烏司他丁保護百草枯中毒大鼠肺免受損傷的作用*

陳 達， 張洪穎， 賈 浩， 朱 杰

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110032)

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烏司他丁保護百草枯中毒大鼠肺免受損傷的作用*

陳 達， 張洪穎， 賈 浩， 朱 杰△

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110032)

目的： 探討烏司他丁保護百草枯中毒大鼠肺免受損傷的作用及其機制。方法: Wistar大鼠108只，隨機分為對照組、百草枯組和烏司他丁組。百草枯組和烏司他丁組給予百草枯灌胃染毒，對照組給予無菌生理鹽水灌胃，烏司他丁組同時給予烏司他丁治療。1、3、7、14、21、28 d測血清中的MDA、SOD、IL-6、IL-10和TNF-α 水平，以及肺組織中的p38 MAPK、MMP-2和TIMP-1表達水平。結(jié)果: 1、3、7 d百草枯組和烏司他丁組的SOD均較對照組下降(P<0.01)，烏司他丁組SOD明顯高于百草枯組(P<0.05)。1、3、7 d百草枯組和烏司他丁組的MDA、IL-6、IL-10及TNF-α均較對照組增高(P<0.01)，烏司他丁組各指標明顯低于百草枯組(P<0.05)。1、3、7、14、21、28 d百草枯組和烏司他丁組肺組織中的p38 MAPK 及TIMP-1均較對照組增高(P<0.01)，烏司他丁組各指標明顯低于百草枯組(P<0.05)。1、3、7、14、21 d百草枯組和烏司他丁組肺組織中的MMP-2均較對照組增高(P<0.01)，烏司他丁組MMP-2明顯低于百草枯組(P<0.05)。結(jié)論: 烏司他丁通過抑制p38 MAPK信號通路及抗炎、抗氧化作用保護百草枯中毒大鼠肺免受損傷的作用。

烏司他?。?急性肺損傷； 百草枯； 絲裂原活化蛋白激酶； 金屬蛋白酶組織抑制物； 基質(zhì)金屬蛋白酶

百草枯(paraquat,PQ)是目前全球使用最廣的除草劑之一，隨著PQ在我國生產(chǎn)和使用量的增加，自殺性口服和誤服是急性PQ中毒的主要原因?？诜Q中毒者的病死率高達70%～80%[1-2]。最具特征的毒性作用是迅速發(fā)展的彌漫性肺損害，表現(xiàn)為早期的肺水腫、肺出血及肺不張等急性肺損傷(acute lung injury, ALI)病情進行性發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥[3]。如能度過一周的急性期，之后肺部損傷逐漸加重，不可逆發(fā)展為肺纖維化，后期多死于呼吸衰竭。雖然各國學者對此作了廣泛深入的研究，但至今仍未完全明了PQ中毒機制，亦無有效拮抗藥物。最新的研究表明，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK)作為MAPK家族的成員，其信號傳導通路在炎性反應性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要調(diào)控作用。p38 MAPK是細胞信號傳遞的交匯點或共同通路，能被多種炎性刺激所激活，包括應激和細胞因子(如IL-1、TNF)等作用，參與介導細胞應激反應、免疫反應和細胞生長、分裂、增殖等多種過程[4]。烏司他丁(ulinastatin, UTI)是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，其主要功能為穩(wěn)定溶酶體膜，清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放及免疫調(diào)節(jié)作用[5]，但是其詳細的作用機制還不十分明確。本研究通過檢測血清中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10及TNF-α 含量及肺組織中磷酸化p38 MAPK、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和TIMP-1的水平，探討烏司他丁保護百草枯中毒大鼠肺免受損傷的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 動物及試劑

健康Wistar大鼠108只，雌雄各半，清潔級，體重240～260 g，由中國醫(yī)科大學動物中心提供。百草枯(Sigma)；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(博奧森公司)；兔抗大鼠磷酸化p38 MAPK多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-2多克隆抗體和兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體(Abcam)；IL-6、IL-10和TNF-α ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及動物模型制作 108只大鼠隨機分成對照組、PQ染毒組和烏司他丁組。每組又分為1、3、7、14、21、28 d 6個亞組，每組6只。對照組給予l mL生理鹽水(normal saline, NS)一次性灌胃，2 h后給予NS 1 mL腹腔注射；PQ染毒組用PQ按40 mg/kg用NS稀釋到1 mL一次性灌胃染毒，2 h后給予NS 1 mL腹腔注射；烏司他丁組用PQ按40 mg/kg用NS稀釋到1 mL一次性灌胃染毒，2 h后給予烏司他丁(1×105U/kg)稀釋到1 mL腹腔注射。

