3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌mTOR信號(hào)通路的影響

馬鐵 曾凡星

1 沈陽(yáng)體育學(xué)院（遼寧沈陽(yáng)110102）

2 北京體育大學(xué)

大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的重要原則之一， 可以有效提高運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)成績(jī)[1]。 同時(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也會(huì)影響骨骼肌的合成能力，表現(xiàn)出即時(shí)的應(yīng)激性[2，3]和長(zhǎng)期的適應(yīng)性[4，5]。間歇性沖刺訓(xùn)練后，骨骼肌蛋白合成能力的提高伴隨著運(yùn)動(dòng)能力的改善[6]，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)成績(jī)與骨骼肌蛋白合成能力密切相關(guān)。研究已證實(shí)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin，mTOR）對(duì)所有細(xì)胞的蛋白合成有調(diào)控作用[7]。 mTOR磷酸化水平提高可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞增殖與肥大， 維持骨骼肌質(zhì)量[8]。史仍飛等[9]發(fā)現(xiàn)，大鼠進(jìn)行8周負(fù)重游泳訓(xùn)練，雷帕霉素（mTOR特異性阻斷劑）阻斷運(yùn)動(dòng)組的骨骼肌質(zhì)量低于單純運(yùn)動(dòng)組，表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)mTOR信號(hào)通路影響骨骼肌蛋白合成。

但現(xiàn)有的研究中， 對(duì)于骨骼肌蛋白合成代謝和mTOR信號(hào)通路在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中變化情況尚未見(jiàn)明確報(bào)道。因此，本研究采用中等強(qiáng)度和大強(qiáng)度相結(jié)合3周大運(yùn)動(dòng)量大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練，在每周訓(xùn)練后測(cè)試骨骼肌mTOR及其下游信號(hào)70KD核糖體蛋白S6激酶（70-kD S6 protein kinase，p70S6K）、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，4EBP1）的蛋白表達(dá)和磷酸化水平，探討在這一過(guò)程中，骨骼肌蛋白合成變化規(guī)律和相應(yīng)信號(hào)蛋白變化特點(diǎn)。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

7周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠36只[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-001]，分籠飼養(yǎng)，4只/籠，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，自由飲食。 在北京體育大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練1周后， 按體重隨機(jī)分成對(duì)照組（C1、C2、C3）和運(yùn)動(dòng)組（E1、E2、E3），共6組，每組6只。對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行3周連續(xù)的大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練。

1.2 訓(xùn)練方案

參考Bedford[10]、田野[11]等的研究和大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的基本原則[12]，制定大鼠大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練方案。 訓(xùn)練周期：3周，訓(xùn)練頻率：6天/周，訓(xùn)練強(qiáng)度：中等強(qiáng)度（20m/min，坡度10%，相當(dāng)于70%～75%VO2max）、大強(qiáng)度（26 m/min，坡度10%，相當(dāng)于80%～85%VO2max）。單次訓(xùn)練時(shí)間：中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)起始運(yùn)動(dòng)時(shí)間90 min，逐次增加；大強(qiáng)度訓(xùn)練時(shí)間均為60 min。 周訓(xùn)練計(jì)劃：中等強(qiáng)度訓(xùn)練4天、大強(qiáng)度訓(xùn)練2天，具體方案見(jiàn)表1。

表1 3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練方案

1.3 取材

大鼠在每周訓(xùn)練后， 末次運(yùn)動(dòng)后禁食12 h，25%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取腓腸肌，除去可見(jiàn)筋膜和脂肪，稱重。 剝離白腓腸肌，9%生理鹽水洗凈，錫紙包裹迅速放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱。 取材部位與時(shí)間參考朱一力結(jié)果[13]。

圖1 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練期間取材安排

1.4 Western blot 測(cè)定肌球蛋白重鏈 （myosin heavy chain，MHC）、mTOR、mTOR （ser2448）、p70S6K、p70S6K（Thr389）、4EBP1、4EBP1（Thr37/46）表達(dá)水平

