人胃癌及癌旁組織RNA氧化損傷水平的比較及臨床意義

林憲慧， 余俊華， 林海鴻， 屠洋洋， 羅順斌， 徐 濤， 陳 統(tǒng)， 林型城， 葉孫志， 鄭志強(qiáng)△， 蔡劍平△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027； 2衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

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人胃癌及癌旁組織RNA氧化損傷水平的比較及臨床意義

林憲慧1， 余俊華1， 林海鴻1， 屠洋洋1， 羅順斌2， 徐 濤2， 陳 統(tǒng)1， 林型城1， 葉孫志1， 鄭志強(qiáng)1△， 蔡劍平2△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027；2衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

目的： 通過檢測(cè)人胃癌組織及其癌旁組織中的RNA氧化損傷程度，探討RNA氧化與胃癌發(fā)生的相關(guān)性。方法: 分別利用免疫組化方法和液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法對(duì)61例胃癌組織及其癌旁組織中8-氧鳥苷(8-oxoGsn)進(jìn)行定性和定量分析，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)果: 免疫組化結(jié)果檢測(cè)顯示8-oxoGsn在癌旁組織中含量低，而在胃癌組織中含量明顯增高，且棕色染色區(qū)域主要集中在腫瘤細(xì)胞胞漿位置。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示胃癌組織中8-oxoGsn含量較對(duì)應(yīng)癌旁組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: 8-oxoGsn在胃癌組織中含量增加。RNA氧化損傷可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

胃腫瘤； 免疫組織化學(xué)； 8-氧鳥苷； 液相-串聯(lián)質(zhì)譜

十幾年前，RNA的氧化損傷很少受到人們的關(guān)注。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為RNA損傷修復(fù)遠(yuǎn)不如DNA損傷修復(fù)重要。然而，隨著RNA甲基化損傷修復(fù)機(jī)制及RNA修復(fù)酶的發(fā)現(xiàn)，這一觀點(diǎn)受到了巨大的挑戰(zhàn)。據(jù)研究，與其它細(xì)胞組分相比，RNA更易受到氧化損傷。Nunomura等[1]采用原位免疫組化法檢測(cè)了阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)患者腦組織中的氧化核苷水平，結(jié)果顯示，大多數(shù)氧化核苷是由細(xì)胞質(zhì)RNA氧化而成，而不是細(xì)胞核DNA和線粒體DNA。在其它多種神經(jīng)退行性疾病、表達(dá)SOD1G93A突變體的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠模型(SOD1G93A小鼠)以及氧化應(yīng)激細(xì)胞培養(yǎng)模型中也觀察到這種現(xiàn)象[2-4]。這些研究表明，RNA比DNA更易受到氧化損傷。此外，SOD1G93A小鼠的RNA氧化研究顯示[2]，癥狀前期SOD1G93A小鼠的脊髓中，蛋白質(zhì)羰基化和脂質(zhì)過氧化水平不升高(或僅輕微地升高)，而RNA氧化水平顯著升高。這表明RNA可能比蛋白質(zhì)、脂類更易受到氧化損傷。RNA氧化修飾會(huì)干擾翻譯過程并使蛋白質(zhì)合成減少或合成錯(cuò)誤蛋白質(zhì)，這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞退化甚至死亡。也有學(xué)者認(rèn)為RNA氧化可能不是細(xì)胞死亡的結(jié)果，而是人類多種疾病(如阿爾茲海默病、帕金森病以及腫瘤)發(fā)病的一個(gè)早期事件[5]。雖然目前很少有文獻(xiàn)報(bào)道RNA氧化與腫瘤的關(guān)系。但是，根據(jù)大量的研究，我們發(fā)現(xiàn)RNA氧化損傷可能會(huì)加速多種人類疾病的惡化。因此為了更加深入的探討這個(gè)問題，筆者研究了RNA氧化損傷與胃癌發(fā)生之間的相關(guān)性。

細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生的多種自由基以及外源性自由基中，羥自由基(OH·)具有高反應(yīng)性，能引起生物大分子(包括RNA)的直接氧化損傷。由于羥自由基的高反應(yīng)性和不易擴(kuò)散性，在RNA附近生成的羥自由基可以很容易地對(duì)RNA進(jìn)行氧化修飾。因此，羥自由基介導(dǎo)的氧化修飾作用可能是RNA損傷的重要方式之一。目前發(fā)現(xiàn)，羥自由基能損傷20多種不同類型的堿基[6]。其中8-氧鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoGua)是最常見的RNA氧化堿基，是公認(rèn)的最重要的RNA氧化標(biāo)志物。因此本研究通過免疫組化法對(duì)胃癌及癌旁組織中8-氧鳥苷(8-oxoguanosine，8-oxoGsn)進(jìn)行檢測(cè)，并利用LC-MS/MS對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，從而來探討RNA氧化損傷與胃癌發(fā)生的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 材料、主要儀器和試劑

