏研究所,江蘇 南京 210095； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,山西 太谷030801；3.西藏日喀則地區(qū)草原工作站，西藏 日喀則 857000)

本研究對西藏地區(qū)豆科牧草青貯飼料中的乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定，以期得到優(yōu)良的乳酸菌菌株。以苜蓿和箭筈豌豆青貯飼料為試驗(yàn)材料，共分離得到6株同型發(fā)酵乳酸菌，經(jīng)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和16S rRNA序列分析，3株(LCG9，CG35和AG11)為戊糖片球菌，2株(LCG3和LAG1)為植物乳桿菌，1株(LA3)為彎曲乳桿菌；除AG11和LAG1在5℃，LCG9和AG11在pH 3.0和8.0生長微弱外，其余乳酸菌菌株均在5～20℃，pH 3.0～8.0及3.0%和6.5% NaCl培養(yǎng)液中生長良好。從耐低溫特性、產(chǎn)酸能力和發(fā)酵速率3個(gè)指標(biāo)考慮，植物乳桿菌LCG3最適宜用于西藏青貯飼料生產(chǎn)的乳酸菌菌種。

豆科牧草；青貯飼料；乳酸菌；分離；鑒定

西藏自治區(qū)是我國五大牧區(qū)之一，畜牧業(yè)是西藏農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。但是青藏高原平均海拔高達(dá)4000 m，自然氣候條件惡劣，寒冷季節(jié)長達(dá)7～9個(gè)月，導(dǎo)致牧草生長期短，季節(jié)性飼草不平衡，畜牧業(yè)生產(chǎn)陷入“夏肥、秋壯、冬瘦、春死”的惡性循環(huán)。為了滿足牧區(qū)反芻家畜冬春季節(jié)對飼草料的需求，將農(nóng)區(qū)富余的牧草及農(nóng)作物秸稈調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料是解決牧區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展困境的有效途徑之一[1-3]。

青貯原料中乳酸菌的種類、數(shù)量及活性是影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，早期的研究[4]發(fā)現(xiàn)在西藏青貯飼料生產(chǎn)中，添加商品乳酸菌制劑未能有效地改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，可能是由于商品乳酸菌制劑適宜生長溫度在30℃左右，難以適應(yīng)西藏高海拔、低溫和缺氧的極端氣候條件，其性能發(fā)揮受到了限制。因此發(fā)掘和利用青藏高原特有的本土乳酸菌種質(zhì)資源，發(fā)揮其適應(yīng)性強(qiáng)的特性，對于該地區(qū)優(yōu)質(zhì)青貯飼料的生產(chǎn)，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)牧草中附著乳酸菌或青貯飼料中乳酸菌的收集、分離、鑒定及其在青貯飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用備受關(guān)注。大部分研究結(jié)果表明[5-10]，青貯飼料中分離得到的優(yōu)良乳酸菌均能明顯改善青貯發(fā)酵品質(zhì)；部分異型乳酸菌還能抑制青貯飼料有氧暴露期間的腐敗變質(zhì)，提高其有氧穩(wěn)定性。有關(guān)研究報(bào)道[2]，在我國高海拔、低溫和缺氧的極端環(huán)境中進(jìn)行牧草青貯時(shí)能夠得到優(yōu)質(zhì)青貯飼料，幾乎沒有有氧腐敗現(xiàn)象發(fā)生，由此可以推測在我國青藏高原地區(qū)存在著適應(yīng)于極端環(huán)境的特殊乳酸菌種質(zhì)資源。

紫花苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)是西藏主要的栽培豆科牧草，具有適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好、蛋白質(zhì)含量及營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，經(jīng)常與禾本科牧草以混合青貯方式生產(chǎn)青貯飼料。本研究旨在從西藏豆科牧草青貯飼料中分離生物學(xué)特性優(yōu)良的乳酸菌菌株，從而為西藏青貯飼料添加劑的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