2.2 肺組織病理分析 取實驗各組肺組織，經(jīng)中性甲醛固定后石蠟包埋、切片、考片、HE染色及Masson染色，光鏡下觀察病理變化。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-6、IL-10及TNF-α 按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2.4 血清MDA和SOD指標測定 采用硫代巴比妥酸法測定血清MDA含量，單位為μmol/L； 采用黃嘌呤氧化酶法測定血清總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活力，單位為1×103U/L。

2.5 大鼠肺組織p-p38 MAPK、MMP-2及TIMP-1的細胞定位及水平測定 采用的免疫組織化學分析法為SABC法。免疫組織化學方法檢測p-p38 MAPK、MMP-2及TIMP-1蛋白的結(jié)果判定以胞膜/胞漿/胞核出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為陽性標記。采用華東理工大學自動化所細胞免疫組織化學分析系統(tǒng) Version 2.0，隨機選取5個完整且不重疊的高倍視野，計算陽性面積所占百分比，取其平均值進行統(tǒng)計學處理。

2.6 Western botting測定p-p38 MAPK、MMP-2及TIMP-1蛋白的水平 稱取肺組織后，0.5 mL預冷的Tris緩沖液每100 mg肺組織，提取胞漿蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取各組胞漿蛋白，加入等體積10% SDS上樣緩沖液，沸水浴10 min，冷卻后上樣行垂直凝膠電泳。水浴電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5% BSA溶液封閉，室溫振蕩4 h，1×TBST洗膜20 min 3次，分別加入兔抗大鼠I抗1∶1 000，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜20 min 3次。之后分別加入相應的辣根過氧化物酶標記的II抗l∶2 000 孵育4 h。1×TBST洗膜20 min 3次。ECL試劑顯色并曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)成像，Bio-Rad Quantity One軟件對條帶進行半定量分析，目的蛋白相對含量分別以其與GAPDH特異性條帶的積分吸光度之比值表示。

3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 肺組織病理改變

HE染色顯示，對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰。染毒組3 d、7 d出現(xiàn)明顯肺泡炎性改變，肺間質(zhì)和肺泡水腫達到高峰，肺泡腔充滿粉染均質(zhì)的水腫液，伴有血管內(nèi)皮細胞損傷，彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷；14 d、21 d炎性改變減輕，但仍有出血及水腫，成纖維細胞增生，肺間隔明顯增寬、組織增生明顯；28 d病變范圍彌散，大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷、破壞，大量膠原沉積在新生的毛細血管周圍、肺泡間隔以及部分肺泡腔被膠原纖維占據(jù)。經(jīng)烏司他丁治療后肺內(nèi)病變較染毒組減輕，改善了大鼠急性肺泡炎病理改變，同時對后期膠原纖維增生有一定抑制作用。

Masson染色顯示，對照組支氣管周圍及肺泡間隔區(qū)有少量綠色的膠原纖維。染毒組14 d肺泡腔內(nèi)滲出液機化，肺泡壁增厚，支氣管周圍及肺泡間隔的膠原纖維較為纖細，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細胞增生、肥大；21 d病變范圍彌散，支氣管周圍、肺泡間隔進一步纖維性增厚，灶性纖維形成，成纖維細胞增生明顯；28 d成纖維細胞大量增殖，支氣管周圍、肺泡間隔及肺泡內(nèi)有大量粗大的膠原纖維束不規(guī)則排列，大量肺泡萎陷或消失。經(jīng)烏司他丁治療后肺內(nèi)病變分別較染毒組減輕，1～7 d未見明顯膠原纖維增生；染毒14 d以后可見膠原纖維明顯少于染毒組。

2 血清中SOD及MDA的變化

大鼠在染毒后1 d血清SOD活性急劇下降，3 d最低、7 d逐漸上升但仍低于對照組，14 d上升至對照組的水平。與對照組比較，1、3、7 d活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。烏司他丁組，大鼠血清SOD活力明顯增加，1、3及7 d 的SOD活力較染毒組明顯升高(P<0.05)，低于對照組(P<0.01)，其它時點與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。血清MDA含量的變化與SOD活性呈現(xiàn)相反的變化，見表1。

