液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析馬尿中司坦唑醇代謝產(chǎn)物

曹玉萍 徐友宣

1 國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

2 北京體育大學(xué)

司坦唑醇（stanozolol）是蛋白同化激素中的一員，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)異生等作用，在臨床上用于慢性消耗性疾病、再生障礙性貧血等，能使體力增強(qiáng)、食欲增進(jìn)、體重增加，因此常被用于興奮劑來(lái)提高運(yùn)動(dòng)員或馬的運(yùn)動(dòng)能力。 國(guó)際奧委會(huì)于1974年開(kāi)始禁用司坦唑醇[1]，但這種藥物仍然被許多運(yùn)動(dòng)員濫用。根據(jù)近十年的相關(guān)國(guó)際馬術(shù)組織發(fā)布的年度報(bào)告可知， 司坦唑醇也是馬術(shù)運(yùn)動(dòng)中最常用的蛋白同化激素之一。

關(guān)于司坦唑醇在人體內(nèi)的代謝已經(jīng)有一些研究，Thevis等[2]和Pozo等[3]先后在2006年和2009年對(duì)司坦唑醇在人體內(nèi)的代謝進(jìn)行了研究， 其中Pozo等通過(guò)人體試驗(yàn)和小鼠實(shí)驗(yàn)確定了司坦唑醇在人體內(nèi)的19種代謝產(chǎn)物， 并對(duì)其代謝途徑、 代謝時(shí)間等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 最早的關(guān)于司坦唑醇在馬體內(nèi)的代謝研究是1990年的Mück等利用大氣壓化學(xué)電離（APCI）的LC-MS方法檢測(cè)出口服司坦唑醇后馬尿中C3’、C4、C6和C16位的羥基化代謝產(chǎn)物[4]，但是這項(xiàng)研究沒(méi)有對(duì)II相代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究[5]。隨后的一些研究進(jìn)一步證實(shí)了16β-羥基司坦唑醇（16β-hydroxystanozolol）是肌肉注射司坦唑醇后馬尿中的最主要的代謝產(chǎn)物?；谝陨涎芯浚芯咳藛T建立了GC-MS檢測(cè)司坦唑醇的方法[6]，但是這種方法需要經(jīng)過(guò)固相萃取、酶解、液液萃取凈化和衍生化等步驟，過(guò)程較為繁瑣。2004年，McKinney等[5]利用液相色譜離子阱質(zhì)譜（LC-ITMS）對(duì)肌肉注射司坦唑醇后的馬尿進(jìn)行了分析，得到4種包括司坦唑醇原型在內(nèi)的代謝產(chǎn)物， 其他三個(gè)為16β-羥基司坦唑醇以及可能是16α、15-羥基司坦唑醇（15-hydroxystanozolol）這兩種代謝產(chǎn)物， 最后又對(duì)這四種代謝產(chǎn)物在Ⅱ相代謝中葡萄糖醛酸化結(jié)合物和硫酸化結(jié)合物的比例進(jìn)行了分析。

上述實(shí)驗(yàn)雖然對(duì)馬尿中司坦唑醇的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析， 但是未能提供各主要代謝產(chǎn)物的濃度變化曲線，使得司坦唑醇的檢測(cè)窗口期不明確。在建立本類藥物檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上， 本實(shí)驗(yàn)對(duì)單次劑量口服司坦唑醇馬的尿樣進(jìn)行了采集，用LC-MS/MS儀器對(duì)尿樣中代謝物進(jìn)行了分析， 并通過(guò)建立藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到了司坦唑醇主要代謝產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間變化曲線，方法的靈敏度和選擇性明顯優(yōu)于前人的單級(jí)質(zhì)譜方法，為馬術(shù)運(yùn)動(dòng)中檢測(cè)司坦唑醇提供更靈敏可靠的方法。

1 材料與對(duì)象

1.1 儀器和材料

Agilent Techonologies 6410A 三重四級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Mettler PM200電子天平 （感量0.001 g，瑞士Mettler公司）；Genie Vortex-2漩渦混合器（美國(guó)Scientific Industries 公 司）；XMTD-2MA 恒 溫 水 浴 箱；Techne氮吹儀（英國(guó)Bibby公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品司坦唑醇、16β-羥基司坦唑醇、3’-羥基司坦唑醇（3’-hydroxystanozolol）、4α-羥基司坦唑醇（4αhydroxystanozolol）、甲基睪酮（methyltestosterone）（國(guó)家體育總局反興奮劑中心檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室）；甲醇、乙腈、叔丁基甲醚（Dima公司）；三氯甲烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、甲酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Sigma公司）。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱（2.1×100 mm, 3.5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液（含0.2 M的甲酸銨），流動(dòng)相B為0.1%甲酸－甲醇溶液；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40℃。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓為4000 V；干燥氣溫度為330℃；干燥氣流速：10 L/min分鐘；霧化氣壓力為35 psi。