紫花苜蓿和箭筈豌豆種植于西藏日喀則地區(qū)草原工作站試驗(yàn)田(平均海拔3836 m，北緯29°16′，東經(jīng)88°51′)；該地區(qū)屬于高山亞寒帶半干旱季風(fēng)氣候，年均降雨量為422.4 mm，氣溫6.3℃，日照時(shí)數(shù)3233 h。紫花苜蓿和箭筈豌豆均處于結(jié)莢期，于2013年9月28日刈割，刈割后在田間用鍘刀切成2 cm左右，裝填至實(shí)驗(yàn)室青貯窖中壓實(shí)密封，置于室溫條件下保存，分別在青貯第5天，45 d時(shí)開窖取樣，對青貯飼料中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定。紫花苜蓿和箭筈豌豆青貯5和45 d各5個(gè)重復(fù)，共計(jì)20個(gè)青貯窖；實(shí)驗(yàn)室青貯窖，為容積2 L的圓柱狀塑料容器，有內(nèi)外兩層蓋，便于密封保存。

1.2 培養(yǎng)基，試劑及主要儀器設(shè)備

葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基參考Cai等[6]的方法配制，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，虎紅瓊脂培養(yǎng)基購自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司。

API CHL培養(yǎng)基和API 50 CH試劑條購自法國BioMerieux公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，PCR合成引物由上海英濰捷基生物科技有限公司合成。

主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡(OLMPUS)、立式壓力蒸汽滅菌器、PCR儀、超低溫冰箱、凝膠成像儀、電泳儀、紫外分光光度計(jì)(日立，U-2910)、pH計(jì)(HANNA pH211型)。

1.3 原材料的微生物成分分析

采用平板培養(yǎng)方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，在超凈工作臺中采用四分法取原材料樣品10 g，放入90 mL的無菌生理鹽水密封，置于常溫?fù)u床上搖動2 h。用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，取3個(gè)適宜梯度涂板，每個(gè)梯度2個(gè)平行。乳酸菌選用MRS培養(yǎng)基，好氧菌選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌選用虎紅瓊脂培養(yǎng)基，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d計(jì)數(shù)。

1.4 乳酸菌的分離與純化

分別取青貯5 和45 d后的青貯飼料同上述步驟進(jìn)行稀釋，選用GYP培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌的分離培養(yǎng)，挑選具有黃色透明環(huán)的菌株分離，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，35℃ 2～3 d，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。然后根據(jù)菌落的顏色、大小、光澤、形狀等選取典型菌株進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡鏡檢，過氧化氫酶試驗(yàn)；凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步認(rèn)定為乳酸菌菌株[2]，在MRS液體培養(yǎng)基中富集(35℃ 24 h)后加入等體積40%的甘油，分裝，-20℃保存，備用。

1.5 乳酸菌的生理生化特性檢測

1.5.1 不同溫度水平生長試驗(yàn) 將配制好的MRS培養(yǎng)液以每試管5 mL的量分裝好，在121℃高壓條件下滅菌15 min，將待測菌株培養(yǎng)液，以相同的接種量(0.1 mL)接入培養(yǎng)液中搖勻，塞子封口，分別置于5，10，15和20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中5和10℃培養(yǎng)5～7 d，其余培養(yǎng)3 ～5 d，觀察菌株的生長情況。

1.5.2 不同pH和鹽濃度水平生長試驗(yàn) 用鹽酸或氫氧化鈉將MRS培養(yǎng)液pH調(diào)至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0等7個(gè)水平，用分析純NaCl將MRS培養(yǎng)液的鹽濃度調(diào)至3.0%和6.5%兩個(gè)水平，同上述步驟，將待測菌株培養(yǎng)液以相同的接種量(0.1 mL)接入已滅菌培養(yǎng)液中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，觀察試驗(yàn)菌株的耐酸堿能力。

1.5.3 糖發(fā)酵試驗(yàn) 使用包含49種不同碳水化合物和一個(gè)對照的API 50 CHL進(jìn)行不同糖，醇發(fā)酵鑒定，在35℃條件下培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵結(jié)果。具體方法按照試劑盒的說明進(jìn)行。