3 血清中IL-6、IL-10及TNF-α的變化

染毒組大鼠染毒后1 d的 IL-6、TNF-α及IL-10含量急劇升高，3 d達峰，7 d后水平略有下降但仍顯著高于對照組，14 d接近對照組水平。與對照組比較，1、3、7 d含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。烏司他丁組1、3、7 d 的IL-6、TNF-α及IL-10含量分別較染毒組明顯降低(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.01)，其它時點與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

4 大鼠肺組織MMP-2、TIMP-1及p-p38 MAPK免疫組織化學檢測結(jié)果

4.1 MMP-2及TIMP-1免疫組織化學檢測結(jié)果 對照組大鼠肺組織MMP-2及TIMP-1有少量表達。染毒組大鼠肺組織中MMP-2的表達從1 d就明顯增強(P<0.01)；14 d達高峰，此后開始下降，但直至染毒后21 d仍明顯強于對照組(P<0.05)；28 d以后與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。而TIMP-1的表達從1 d就明顯增多(P<0.01)；21 d達高峰；以后持續(xù)維持較高水平，至28 d仍明顯高于對照組(P<0.01)。烏司他丁組，肺組織中MMP-2明顯減弱，在1～21 d，與PQ組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組比較均高于對照組(P<0.05)。烏司他丁組肺組織中TIMP-1明顯減弱，21 d達峰，在1～28 d，與染毒組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組比較均高于對照組(P<0.05)，見圖1、2。

表1 血清中MDA及SOD的變化

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPQ.

4.2 p-p38 MAPK在大鼠肺組織中的表達與分布 對照組大鼠肺組織 p-p38 MAPK有少量表達。染毒組大鼠肺組織中p-p38 MAPK蛋白水平1 d即明顯增加，可見陽性細胞明顯增多，范圍增大，胞漿內(nèi)棕黃色顆粒著色較深，呈團塊狀分布，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，14 d達峰，至28 d p-p38 MAPK仍呈明顯陽性，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。烏司他丁組肺組織中p-p38 MAPK的水平明顯減低，在1～28 d，分別與染毒組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組比較均高于對照組(P<0.05)，見圖3。

表2 血清中IL-6、IL-10及TNF-α變化

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPQ.

Figure 1.Comparison of MMP-2 positive cells in each group (×400).

5 大鼠肺組織MMP-2、TIMP-1及p-p38 MAPK蛋白表達變化

大鼠肺組織MMP-2、TIMP-1及p-p38 MAPK蛋白變化與免疫組化結(jié)果相似。百草枯組14、21 d MMP-2/TIMP-1分別為 0.21和0.26，烏司他丁組14、21 d MMP-2/TIMP-1分別為 0.45和0.50，見圖4、5。

Figure 2.Comparison of TIMP-1 positive cells in each group (×400).

討 論

PQ又名克蕪蹤(gramoxone)，化學名為1,1’-二甲基-4,4’-聯(lián)吡啶陽離子鹽(1,1’-dimethy-4,4’-bipyridylium)。肺纖維化是PQ引起肺損傷的最終結(jié)局，而肺泡炎是肺纖維化形成的病理基礎和前奏，肺部炎癥導致了肺泡持續(xù)性損傷及細胞外基質(zhì)(extra-cellular matrix，ECM)的反復破壞、修復、重建和過度沉積。由于在PQ中毒引起的肺損傷有多種促炎及纖維化細胞因子參與，其中p38 MAPK作為MAPK家族的成員，其信號轉(zhuǎn)導通路在炎性反應性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要調(diào)控作用，能被多種炎性刺激所激活，參與介導細胞應激反應、免疫反應和細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種過程[6-7]。我們的研究已證實，經(jīng)烏司他丁干預后，肺組織中p-p38 MAPK明顯減弱，在1～28 d，分別與染毒組比較均有統(tǒng)計學意義。我們認為，PQ中毒時在炎癥因子和生長因子作用下，p-p38 MAPK水平增加、活性增強，從而蛋白質(zhì)合成能力和翻譯效率提高，導致蛋白質(zhì)合成增加、肺泡細胞肥大和成纖維細胞增生。因此，肺組織的p-p38 MAPK在百草枯中毒的ALI過程中是被激活的，這與PQ中毒肺損傷嚴重程度直接相關(guān)，應用烏司他丁治療后，肺損傷明顯減輕。

Figure 3.Comparison of p-p38 MAPK positive cells in each group (×400).