人胃癌組織61例及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本來自于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科2009～2013年間臨床病理確診的胃癌手術(shù)患者。其中男性45例，女性16例，患者臨床資料如表1所示，所有患者術(shù)前均未行放化療。取手術(shù)切除胃癌組織及癌旁15 cm以上組織，立即放于液氮中保存，該操作均術(shù)前告知患者及其家屬并簽署知情同意書。

Agilent 1290 Infinity液相系統(tǒng)、Agilent 6490 三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)、Qualitative Analysis B.06.00及QQQ Quantitative Analysis數(shù)據(jù)分析軟件(Agilent)；KUBOTA 3740低溫離心機(jī)(KUBOTA)；分光光度計(jì)(Eppendorf)；520A型pH計(jì)(ORION)；JY600C型電泳儀(中國(guó)君意東方電泳設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(中國(guó)北京長(zhǎng)城空氣凈化工程公司)；烤片機(jī)(中國(guó)天津天力機(jī)電有限公司)；冰凍切片機(jī)(Thermo)。

表1 組織來源患者的臨床病理資料

[13C,15N2]8-oxoGsn (Toronto Research Chemicals)；[15N5]Gsn(Cambridge Isotope Laboratories)；甲磺酸去鐵銨(Sigma)；TRIzol(Invitrogen)；蛋白酶K(AMERESCO)；核酸酶P1(WAKO)；堿性磷酸酶(NEB)；鼠抗8-oxoGua單克隆抗體(Abcam)；RNase-free DNase I(TaKaRa)；色譜級(jí)甲醇、乙腈、醋酸銨(Fisher Scientific)；免疫組化試劑盒PV6000、DAB顯色劑、抗體稀釋液、伊紅、蘇木素、丙酮(北京中衫金橋生物科技有限公司)；異丙醇、氯仿、乙醇、冰醋酸等試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 免疫組化 將已烘烤2 h并冷卻的冰凍切片水化5 min，用1% Triton X-100處理10 min使其破膜；PBS洗滌5 min×3次；37 ℃ DNase 1×106U/L處理1 h，PBS洗滌 5 min×3次；用正常山羊血清室溫孵育封閉30 min；吸棄封閉液后滴加適當(dāng)比例稀釋的小鼠來源抗8-oxoGua單克隆抗體(1∶100)之后4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌 5 min×3次；3%過氧化氫避光孵育20 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌 5 min×3次，以去除殘留的過氧化氫；II抗孵育30 min，PBS洗滌 5 min×3次；鏡下DAB控制顯色，約1 min，用水終止顯色；空白對(duì)照組用抗體稀釋液代替抗體孵育過夜；蘇木素染色1 min；鹽酸乙醇洗滌3次；水洗10 min；70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇依次脫水2 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ 分別透明5 min；明膠封片后鏡下觀察。

2.2 胃癌組織及癌旁組織RNA抗氧化提取并消化 取適量(約100 mg)組織于研缽，加入液氮，將組織研磨成細(xì)粉(防止組織融化)；取粉末裝于1.5 mL EP管；加入1 mL TRIzol(含1 mmol/L甲磺酸去鐵銨，進(jìn)一步降低RNA在體外的人為氧化)，吹打混勻，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，蓋緊蓋子，用手搖勻15 s，室溫靜置3 min；4 ℃、12 000×g離心10 min；取上層約500 μL至一新的EP管；加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min；4 ℃、12 000×g離心10 min；此時(shí)可見白色沉淀，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌(0.1% DEPC水配制)，4 ℃、10 000×g離心5 min；重復(fù)洗滌 1 次；吸棄乙醇；待沉淀干燥后，加入適量0.1% DEPC水(含1 mmol/L 甲磺酸去鐵銨)；測(cè)其吸光度(A)值；根據(jù)所測(cè)濃度取20 μg RNA于新的EP管中，用0.1% DEPC水定容至79.5 μL；100 ℃金屬浴變性3 min，插入冰中急速冷卻；加入10 μL核酸酶P1，混勻；37 ℃水浴孵育2 h，期間在30 min和60 min時(shí)各混勻1次；加入10.5 μL堿性磷酸酶，混勻；37 ℃水浴孵育1 h，期間在30 min時(shí)混勻 1 次；孵育結(jié)束后，4 ℃ 10 000×g離心5 min；取90 μL上清于內(nèi)插管中，加入5 μL [13C,15N2]8-oxoGsn(50 μg/L)和5 μL [15N5]Gsn(25 mg/L)，吹打混勻，直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)或保存于-80 ℃。