1.6 乳酸菌菌株的16S rRNA序列測定

取30℃條件下培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)液各1 mL，13000 r/min離心10 min，沉淀物用于DNA提取，具體的操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。PCR選用細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)通用引物：27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 r(5′-TACCTTGTTACGACT-3′)。PCR反應(yīng)體系包括：2×PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性，94℃，5 min；變性，94℃，30 s；退火，55℃，30 s；延伸，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR純化產(chǎn)物送樣測序(上海英濰捷基生物科技有限公司)。

用BLAST將所測定菌株的16S rRNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，分析相似性。然后用MEGA6.0中的Clustal W對最近類群的序列進(jìn)行多重比較分析，并通過該軟件的鄰近法(neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支聚類的穩(wěn)定性用Bootstrap方法進(jìn)行2000次隨機(jī)重復(fù)取樣評價(jià)[2]。

1.7 優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選與確定

將分離并鑒定的菌株以3%的接種量接入已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；每隔4 h取1次樣品，測定培養(yǎng)液的pH值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線；用培養(yǎng)液做空白，在波長600 nm下測定樣品的吸光度值(OD值)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物計(jì)數(shù)

試驗(yàn)用紫花苜蓿和箭筈豌豆原材料中微生物成分如表1所示。 乳酸菌的數(shù)量較少，均為103cfu/g FW，霉菌數(shù)量為104cfu/g FW；箭筈豌豆中好氧菌的數(shù)量多于紫花苜蓿，達(dá)到3.2×107cfu/g FW，但酵母數(shù)量低于紫花苜蓿，只有3.0×103cfu/g FW。

2.2 乳酸菌的分離

挑選GYP培養(yǎng)基上具有黃色溶菌環(huán)的菌株分離，初步分離出86株乳酸菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、過氧化氫酶試驗(yàn)、通過不同溫度、不同pH和耐鹽性試驗(yàn)的比較，分離得到24株耐低溫、低pH的乳酸菌菌株，再對其進(jìn)行生長產(chǎn)酸試驗(yàn)，共得到6株生長迅速、產(chǎn)酸快的優(yōu)良乳酸菌菌株。菌株來源如表2所示：苜蓿青貯飼料共分離得到3株乳酸菌菌株，早期分離得到AG11，晚期分離得到LAG1和LA3；CG35來自發(fā)酵5 d箭筈豌豆青貯飼料，LCG3和LCG9分離于發(fā)酵45 d的箭筈豌豆青貯飼料。

表1 苜蓿和箭筈豌豆微生物分析

cfu:Colony forming unit；FW:鮮重Fresh weight.

2.3 乳酸菌的生理生化特性

乳酸菌的表型特征及生理特點(diǎn)如表3所示。6株乳酸菌菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、同型發(fā)酵乳酸菌，其中LCG9，CG35和AG11為乳酸球菌；LAG1，LA3和LCG3為乳酸桿菌。AG11和LAG1在5℃生長微弱，10～20℃生長旺盛；其余乳酸菌菌株均能在5～20℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出很強(qiáng)的生長活力。不同pH值和鹽濃度條件下的生長情況為：除LCG9和AG11在pH 3.0，pH 8.0條件下生長微弱外，其余乳酸菌菌株均能在pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0內(nèi)生長；所有乳酸菌菌株在3.0%和6.5%NaCl條件下生長旺盛，表明分離出的乳酸菌菌株具有耐低溫、耐酸堿和強(qiáng)的耐鹽特性。

乳酸菌菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表4所示：6株乳酸菌菌株均能利用核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，N-乙酰-葡萄糖胺，熊果苷，七葉靈，麥芽糖和海藻糖產(chǎn)酸。除LA3外，其余乳酸菌菌株均可利用L-阿拉伯糖，苦杏仁甙，纖維二糖和龍膽二糖，微弱利用葡萄糖酸鹽。從利用D-松二糖和山梨醇的情況來看，LAG1，LCG3和LA3可以利用其發(fā)酵產(chǎn)酸，但LCG9，CG35和AG11不能；除此之外，LAG1和LCG3能夠發(fā)酵甘露醇，α-甲基-D-甘露糖苷，水楊苷，乳糖，蜜二糖，蔗糖，松三糖和D-棉籽糖，而其余乳酸菌菌株不能。