Figure 4.The protein expression of MMP-2 and TIMP-1 in each group.

Figure 5.The protein expression of p-p38 MAPK in each group.

烏司他丁作為一種蛋白酶抑制劑，其抑酶譜廣泛，可以抑制多種蛋白酶以及糖、脂類水解酶的活性，穩(wěn)定溶酶體膜，同時可減少血管內(nèi)皮細胞，中性粒細胞及巨噬細胞的損傷，抑制了體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生及細胞因子網(wǎng)絡的形成[8-9]。Ito等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在靜脈注射油酸所致的大鼠ALI模型中，靜脈注射烏司他丁能顯著改善肺組織病理學改變，提高PaO2，改善肺血管通透性及降低肺組織TNF-α水平。本實驗表明，烏司他丁能降低p-p38 MAPK、TNF-α和IL-6的水平，同時也抑制抗炎介質(zhì)IL-10的表達，從而減輕肺組織炎癥反應的程度。本研究也發(fā)現(xiàn)給予烏司他丁后分別與染毒組相比較，血漿中MDA含量下降，SOD升高，提示烏司他丁可對抗PQ的氧化性損害，并有增強機體抗氧化的能力，抑制脂質(zhì)過氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁干預后與染毒組大鼠比較，烏司他丁干預組大鼠的中毒反應較輕，HE、Masson染色結(jié)果顯示早期肺出血、水腫、炎細胞浸潤，晚期的成纖維細胞增生、肺泡萎陷、膠原沉積的情況, 肺纖維化程度都相對較輕,也進一步表明烏司他丁減輕百草枯中毒的肺損傷程度。

近年來研究表明，肺間質(zhì)纖維化是ECM的過度沉積造成的，這種過度沉積不僅是由于ECM合成增多，更大程度上是ECM降解減少即合成和降解不平衡引起的[11]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)在ECM合成/降解的調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用，而在某些MMPs基因的啟動子區(qū)域存在有p38 MAPK的結(jié)合位點[12]?；贛MPs及TIMPs在肺纖維化病程中的重要作用，尋求它們之間的平衡已成為肺纖維化治療的途徑之一。本研究表明烏司他丁組肺組織中MMP-2、TIMP-1表達較染毒組同時點明顯減弱。烏司他丁干預后矯正MMP-2 /TIMP-1不平衡比例，特別是百草枯組在14、21 d 的MMP-2 /TIMP-1分別為 0.21和0.26，而烏司他丁組在14、21 d的MMP-2 /TIMP-1分別為 0.45和0.50，表明烏司他丁通過對百草枯的肺纖維化大鼠組織MMP-2和TIMP-1的表達量進行調(diào)節(jié)，使MMPs/TIMPs趨于平衡，延緩纖維化的發(fā)生。

綜上所述，烏司他丁抑制p38 MAPK信號通路，可明顯降低百草枯中毒大鼠血清MDA含量，增加SOD活力；降低血清炎癥因子TNF-α、IL-6及抗炎因子 IL-10水平；減少MMP-2和TIMP-1表達，矯正MMPs/TIMPs的不平衡。烏司他丁可減輕染毒大鼠肺組織早期的炎性改變及后期的肺纖維化趨勢，從而保護百草枯中毒肺免受損傷。

[1] Sun S, Wang H, Zhao G, et al. Complement inhibition alleviates paraquat-induced acute lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 45(4):834-842.

[2] Dong XS, Hu XB, Liu W, et al. Effects of RNA interfe-rence-induced Smad3 gene silencing on pulmonary fibrosis caused by paraquat in mice[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2012, 237(5):548-555.

[3] Seifirad S, Keshavarz A, Taslimi S, et al. Effect of pirfenidone on pulmonary fibrosis due to paraquat poisoning in rats[J]. Clin Toxicol (Phila), 2012, 50(8):754-758.

[4] Ma T, Liu XW, Liu Z. Function of the p38MAPK-HSP27 pathway in rat lung injury induced by acute ischemic kidney injury[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013:981235.