1.2 空白尿樣與陽(yáng)性尿樣

實(shí)驗(yàn)選用馬匹為新疆伊犁馬，公馬，年齡為5歲（相當(dāng)于人的20歲左右），體重為280 kg，體質(zhì)健康，無(wú)藥物濫用史。 首先采集服藥前尿樣作為空白尿樣；然后讓馬匹單次口服文獻(xiàn)中推薦劑量（0.55 mg/kg體重）的司坦唑醇， 采集服藥后前3天所有尿樣、30天內(nèi)的晨尿以及第33、38、45、56天的晨尿。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 代謝產(chǎn)物分析

分析司坦唑醇的代謝產(chǎn)物， 首先要對(duì)司坦唑醇原型的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析， 推算出可能得到的代謝產(chǎn)物的分子量。

圖1 司坦唑醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

司坦唑醇的相對(duì)分子量為328.49，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)式（見(jiàn)圖1）以及藥物代謝理論，推測(cè)其在尿液中的代謝產(chǎn)物主要以脫氫化合物、羥基化合物、原型及它們的差向異構(gòu)形式存在。 因此，在質(zhì)譜中可能出現(xiàn)m/z為327、329、343、345、359、361等為準(zhǔn)分子離子的司坦唑醇代謝物。

2.1.1 LC-MS/MS的子離子掃描模式

用甲醇配制500 μL的濃度為1 μg/mL的16β-羥基司坦唑醇、3’-羥基司坦唑醇、4α-羥基司坦唑醇和司坦唑醇的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，運(yùn)用LC-MS/MS儀器的子離子掃描模式進(jìn)行分析，掃描結(jié)果如下（圖2）。

根據(jù)子離子掃描結(jié)果圖， 選擇出特征子離子m/z 81、95、97、107、109、121、137和145。

2.1.2 LC-MS/MS的母離子掃描模式

色譜質(zhì)譜條件同上。 質(zhì)譜掃描范圍：m/z 320～400；掃描時(shí)間：200ms；碰撞能量：根據(jù)子離子掃描選擇每個(gè)代謝物子離子最合適的CE；聚焦電壓：120～150 V。

采用β-葡萄糖醛酸酶酶解、叔丁基甲醚液液提取的方式進(jìn)行前處理之后， 用LC-MS/MS儀器分別對(duì)m/z81、95、97、107、109、121、137、145進(jìn)行母離子掃描。

2.1.3 對(duì)比空白尿樣和陽(yáng)性尿樣的譜圖

圖2 3’、4α、16β-羥基司坦唑醇和司坦唑醇的子離子掃描圖

通過(guò)母離子掃描得到的服藥后尿樣譜圖及空白尿樣譜圖進(jìn)行對(duì)比，找出空白尿樣中沒(méi)有的、與推算出的代謝物分子量相同的化合物，記錄保留時(shí)間。其中對(duì)比結(jié)果最優(yōu)的是m/z 81的結(jié)果圖（見(jiàn)圖3）。 而其他幾個(gè)子離子的母離子掃描效果不太理想， 其中m/z 95、97只得到代謝物②，且響應(yīng)值較低，譜圖效果較差；m/z 137譜圖在保留時(shí)間10.5和10.8處有兩個(gè)疑似代謝物，但是相同濃度的空白尿樣中也含有相同分子質(zhì)量的雜峰，因此不能判定這兩個(gè)疑似就是司坦唑醇的代謝產(chǎn)物。

為發(fā)現(xiàn)更多代謝物， 研究又將服藥后尿樣進(jìn)行子離子掃描，在化合物①～⑤對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間范圍內(nèi)選取子離子，再進(jìn)行一次前體離子掃描，但沒(méi)有新的發(fā)現(xiàn)。