2.4 分離乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列分析

結(jié)合圖1系統(tǒng)進(jìn)化樹和表5分離乳酸菌菌株的16S rRNA序列分析結(jié)果可知：LCG9，CG35和AG11與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)的進(jìn)化親緣度均為100%，LA3與彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)為97%，與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌序列相似性分別為100%，100%，100%和99.9%；因此，LCG9、CG35和AG11被準(zhǔn)確地鑒定為戊糖片球菌，LA3為彎曲乳桿菌。LAG1和LCG3與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳桿菌(Pediococcuspentosaceu)處于同一族群，進(jìn)化親緣度達(dá)到100%，并具有99.9%的序列相似性，故只通過16S rRNA序列比較，無法確定他們的種族。LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3在基因庫中的登錄號分別為：KJ806296，KJ806305，KJ806309，KJ806295，KJ809299和KJ806306。

表2 青貯飼料中分離的乳酸菌菌株

表3 青貯飼料中分離出的乳酸菌的特性

注：“+”陽性，“-”陰性；“W”弱陽性。

Note:“+”positive,“-”negative,“W” weakly positive.

2.5 分離的乳酸菌菌株的產(chǎn)酸及生長特性

分離乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率曲線如圖2所示，LAG1和LCG3的產(chǎn)酸速率最快，它們在0～8 h產(chǎn)酸迅速，8～12 h逐漸變緩，12 h以后趨于平穩(wěn)。其中LCG3早期產(chǎn)酸最快，培養(yǎng)12 h后，培養(yǎng)液pH降至3.9；16 h之后與LAG1表現(xiàn)出相似的產(chǎn)酸速率。LCG9，CG35，AG11和LA3在整個(gè)發(fā)酵過程中培養(yǎng)液pH值保持持續(xù)緩慢的下降趨勢，在發(fā)酵結(jié)束48 h時(shí)分別達(dá)到最低值3.82(LCG9)，3.83(CG35)，3.91(AG11)和3.95(LA3)，pH值均達(dá)到4以下，同樣具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

表4 分離出乳酸菌的糖發(fā)酵特性

注：“+”生長，“++”生長良好，“-”不生長,“W”微弱生長。

Note:“+”growth,“++”growth well,“-”non-growth,“W”growth weakly.

不同菌株的生長速率曲線見圖3，分離乳酸菌菌株的生長特性均為對數(shù)生長曲線；LCG3和LAG1在發(fā)酵過程中沒有明顯的遲滯期，培養(yǎng)0～2 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，2～8 h生長速度達(dá)到最快，8～10 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，16 h OD值分別達(dá)到2.512和2.382；在整個(gè)培養(yǎng)過程中，LCG3的生長速度最快，這一結(jié)果與產(chǎn)酸速率結(jié)果基本一致。LCG9，CG35，AG11和LA3生長速率較緩慢，早期培養(yǎng)遲緩期長，但后期培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度較高，20 h后OD值分別為2.203(LCG9)，2.185(CG35)，2.114(AG11)和2.185(LA3)，也表現(xiàn)出良好的生長特性。

3 討論

乳酸菌數(shù)量和活性是抑制不良微生物生長和減少發(fā)酵損失的一個(gè)重要因素，發(fā)酵品質(zhì)取決于青貯材料上初始乳酸菌數(shù)量和底物含量[8]。但自然條件下，植物本身附著的乳酸菌數(shù)量較低，而且主要為異型乳酸菌[9]，難以保證青貯發(fā)酵品質(zhì)。Pang等[11]曾報(bào)道：保證青貯發(fā)酵成功的最低乳酸菌數(shù)量為105cfu/g FW，本試驗(yàn)中，西藏地區(qū)箭筈豌豆和紫花苜蓿表面附著乳酸菌的數(shù)量均小于104cfu/g FW，不能滿足青貯發(fā)酵的最低需求。因此在西藏進(jìn)行青貯飼料生產(chǎn)時(shí)，僅靠材料上附著的乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵，來獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料較為困難。這樣，分離青貯飼料中生長迅速、耐酸能力強(qiáng)的優(yōu)良乳酸菌菌株顯得尤為重要。