白腓腸肌0.1 g， 剪碎、 液氮研磨，1 ml勻漿液，混勻，無(wú)可見(jiàn)顆粒。 低溫高速離心（4℃，12000 g，10 min），提取上清液，分裝放入-80℃冰箱。 用BCA法測(cè)試骨骼肌勻漿液蛋白濃度。 灌制濃縮膠 （10%） 和分離膠（mTOR，mTOR （ser2448），MHC 6% ，p70S6K，p70S6K（Thr389） 10%，4EBP1，4EBP1（Thr37/46） 15%），恒 壓電泳（濃縮膠80 V，30 min；分離膠100 V，120 min），轉(zhuǎn)膜至NC膜 （半干轉(zhuǎn)，20 V，90 min），5%牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）封閉90 min。一抗4℃封閉過(guò)夜[MHC，1∶1000；mTOR，1∶1000；mTOR（ser2448），1 ∶1500；p70S6K，1 ∶1000、p70S6K （Thr389），1 ∶1000；4EBP1，1∶800；4EBP1（Thr37/46），1∶1000；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），1∶1000；MHC抗體購(gòu)自Abcom公司，GAPDH抗體購(gòu)自Santa公司， 其余抗體購(gòu)自CST公司）， 次日晨，TBST洗膜，二抗孵育90 min（二抗購(gòu)自NEB公司]，TBST洗膜，滴發(fā)光液，曝光，拍照。使用Quanity One軟件進(jìn)行圖像光密度值分析， 以GAPDH為內(nèi)參。 目的蛋白相對(duì)含量＝目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)大鼠腓腸肌濕重和MHC表達(dá)的影響

由圖2和圖3可以看出，與C1組相比，E1組腓腸肌濕重降低、MHC升高， 但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與C2組相比，E2組腓腸肌濕重和MHC降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與C3組相比，E3組腓腸肌濕重顯著降低 （P < 0.05），MHC顯著降低（P < 0.01）。

2.2 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)腓腸肌mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

由圖4可以看出， 與C1組相比，E1組mTOR蛋白表達(dá)降低、p70S6K蛋白表達(dá)升高， 但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4EBP1蛋白表達(dá)顯著升高（P < 0.01）。 與C2組相比，E2組mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表達(dá)降低， 但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與C3組相比，E3組mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表達(dá)顯著降低（P < 0.05）。

圖2 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中大鼠腓腸肌濕重變化

圖3 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練期間大鼠腓腸肌MHC變化

2.3 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)mTOR信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的影響

圖4 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練期間大鼠腓腸肌mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表達(dá)的變化

圖5 大運(yùn)動(dòng)量期間大鼠腓腸肌mTOR（Ser2448） 、p70S6K（Thr389）和4EBP1（Thr37/46）磷酸化水平的變化

由圖5可以看出， 與C1組相比，E1組mTOR磷酸化水平升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p70S6K磷酸化水平顯著升高（P < 0.01）；4EBP1磷酸化水平顯著升高（P < 0.05）。與C2組相比，E2組mTOR磷酸化水平顯著降低 （P <0.01）；p70S6K磷酸化水平顯著降低 （P < 0.05）；4EBP1磷酸化水平升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與C3組相比，E3組mTOR磷酸化水平、p70S6K磷酸化水平顯著降低（P <0.01）；4EBP1磷酸化水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由圖6可以看出，在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練第1周結(jié)束和第3周結(jié)束時(shí)，mTOR信號(hào)通路蛋白磷酸化水平與蛋白表達(dá)比值均>1。

圖6 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中mTOR及其下游信號(hào)通路蛋白磷酸化

3 討論

3.1 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)骨骼肌蛋白合成的影響

骨骼肌的濕重或圍度是反映訓(xùn)練對(duì)骨骼肌合成代謝影響的直觀指標(biāo)。 研究顯示，適宜運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量的抗阻訓(xùn)練可提高或保持骨骼肌質(zhì)量或橫截面積[14，15]。本研究顯示，在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練前期，運(yùn)動(dòng)組骨骼肌濕重均低于同期對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 同時(shí)進(jìn)行縱向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，前2周訓(xùn)練后，運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌濕重與對(duì)照組相似，呈升高趨勢(shì)。 這種變化可能與生長(zhǎng)因素有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在青春期到成年階段，骨骼肌質(zhì)量隨周齡的增加而增加[16]，同時(shí)也可能由于骨骼肌應(yīng)對(duì)大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練刺激出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)， 骨骼肌蛋白質(zhì)合成快于蛋白質(zhì)分解，以致蛋白質(zhì)積累[17]。 朱晗[18]的研究也表明，采用與本研究相似運(yùn)動(dòng)方式訓(xùn)練1周，大鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。