圖3 服藥后尿樣及空白尿樣的母離子掃描圖（m/z 81）

2.2 代謝產(chǎn)物濃度－時(shí)間變化曲線

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

通過(guò)加入司坦唑醇、16β-羥基司坦唑醇、3’-羥基司坦唑醇、4α-羥基司坦唑醇標(biāo)準(zhǔn)品到2mL空白尿樣中，使尿樣濃度范圍為0.01 ng/mL～200 ng/mL，取8個(gè)濃度點(diǎn)。

得出的數(shù)據(jù)以藥物的濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值Y為縱坐標(biāo)， 運(yùn)用Agilent定量分析軟件進(jìn)行線性回歸， 求得線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.996。 司坦唑醇、16β-羥基司坦唑醇、3’-羥基司坦唑醇、4α-羥基司坦唑醇的檢測(cè)限LOD分別為0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.1 ng/mL和2 ng/mL，線性范圍是0.1～200 ng/mL。

2.2.2 代謝產(chǎn)物濃度－時(shí)間變化曲線的建立

將采集的陽(yáng)性尿樣按照已制定的前處理方法和儀器檢測(cè)條件對(duì)司坦唑醇及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)， 并根據(jù)已建立的線性方程計(jì)算出相應(yīng)的濃度（見(jiàn)表1），然后以尿樣采集日期為橫坐標(biāo)，代謝物濃度為縱坐標(biāo)，得出每種化合物的濃度隨時(shí)間變化曲線（見(jiàn)圖4）。

表1 四種代謝物的濃度時(shí)間變化

圖4 司坦唑醇原型及三種代謝產(chǎn)物的濃度-時(shí)間變化曲線圖

3 分析與討論

3.1 代謝產(chǎn)物結(jié)果的分析與討論

本實(shí)驗(yàn)用同樣的前處理方法和分析方法對(duì)司坦唑醇和3’、4α、16β-羥基司坦唑醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析，得到了四種化合物標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間， 分別為23.03、14.88、13.36和16.21。

將標(biāo)準(zhǔn)品譜圖和圖3進(jìn)行對(duì)比， 可確定圖3中檢出的化合物②為4α-羥基司坦唑醇， 化合物④為16β-羥基司坦唑醇。 化合物⑤與司坦唑醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間雖然符合WADA_TD2010IDCR技術(shù)文件中關(guān)于保留時(shí)間的規(guī)定，即同一分析物的保留時(shí)間（RT）波動(dòng)不能超過(guò)2%或0.1 min，但是譜圖的峰形較差，響應(yīng)值低，不能判定其為司坦唑醇，需進(jìn)一步驗(yàn)證。將陽(yáng)性尿樣用MRM模式進(jìn)行掃描后，能檢測(cè)到司坦唑醇的存在，且在濃度為10ng/mL時(shí)也能清晰地辨認(rèn)且符合WADA判據(jù)。 因此，代謝物⑤為司坦唑醇藥物原型。造成這個(gè)問(wèn)題的原因是因?yàn)镸RM方式掃描的靈敏度要高于母離子掃描，它們之間存在著數(shù)量級(jí)差異。

同上， 雖然圖2的母離子掃描譜圖未出現(xiàn)3’-羥基司坦唑醇， 但對(duì)陽(yáng)性尿樣進(jìn)行MRM檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)了與3’-羥基司坦唑醇標(biāo)準(zhǔn)品相同的代謝物，且保留時(shí)間符合WADA_TD2010IDCR技術(shù)文件中關(guān)于保留時(shí)間的規(guī)定。因此，可以把3’-羥基司坦唑醇定為代謝物⑥（圖5）。

圖5 空白尿添加標(biāo)準(zhǔn)品和服藥后尿樣中3’-羥基司坦唑醇的MRM圖

代謝物①、③的相對(duì)分子質(zhì)量均為345，為司坦唑醇的一羥基代謝物。 為判斷①③的結(jié)構(gòu)式，研究對(duì)服藥后尿樣在m/z 345進(jìn)行了子離子掃描， 期望通過(guò)相對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處的子離子來(lái)推算其化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

代謝物①含特征子離子m/z 81和137， 只有在C4、C6、C7發(fā)生羥化作用以及C19位的羥甲基化作用才會(huì)產(chǎn)生這個(gè)子離子。 但譜圖中沒(méi)有更多的特征子離子可供判斷，這有可能是檢測(cè)時(shí)CE過(guò)高，造成子離子碎片太多，而忽略了其他可能存在的子離子，因此代謝物①到底是哪種代謝形式還需要再確證， 但本實(shí)驗(yàn)缺少相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，因此無(wú)法進(jìn)一步驗(yàn)證。