圖1 乳酸菌菌株LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3及相關(guān)菌種進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relative positions of strains LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3，LA3 and related species as inferred by the neighbor-joining method with 16S rRNA gene sequences

在自然青貯過程中，環(huán)境溫度是影響乳酸菌活性的重要因素[12]。Cao等[13]在對不同季節(jié)的發(fā)酵TMR進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，冬季的低溫條件限制了乳酸發(fā)酵。青藏高原具有海拔高，氣溫低，晝夜溫差大等氣候特點(diǎn)，可能會抑制商品乳酸菌的生長及活性的發(fā)揮。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)：商品乳酸菌在20℃條件下生長活性會受到影響，不能很好地發(fā)揮作用。但本研究所分離得到的6株乳酸菌均具有較強(qiáng)的耐低溫特性，能夠在5℃條件下生長，在10℃時(shí)生長旺盛；其中LCG9，CG35，LCG3和LA3的耐低溫能力較強(qiáng)，在5℃條件下仍生長旺盛。體現(xiàn)了高寒環(huán)境分離的乳酸菌對低溫條件具有強(qiáng)的適應(yīng)特性。

表5 分離出的乳酸菌菌株16S rRNA基因序列分析

圖2 乳酸菌的酸產(chǎn)生速率Fig.2 Acid-production rate of lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria

McDonald等[8]歸納總結(jié)了作為理想的青貯接種菌必須滿足的條件為：1)生長旺盛，能夠競爭植物本身所附著的各種菌群；2)為同型發(fā)酵乳酸菌，能在盡量短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸；3)耐酸，能迅速降低pH值，4)可廣泛地利用各種可溶性糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖等。本試驗(yàn)所分離得到的6株乳酸菌菌株均為同型發(fā)酵乳酸菌；生長速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)，能迅速降低pH值；具有較強(qiáng)的耐酸特性，能夠在pH 3.0條件下生長，pH 3.5時(shí)生長旺盛；均滿足理想青貯接種劑的條件。其中LCG3和LAG1的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，但由于LAG1在5℃條件下生長微弱，而LCG3生長旺盛，因此LCG3最適宜于用作西藏地區(qū)青貯飼料生產(chǎn)用乳酸菌添加劑菌種。但其余乳酸菌菌株在10℃條件下生長能力強(qiáng)，培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液pH均降至4.0以下，OD值達(dá)到2.2左右，同樣具有制備乳酸菌添加劑的潛質(zhì)。

根據(jù)16S rRNA序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹，LCG9，CG35和AG11被準(zhǔn)確地鑒定為戊糖片球菌；LA3為彎曲乳桿菌。由圖1可知：LAG1和LCG3與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌處于同一族群，且進(jìn)化親緣度為100%；其中LCG3與植物乳桿菌，戊糖乳桿菌的序列相似性分別為100.0%和99.9%；LAG1分別為99.9%和99.8%。許多研究結(jié)果表明[15-18]：植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的16S rRNA序列只有2 bp的差別，表現(xiàn)出很高的序列相似性，故無法確定種族。結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊和其他研究結(jié)果[19]：戊糖乳桿菌可以利用L-阿拉伯糖，D-木糖和鼠李糖產(chǎn)酸，植物乳桿菌不利用鼠李糖產(chǎn)酸；Ennahar等[16]曾指出：植物乳桿菌能夠利用松三糖，D-棉籽糖和α-甲基-D-甘露糖苷發(fā)酵產(chǎn)酸，但戊糖乳桿菌不能。LCG3和LAG1能利用松三糖，D-棉籽糖，α-甲基-D-甘露糖苷和L-阿拉伯糖發(fā)酵產(chǎn)酸，但不利用鼠李糖和D-木糖，故被準(zhǔn)確地鑒定為植物乳桿菌。