也有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠進(jìn)行6周力竭游泳訓(xùn)練，在訓(xùn)練的第4～6周取材，訓(xùn)練組大鼠不同類型的骨骼肌濕重均顯著低于對(duì)照組[19]，過(guò)度訓(xùn)練降低骨骼肌的總蛋白含量[20]，說(shuō)明不適宜運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練會(huì)降低骨骼肌的蛋白合成能力。 本研究結(jié)果同樣顯示大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練第3周運(yùn)動(dòng)組骨骼肌濕重顯著低于對(duì)照組， 并且也低于前期的運(yùn)動(dòng)組，表明3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的疲勞積累降低了骨骼肌蛋白的合成能力。

通過(guò)對(duì)骨骼肌MHC表達(dá)量的測(cè)試， 更進(jìn)一步準(zhǔn)確地反映出骨骼肌蛋白合成能力的變化。有研究顯示，適宜的訓(xùn)練可提高骨骼肌MHC表達(dá)并且與訓(xùn)練模式無(wú)關(guān)，12周力量與耐力相結(jié)合的訓(xùn)練使骨骼?、騛型肌纖維含量和橫截面積增加[21]。 但通過(guò)建立大鼠力量訓(xùn)練疲勞模型發(fā)現(xiàn)， 大鼠在進(jìn)行12周未充分休息的大強(qiáng)度力量訓(xùn)練后， 跖肌中的快肌纖維橫截面積顯著降低，IIA和IID型MHC肌纖維顯著減少[22]。本研究結(jié)果也表明，在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的前2周，與同期對(duì)照組相比，骨骼肌MHC略有升高或并無(wú)顯著變化，但在3周訓(xùn)練后MHC顯著降低，進(jìn)一步證明了大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中，骨骼肌蛋白合成能力經(jīng)歷了先升高后降低的過(guò)程。

本研究結(jié)果表明， 短時(shí)間大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)骨骼肌蛋白合成有一定的促進(jìn)作用，但隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，疲勞積累增加， 恢復(fù)時(shí)間相對(duì)減少將導(dǎo)致骨骼肌蛋白合成代謝能力下降，抑制骨骼肌蛋白合成。

3.2 大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌mTOR信號(hào)通路的影響

mTOR主要通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA翻譯啟始和延長(zhǎng)的效率影響細(xì)胞合成。 這種作用的發(fā)揮主要通過(guò)p70S6K和4EBP1兩條相對(duì)獨(dú)立的下游信號(hào)通路完成， 并且以磷酸化方式提高二者活性[23]。 當(dāng)4EBP1的Thr37/46位點(diǎn)被磷酸化，則可解除其與真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）結(jié)合，活性位點(diǎn)暴露，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯啟始[24]。 p70S6K是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，其被磷酸化活化后，可以通過(guò)激活S6蛋白， 促進(jìn)5'TOP mRNA翻譯蛋白的起始。 5'TOP mRNA主要翻譯產(chǎn)物包括許多翻譯元件成分如核糖體蛋白、翻譯延伸因子1α、翻譯延伸因子2和poly（A）結(jié)合蛋白[25]。 因此，mTOR通過(guò)其下游信號(hào)蛋白，全面調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有快速（幾分鐘）激活翻譯啟始的短期作用和通過(guò)增加核糖體及其他翻譯組件數(shù)量提高細(xì)胞翻譯能力的長(zhǎng)期（數(shù)小時(shí)）作用[26]。

研究顯示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改變mTOR及其下游信號(hào)蛋白表達(dá)，7周無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練（1.5h/d，5d/周）后，與對(duì)照組相比，大鼠mTOR蛋白表達(dá)顯著提高[27]。 對(duì)老年大鼠進(jìn)行為期3個(gè)月的有氧運(yùn)動(dòng)，與對(duì)照組相比，訓(xùn)練組大鼠骨骼肌的合成代謝加強(qiáng)，腓腸肌mTOR蛋白總量顯著增加，同時(shí)腓腸肌蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）總量增加， 因此作者認(rèn)為有氧訓(xùn)練對(duì)于骨骼肌蛋白合成的促進(jìn)作用通過(guò)Akt-mTOR途徑完成，但其結(jié)果并未改變p70S6K的蛋白表達(dá)[28]，這可能與采用的訓(xùn)練方式是轉(zhuǎn)輪跑，其強(qiáng)度相對(duì)較小有關(guān)。 因此可以看出，長(zhǎng)期訓(xùn)練可以提高骨骼肌mTOR信號(hào)蛋白的表達(dá)， 但也應(yīng)看到，信號(hào)蛋白表達(dá)可能與訓(xùn)練的負(fù)荷量和強(qiáng)度有關(guān)。