2.3 LC-MS/MS檢測(cè) 液相色譜條件：色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HT(3.0*100mm)1.8-Micron 600 Bar；流動(dòng)相：A液為5 mmol/L醋酸銨(pH=3.75)，B液為甲醇。梯度洗脫如下：0～5 min：A相從90%～50%，B相從10%～50%；5～5.01 min：A相從50%～90%，B相從50%～10%；5.01～7.5 min：A∶B為90∶10；流速：0．3 mL/min；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量2 μL，整個(gè)分析時(shí)間為7.5 min。質(zhì)譜條件：電噴霧(ESI)離子源正離子模式，多反應(yīng)檢測(cè)掃描(MRM)；噴霧器氣溫：200 ℃；噴霧器氣流：14 L/min；噴霧器：20 psi；鞘氣流溫度：400 ℃；鞘氣流流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：1 500 V；駐留時(shí)間：100 ms；8-oxoGsn、Gsn及其同位素內(nèi)標(biāo)檢測(cè)離子對(duì)參數(shù)見表2。

表2 正離子模式下8-oxoGsn、Gsn及其對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)的離子源參數(shù)

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)，數(shù)值變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用t檢驗(yàn)判定2組均數(shù)差異顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 8-oxoGua在胃癌組織及癌旁組織中的分布

免疫組化提示胃癌及癌旁組織細(xì)胞胞漿中均可以檢測(cè)到8-oxoGua，而其在胃癌組織中的含量明顯增加，見圖1。

Figure 1.The results of 8-oxoGua immunohistochemical observation after pre-treatment with DNase in the gastric can-cer tissues and para-carcinoma tissues.

2 LC-MS/MS檢測(cè)體系的建立

如圖2所示，樣品中Gsn、8-oxoGsn與其各自的內(nèi)標(biāo)[15N5]Gsn、[13C,15N2]8-oxoGsn出峰時(shí)間一致，峰形完整、結(jié)果可靠，在本實(shí)驗(yàn)條件下，8-oxoGsn最低檢測(cè)量可達(dá)0.2 pg。

3 胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織之間RNA氧化程度的差異

本研究用LC-MS/MS檢測(cè)方法平行檢測(cè)61組胃癌及癌旁組織RNA中8-oxoGsn及Gsn的含量，RNA氧化損傷程度以每106個(gè)Gsn中含8-oxoGsn個(gè)數(shù)的平均值表示。如圖3所示，胃癌組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn的含量為5.888±2.932，癌旁組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn的含量為4.469±2.876，胃癌組織比癌旁組織高24.1%(P<0.05)。對(duì)61例組織進(jìn)行分型研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌或印戒細(xì)胞癌中均存在類似現(xiàn)象，見圖4，表明RNA氧化損傷可能與胃癌發(fā)生之間存在著一定的聯(lián)系。

討 論

許多RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7-10]，而腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一是氧化應(yīng)激水平的增高。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等產(chǎn)生過多，氧化程度超出機(jī)體氧化物的清除能力，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致組織損傷的過程。對(duì)氧化應(yīng)激量化評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)主要是測(cè)定由活性氧修飾的化合物以及測(cè)定活性氧清除酶和抗氧化物質(zhì)的量。由于我們考慮RNA氧化損傷是否與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，因此選擇了近年被廣泛認(rèn)可的活性氧修飾化合物8-oxoGsn作為氧化標(biāo)志物。

Figure 2.The LC-MS/MS detection figure of 8-oxoGsn, Gsn and the corresponding isotopic mark.

Figure 3.The levels of 8-oxoGsn in the human gastric cancer and para-carcinoma. Mean±SD. n= 61. *P<0.05 vs para-carcinoma tissue.

Figure 4.The levels of 8-oxoGsn in adenocarcinoma, signet-ring cell carcinoma and their corresponding para-carcinoma. Mean±SD. *P<0.05 vs para-carcinoma tissue.