代謝物③含特征子離子m/z 81、271和285， 在司坦唑醇的一羥化代謝產(chǎn)物中， 只有C16和C17處羥化才能產(chǎn)生這三個(gè)子離子，但是C17本身含有一個(gè)-OH，若再增加一個(gè)-OH就會(huì)不穩(wěn)定發(fā)生脫水。 因此，這個(gè)化合物只能是C16位上發(fā)生了羥化。 而且，這個(gè)代謝物與前文檢測(cè)出的16β-羥基司坦唑醇保留時(shí)間不同，是16β-羥基司坦唑醇的同分異構(gòu)物， 因此代謝物③可能為16α-羥基司坦唑醇。 但本實(shí)驗(yàn)缺少相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，因此無(wú)法進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上， 本實(shí)驗(yàn)分析得到的代謝產(chǎn)物一共有6個(gè)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

由于待測(cè)組分存在響應(yīng)值低的缺點(diǎn)， 因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)代謝產(chǎn)物的分析并不完善。 這種現(xiàn)象是否可以通過(guò)加大濃度和采用更高分辨率儀器進(jìn)行改善還有待研究。

3.2 代謝產(chǎn)物濃度－時(shí)間變化曲線分析與討論

通過(guò)分析服藥后馬尿中藥物濃度， 可以根據(jù)這幾個(gè)代謝物代謝時(shí)間和濃度等的不同得出一些結(jié)論和啟示。

（1）服藥后3小時(shí)，馬尿中均有目標(biāo)藥物出現(xiàn)且濃度均高于LOD，尤其是4α-羥基司坦唑醇，服藥后3小時(shí)就已到達(dá)峰值水平。

（2）16β-羥基司坦唑醇在尿中的峰值濃度高于其他三個(gè)代謝物。

（3）司坦唑醇有一定濃度的藥物原型殘留在尿中。（4）司坦唑醇原型、3’、4α-羥基司坦唑醇在第98小時(shí)仍有高于LOD的藥物殘留， 而16β-羥基司坦唑醇在58小時(shí)后的尿樣中便不能檢出高于LOD的濃度。

表2 馬尿中司坦唑醇代謝產(chǎn)物結(jié)果

以上結(jié)論提示興奮劑檢測(cè)工作者們選擇目標(biāo)代謝物時(shí)要充分考慮藥物在尿中的殘留濃度和持續(xù)時(shí)間這兩方面的因素； 本實(shí)驗(yàn)可作為馬尿中檢測(cè)司坦唑醇的參考，將本實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)果列入檢測(cè)方法中。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)單次劑量口服司坦唑醇后馬的尿樣進(jìn)行了采集， 用LC-MS/MS儀器對(duì)尿樣中代謝物進(jìn)行了分析，檢出了藥物原型以及5種代謝產(chǎn)物；并通過(guò)建立藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到了司坦唑醇主要代謝產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間變化曲線， 為馬術(shù)運(yùn)動(dòng)中檢測(cè)司坦唑醇提供了更多的參考。 本實(shí)驗(yàn)還存在一些不足，如進(jìn)行藥物代謝分析時(shí)待測(cè)組分濃度值低、質(zhì)譜響應(yīng)值不理想等情況。

[1] Ferchaud V, Le Bizec B, Montrade MP, et al. Gas chromatographic-mass spectrometric identification of main metabolites of stanozolol in cattle after oral and subcutaneous administration[J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1997，695(2):269-277.

[2] Thevis M, Fuβhller G, Geyer H, et al. Detection of stanozolol and its major metabolites in human urine by liquid chromatography -tandem mass spectrometry [J].Chromatographia, 2006,64(7-8):441-446.

[3] Pozo OJ, Van Eenoo P, Deventer K, et al. Detection and structural investigation of metabolites of stanozolol in human urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Steroids,2009,74（10-11）:837-852.

[4] Mück WM, Henion JD. High‐performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry: Its use for the identification of stanozolol and its major metabolites in human and equine urine[J]. Biomed Environ Mass Spectrom，1990，19(1):37-51.

[5] McKinney AR, Suann CJ, Dunstan AJ, et al. Detection of stanozolol and its metabolites in equine urine by liquid chromatography-electrospray ionization ion trap mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004,811（1）:75-83.

[6] World Anti-Doping Agency.WADA Technical Document-TD2010IDCR [EB/OL]. https://www.wada- ama.org/ en/resources/science-medicine/td2010-idcr, 2010.