有研究表明，采用電刺激大鼠腓腸肌、隔天訓(xùn)練、共1周的方式模擬力量訓(xùn)練，并根據(jù)每天訓(xùn)練的次數(shù)分為1次組、12次組和18 次組， 結(jié)果顯示大鼠腓腸肌p70S6K磷酸化水平在運(yùn)動(dòng)后均顯著顯著升高，1次組升高幅度最大； 而其蛋白表達(dá)均在12次組和18次組顯著升高；只有18次組4EBP1蛋白表達(dá)顯著升高[29]。 這一研究表明， 長(zhǎng)期的訓(xùn)練會(huì)鈍化一次性運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌信號(hào)蛋白的影響，相對(duì)于蛋白磷酸化水平，其蛋白表達(dá)的改變可能發(fā)生在運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體影響較為深刻的后期。 相對(duì)訓(xùn)練頻次較低的間歇性力量和耐力（每2次訓(xùn)練至少間隔1天） 訓(xùn)練均未顯著改變Akt、mTOR和p70S6K的蛋白表達(dá)[30]。 本研究也顯示，與同期對(duì)照組相比，骨骼肌mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)在訓(xùn)練的前2周均無(wú)顯著變化，而顯著降低均出現(xiàn)在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的第3周，可能由于此階段單次訓(xùn)練時(shí)間長(zhǎng)，前期疲勞積累程度較大所致。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中，同作為mTOR下游信號(hào)的p70S6K和4EBP1兩者蛋白表達(dá)變化存在一定差異。 雖然三者變化趨勢(shì)較為一致，相比較而言，p70S6K與mTOR保持更好的同步性變化。這與Ogasawara等[29]的結(jié)果相似， 其認(rèn)為，4EBP1可能存在其他的調(diào)節(jié)作用通路。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練同樣會(huì)改變骨骼肌mTOR及其下游信號(hào)磷酸化水平。 李志剛[31]采用8周不同體重比例負(fù)重游泳訓(xùn)練， 比較后發(fā)現(xiàn)15%體重負(fù)重游泳對(duì)骨骼肌促合成作用最強(qiáng)，mTOR磷酸化水平最高。2周中等強(qiáng)度耐力訓(xùn)練可提高骨骼肌mTOR磷酸化水平和總蛋白表達(dá)，使其下游信號(hào)分子p70S6K和4EBP1磷酸化水平顯著增加，并在運(yùn)動(dòng)后6～12小時(shí)達(dá)到最大水平，24小時(shí)后恢復(fù)[13]。以上研究表明，適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可提高骨骼肌mTOR磷酸化水平。

本研究顯示，在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練前期（1周后），mTOR及其下游信號(hào)的磷酸化水平均顯著升高， 并且下游信號(hào)蛋白磷酸化升高幅度高于mTOR。 這與曾凡星等[32]的研究結(jié)果一致， 其發(fā)現(xiàn)大鼠在進(jìn)行1周跑臺(tái)訓(xùn)練后，腓腸肌mTOR及其下游信號(hào)p70S6K和4EBP1磷酸化水平均顯著高于對(duì)照組，并認(rèn)為mTOR通路信號(hào)分子磷酸化水平對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練較為敏感。mTOR信號(hào)通路磷酸化水平在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練前期的變化也表明， 此階段訓(xùn)練量較為適宜，骨骼肌蛋白合成能力加強(qiáng)。 但在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的后2周，mTOR及其下游信號(hào)磷酸化水平降低， 這與mTOR上游信號(hào)蛋白Akt磷酸化水平變化較為一致[33]，因此大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練疲勞后可能通過(guò)Akt-mTOR通路抑制骨骼肌蛋白合成。

綜合以上分析可以看出， 在系統(tǒng)的大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練過(guò)程中，骨骼肌mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)、磷酸化水平與MHC呈現(xiàn)出相似的變化過(guò)程，具有很好的同步性。進(jìn)一步證明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌蛋白合成的影響與mTOR密切相關(guān)[34]。 在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練前期，mTOR信號(hào)通路活性的增加是骨骼肌合成代謝加強(qiáng)的原因。反之，在大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練結(jié)束后，mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的降低導(dǎo)致骨骼肌蛋白合成能力下降。

4 總結(jié)

mTOR及其下游信號(hào)通路參與了大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練對(duì)骨骼肌蛋白合成的調(diào)節(jié)作用。 短期大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練促進(jìn)骨骼肌蛋白合成，與mTOR信號(hào)通路磷酸化水平提高有關(guān)。 3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練降低骨骼肌蛋白合成能力，是由mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)減少導(dǎo)致的。

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