目前對(duì)8-oxoGsn的檢測(cè)技術(shù)大致可以分為兩類，即免疫分析法和色譜法[5]。免疫分析法中又分為免疫組化法、免疫熒光法和ELISA法等，免疫組化法和免疫熒光法可用于細(xì)胞中8-oxoGsn的定性分析和半定量分析；ELISA方法則可以用于血漿、尿液及其它體液中8-oxoGsn的定量分析。由于受到所用抗體特異性以及其它與底物結(jié)構(gòu)類似物的影響，免疫分析法很難得到準(zhǔn)確可靠的定量數(shù)據(jù)。色譜法因其敏感度高、線性好、分析準(zhǔn)確及非特異干擾小的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，其中包括HPLC-ECD、GC-MS、LC-MS/MS等。LC-MS/MS因其串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測(cè)模式可以最大程度提高檢測(cè)方法的特異性，該方法通過液相色譜階段分離樣品中的雜質(zhì)，再用串聯(lián)質(zhì)譜根據(jù)化合物母離子和子離子對(duì)的不同來區(qū)分生物樣品中的8-oxoGsn和Gsn，具有通量高、敏感度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。因此，為了更加準(zhǔn)確的檢測(cè)組織中RNA的氧化產(chǎn)物8-oxoGsn的含量，我們采用同位素稀釋LC-MS/MS，該檢測(cè)體系敏感度高，分析準(zhǔn)確，非特異干擾小，最低定量可以達(dá)到0.2 pg，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)胃癌及癌旁組織中的8-oxoGsn的含量。

本研究對(duì)RNA氧化損傷重要標(biāo)志物8-oxoGsn的檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌組織中的8-oxoGsn/106Gsn平均值為5.888±2.932，癌旁組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn平均值為4.469±2.876，胃癌組織比癌旁組織高24.1%(P<0.05)，表明RNA氧化損傷可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。不同類型胃癌如印戒細(xì)胞癌和腺癌中均存在癌組織中RNA氧化程度高于癌旁組織的情況。此外，印戒細(xì)胞癌RNA氧化程度明顯高于腺癌，也可能與印戒細(xì)胞癌例數(shù)不夠多有關(guān)。

也有學(xué)者研究了日常飲食是否會(huì)對(duì)8-oxoGsn和8-oxodGsn的檢測(cè)結(jié)果有影響，他們得出日常飲食并不會(huì)影響這些生物分子在尿液中排泄的結(jié)論[11]。另外還有研究表明日常飲食對(duì)血液中8-oxoGsn和8-oxodGsn的含量也沒有影響[12]。還有文獻(xiàn)報(bào)道8-oxoGsn和8-oxodGsn的水平增高也會(huì)出現(xiàn)在其他器官中[13]。而且我們發(fā)現(xiàn)胃癌組的8-oxoGsn含量明顯高于癌旁組，因此我們可以考慮將8-oxoGsn作為胃癌的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物。

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Level and clinical significance of RNA oxidative damage in human gastric cancer and para-carcinoma tissues

LIN Xian-hui1, YU Jun-hua1, LIN Hai-hong1, TU Yang-yang1, LUO Shun-bin2, XU Tao2, CHEN Tong1, LIN Xing-cheng1, YE Sun-zhi1, ZHENG Zhi-qiang1, CAI Jian-ping2

(1DepartmentofGeneral,SecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2TheKeyLaboratoryofGeriatrics,BeijingHospital，BeijingInstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,Beijing100730,China.E-mail:zhe-zhi2000@yahoo.com.cn;caijp61@vip.sina.com)

AIM: To investigate the RNA oxidative damage in human gastric cancer tissue and para-carcinoma tissue for exploring the role of RNA oxidation in the occurrence of gastric cancer. METHODS: Immunohistochemical observation and LC-MS/MS analysis were performed in 61 cases of gastric carcinoma. The position and concentration of 8-oxoguanosine (8-oxoGsn) were detected, respectively. RESULTS: The results of immunohistochemical observation showed that 8-oxoGsn was obviously up-regulated in the gastric cancer. The positive staining mainly accumulated in the cytoplasm of the tumor cells. The results of mass spectrometry showed that the level of 8-oxoGsn in the gastric cancer tissues was higher than that in the para-carcinoma tissues (P<0.05). CONCLUSION: 8-oxoGsn is up-regulated in gastric cancer. RNA oxidative damage may play important roles in the occurrence of gastric cancer.

Stomach neoplasms; Immunohistochemistry; 8-oxoguanosine; LC-MS/MS

1000- 4718(2015)01- 0172- 05

2014- 09- 16

2014- 11- 18

△通訊作者 鄭志強(qiáng) Tel： 0577-88653538； E-mail： zhe-zhi2000@yahoo.com.cn； 蔡劍平 Tel： 010-58115039； E-mail： caijp61@vip.sina.com

R735.2

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.032