本試驗(yàn)分離得到的植物乳桿菌、戊糖片球菌和彎曲乳桿菌均為青貯用常見乳酸菌菌種，這為制備優(yōu)良的青貯飼料添加劑提供了可能。對于分離所得的乳酸菌菌株能否很好地作為西藏及其他低溫地區(qū)青貯用乳酸菌添加劑以及如何確定添加劑量，還需要在后續(xù)試驗(yàn)中做進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究從西藏地區(qū)豆科牧草青貯飼料中分離得到6株優(yōu)良乳酸菌菌株。經(jīng)過糖發(fā)酵試驗(yàn)和16S rRNA序列分析，3株為戊糖片球菌，2株為植物乳桿菌，1株為彎曲乳桿菌。6株乳酸菌菌株均為同型發(fā)酵乳酸菌，具有耐低溫，耐酸堿，強(qiáng)的耐鹽特性，其中植物乳桿菌LCG3產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵速度最快，最適宜于用作青藏高原青貯飼料生產(chǎn)用乳酸菌添加劑。

[1] Qin Y, Li X Z, Jiang W Q,etal. An investigation of nutrition components and types in Tibet main crop straws and pastures. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(5): 122-129.

[2] Yang Y, Shi C, Guo X S. Characterization and identification ofWeissellaspecies isolated fromKobresialittledaleigrowing in alpine meadows. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(1): 266-275.

[3] Li J F, Sun X H, Yuan X J,etal. Effect of adding acetic acid on fermentation quality and aerobic stability of mixed oat and alfalfa silage in Tibett. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 271-278.

[4] Wang Q, Yu C Q, Li Z H,etal. Effect of adding coenzyme and lactic acid bacteria on fermentation quality of mixed silages of tall fescue (Festucaarundinacea) and common vetch (Viciasativa) in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(4): 186-191.

[5] Zhao Q J, Yuan X J, Guo G,etal. Effect of adding an inoculant and molasses on fermentation quality of mixed silage of hull-less barley straw and perennial ryegrass in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(4): 100-106.

[6] Cai Y M, Kumai S, Ogawa M,etal. Characterization and identification ofPediococcusspecies isolated from forage crops and their application for silage preparation. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65: 2901-2906.

[7] Cai Y, Benno Y, Ogawa M,etal. Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics and aerobic deterioration of silage. Journal of Dairy Science, 1999, 82(3): 520-526.

[8] McDonald P, Henderson A R, Heron S J. The Biochemistry of Silage (2nd ed)[M]. Aberystwyth: Cambrian Printers Ltd, 1991.

[9] Torriani S, Dellaglio F, Palummeri M,etal. Detection and characterization of epiphytic lactic acid bacteria on growing plants of maize and lucerne. Annali di Microbiologia ed Enzimologia, 1992, 42: 49-59.

[10] Guo G, Sun X H, Qiu X Y,etal. Characterization of two acid bacteria and their influence on silage fermentation of napiergrass. Pakistan Veterinary Journal, 2014, 34(2): 170-174.

[11] Pang H, Tan Z, Qin G,etal. Phenotypic and phylogenetic analysis of lactic acid bacteria isolated from forage crops and grasses in the Tibetan Plateau. The Journal of Microbiology, 2012, 50(1): 63-71.

[12] Weinberg Z G, Szakacs G, Ashbell G,etal. The effect of temperature on the ensiling process of corn and wheat. Journal of Applied Microbiology, 2001, 90(4): 561-566.

[13] Cao Y, Cai Y, Hirakubo T,etal. Fermentation characteristics and microorganism composition of total mixed ration silage with local food by-products in different seasons. Animal Science Journal, 2011, 82(2): 259-266.

[14] Liu Q H, Chen M, Zhang J,etal. Characteristics of isolated lactic acid bacteria and their effectiveness to improve stylo (StylosanthesguianensisSw.) silage quality at various temperatures. Animal Science Journal, 2012, 83(2): 128-135.

[15] Tan Z F, Pang H L, Duan Y H,etal. 16S ribosomal DNA analysis and characterization of lactic acid bacteria associated with traditional Tibetan Qula cheese made from yak milk. Animal Science Journal, 2010, 81(6):706-713.