[5] Gao C, Li R, Wang S. Ulinastatin protects pulmonary tissues from lipopolysaccharide-induced injury as an immunomodulator[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2012,72(1):169-176.

[6] Ding HD, Zhang XH, Xu SC,et al. Induction of protection against paraquat-induced oxidative damage by abscisic acid in maize leaves is mediated through mitogen-activated protein kinase[J]. J Integr Plant Biol, 2009, 51(10):961-972.

[7] Klintworth H, Newhouse K, Li T, et al. Activation of c-Jun N-terminal protein kinase is a common mechanism underlying paraquat- and rotenone-induced dopaminergic cell apoptosis[J]. Toxicol Sci, 2007, 97(1):149-162.

[8] Song Z, Chen G, Lin G, et al. The ultra-early protective effect of ulinastatin on rabbit acute lung injury induced by paraquat[J]. BMC Emerg Med, 2013, 13(Suppl 1):S7.

[9] Bae HB, Jeong CW, Li M, et al. Effects of urinary trypsin inhibitor on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rabbits[J]. Inflammation, 2012, 35(1):176-182.

[10]Ito K, Mizutani A, Kira S, et al. Effect of ulinastatin, a human urinary trypsin inhibitor, on the oleic acid-induced acute lung injury in rats via the inhibition of activated leukocytes[J]. Injury, 2005, 36(3):387-394.

[11]Tung JN, Lang YD, Wang LF, et al. Paraquat increases connective tissue growth factor and collagen expression via angiotensin signaling pathway in human lung fibroblasts[J].ToxicolInVitro, 2010, 24(3):803-808.

[12]Wang BL, Tu YY, Fu JF, et al. Unbalanced MMP/TIMP-1 expression during the development of experimental pulmonary fibrosis with acute paraquat poisoning[J]. Mol Med Report, 2011, 4(2):243-248.

Ulinastatin protects rat pulmonary tissues from paraquat-induced acute injury

CHEN Da, ZHANG Hong-ying, JIA Hao, ZHU Jie

(DepartmentofEmergency,TheFourthAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China.E-mail:chenda2006@sina.com)

AIM: To investigate the protective effects of ulinastatin on the rats with paraquat-induced acute lung injury and its mechanisms. METHODS: The Wistar rats (n=108) were randomly divided into control group, paraquat group and ulinastatin group. The rats in paraquat group and ulinastatin group were given paraquat by gavage, while the rats in control group were given sterile saline by gavage. The rats in ulinastatin group were also given ulinastatin treatment. The serum levels of MDA, SOD, IL-6, IL-10 and TNF-α were measured after 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d. The expression levels of p38 MAPK, MMP-2 and TIMP-1 in the lung were also measured. RESULTS: The levels of SOD in 1 d, 3 d and 7 d in paraquat group and ulinastatin group were significantly lower than those in control group (P<0.01). The level of SOD in ulinastatin group was significantly higher than that in paraquat group (P<0.05). The levels of MDA, IL-6, IL-10 and TNF-α in 1 d, 3 d and 7 d in paraquat group and ulinastatin group increased compared with control group (P<0.01), and those in ulinastatin group were significantly lower than those in paraquat group (P<0.05). The levels of p38 MAPK and TIMP-1 in 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d in paraquat group and ulinastatin group were higher than those in control group (P<0.01), and those in ulinastatin group was significantly lower than those in paraquat group (P<0.05). The level of MMP-2 in 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 21 d in paraquat group and ulinastatin group increased compared with control group (P<0.01), and that in ulinastatin group was significantly lower than that in paraquat group (P<0.05).CONCLUSION: Ulinastatin protects the lung tissues of rats from paraquat-induced acute lung injury by inhibiting p38 MAPK signaling pathway and ameliorating inflammatory and oxidative responses.

Ulinastatin; Acute lung injury; Paraquat; Mitogen-activated protein kinases; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Matrix metalloproteinases

1000- 4718(2015)01- 0166- 06

2014- 08- 20

2014- 09- 30

遼寧省自然科學基金資助項目(No. 2013021059)；中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院青年創(chuàng)新發(fā)展計劃(No. 2012YA1217)

△通訊作者 Tel: 024-62043477; E-mail: chenda2006@sina.com

R363； R595.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.031