[16] Ennahar S, Cai Y, Fujita Y. Phylogenetic diversity of lactic acid bacteria associated with paddy rice silage as determined by 16S ribosomal DNA analysis. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 444-451.

[17] Tohno M, Kobayashi H, Nomura M,etal. Genotypic and phenotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from Italian ryegrass silage. Animal Science Journal, 2012, 83(2): 111-120.

[18] Pang H L, Qin G Y, Tan Z F,etal.Natural populations of lactic acid bacteria associated with silage fermentation as determined by phenotype， 16S ribosomal RNA and recA gene analysis. Systematic and Applied Microbiology, 2011, (34): 235-241.

[19] Bal E B B, Bal M A. Effects of chemical additives and ensiling time on whole plant wheat silage microbial profiles inferred by phenotypic and 16S ribosomal DNA analyses. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(2): 767-776.

參考文獻(xiàn)：

[1] 秦彧, 李曉忠, 姜文清, 等. 西藏主要作物與牧草營養(yǎng)成分及其營養(yǎng)類型研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(5): 122-129.

[2] 楊楊, 石超, 郭旭生. 高寒草甸魏斯氏乳酸菌的分離鑒定及理化特性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(1): 266-275.

[3] 李君風(fēng), 孫肖慧, 原現(xiàn)軍, 等. 添加乙酸對西藏燕麥和紫花苜蓿混合青貯發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(5): 271-278.

[4] 王奇, 余成群, 李志華, 等. 添加酶和乳酸菌制劑對西藏葦狀羊茅和箭筈豌豆混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(4): 186-191.

[5] 趙慶杰， 原現(xiàn)軍, 郭剛, 等. 添加糖蜜和乳酸菌制劑對西藏青稞秸稈和多年生黑麥草混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(4): 100-106.

Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet

YANG Xiao-Dan1, YUAN Xian-Jun1, GUO Gang1,2, CUI Zhao-Ming1, LI Jun-Feng1, BAI Xi1, BA Sang3, SHAO Tao1*

1.InstituteofEnsilingandProcessingofGrass,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.ThePrairieWorkstationofShigatse,Tibet,Rikze857000,China

The objectives of this study were to identify lactic acid bacteria with desirable attributes by isolating and identifying lactic acid bacteria (LAB) from legume silages in Tibetan Plateau. A total of 6 homofermentiative lactic acid bacteria were isolated from alfalfa (Medicagosativa) and common vetch (Viciasativa) silage. Strains LCG9, CG35 and AG11 were identified asPediococcuspentosaceus, strains LCG3 and LAG1 asLactobacillusplantarumand strain LA3 asLactobacilluscurvatu. Conventional microbial identification methods and 16S rRNA sequencing analyses were used to identify different strains. The selected strains were grown in a range of conditions; temperature 5-20℃, pH 3.0-8.0 and NaCl 3.0% and 6.5%. LCG9 and AG11 grew weakly at 5℃ while LCG9 and AG11 were inactive at pH 3.0 and pH 8.0. LCG3 was identified as the best strain to use as a silage additive in Tibet due to its unique tolerance of low temperature, high lactic acid production and rapid reproductive rate.

Legume grass; silage; lactic acid bacteria; isolation; identification

10.11686/cyxb2014312

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-07-14；改回日期：2014-10-21

中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃(STS計(jì)劃)(KFJ-EW-STS-071)，國家星火計(jì)劃項(xiàng)目課題(2013GA840003)，“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2011BAC09B03)和農(nóng)業(yè)部成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2013GB2F40046)資助。

楊曉丹(1990-)，女，河南洛陽人，在讀碩士。E-mail: yxd695114957@163.com *通訊作者Corresponding author. E-mail: taoshaolan@163.com

楊曉丹, 原現(xiàn)軍, 郭剛, 崔棹茗, 李君風(fēng), 白晰, 巴桑, 邵濤. 西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優(yōu)良乳酸菌的篩選. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(6): 99-107.

Yang X D, Yuan X J, Guo G, Cui Z M, Li J F, Bai X, Ba S, Shao T. Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 99-107.