叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及其大鼠系膜細(xì)胞株的建立*

岳欣閣，劉飛，秦貴軍，王慶祝，張?jiān)?/p>

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.老年內(nèi)分泌科；2.內(nèi)分泌科，河南 鄭州450000）

叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）是FoxO亞家族中主要成員之一。國內(nèi)外研究表明，F(xiàn)oxO1在機(jī)體能量代謝、細(xì)胞增殖/凋亡、DNA損傷/修復(fù)、抗氧化應(yīng)激及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[1-3]，但關(guān)于FoxO1的功能及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。以往研究中調(diào)節(jié)FoxO1表達(dá)的脂質(zhì)體介導(dǎo)法及腺病毒載體等轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別存在不足之處，如轉(zhuǎn)染效率低，特異性差，免疫損傷強(qiáng)、非持續(xù)性干擾等，尚不能完全滿足實(shí)驗(yàn)需求，尤其不能應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所以，如何高效、穩(wěn)定、特異性的調(diào)控細(xì)胞內(nèi)FoxO1的表達(dá)成為進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。慢病毒載體（lentiviral vector，LV）是一種感染范圍廣、感染效率高、免疫損傷小、包裝能力強(qiáng)，并能通過基因整合穩(wěn)定持續(xù)的調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)基因技術(shù)[4]。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建了包含組成性激活突變型（constitutively active，CA）FoxO1基因的過表達(dá)慢病毒載體，并感染大鼠系膜細(xì)胞株HBZY-1，建立了穩(wěn)定過表達(dá)目的基因細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究FoxO1基因生物學(xué)功能提供了理想的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人胚腎細(xì)胞系（293T）、大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY-1）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。重組FoxO1基因載體質(zhì)粒和3個(gè)包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev和pVSV-G）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；高純度質(zhì)粒中量抽提試劑盒（凱杰生物技術(shù)有限公司）；引物設(shè)計(jì)與合成及堿基測(cè)序（上海生工生物工程股份有限公司）；超純RNA提取試劑盒、DMEM培養(yǎng)液（北京索來寶科技有限公司）；鏈霉素（上海信裕生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒、Ultra SYBR Mixture、哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；FoxO1兔單克隆抗體（美國Abcam公司）；β-actin兔多克隆抗體（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 293T、HBZY-1細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（NC組）、空慢病毒載體對(duì)照組（LV-empty-FoxO1組）和過表達(dá)慢病毒載體組（LV-CA-FoxO1組）。

1.2.2 構(gòu)建組成性激活突變型FoxO1過表達(dá)慢病毒載體 根據(jù)Gene數(shù)據(jù)庫中大鼠FoxO1基因（NM 001191846.2）信息可知，其編碼序列為106～2055（共1 950 bp），翻譯成含649個(gè)氨基酸的FoxO1蛋白；再根據(jù)JEAN BUTEAU[5]的研究，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成3個(gè)高度保守的磷酸化位點(diǎn)突變的大鼠FoxO1編碼序列，由丙氨酸替代3個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），并在其5’端和3’端分別加入NsiI和BamHI酶切位點(diǎn)。將其連接入經(jīng)雙酶切的攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和鏈霉素抗性編碼序列質(zhì)粒載體pGLV4-GFP，再將重組質(zhì)粒載體pGLV4-GFP/CA-FoxO1轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性的重組克隆并進(jìn)行測(cè)序鑒定。然后，根據(jù)第4代慢病毒載體四質(zhì)粒合成法，將重組質(zhì)粒載體和3個(gè)包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev和pVSV-G）混合后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清液，過濾、離心和濃縮后，得到高滴度的慢病毒濃縮液，將重組慢病毒載體命名為LV-CA-FoxO1。此外，構(gòu)建攜帶GFP編碼序列而不含F(xiàn)oxO1編碼序列的空慢病毒載體（LV-empty-FoxO1）作為陰性對(duì)照。

1.2.3 檢測(cè)重組慢病毒滴度檢測(cè) 將293T細(xì)胞按2×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，再將慢病毒原液10μl，用完全培養(yǎng)液十倍稀釋成6個(gè)梯度，稀釋因子（dilution factor，DF）分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5。吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入100μl不同梯度病毒稀釋液，每個(gè)梯度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.2.4 慢病毒載體感染RMCs的效率 實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（NC組）、空慢病毒載體陰性對(duì)照組（LV-empty-FoxO1組） 和過表達(dá)慢病毒載體組（LV-CA-FoxO1組）。將RMCs按2×104個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，吸棄舊培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)液480μl/well，再分別取20μl的完全培養(yǎng)液、LV-empty-FoxO1病毒原液與LV-CA-FoxO1病毒原液加到相應(yīng)組中。感染72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，再經(jīng)FACS檢測(cè)各組GFP陽性表達(dá)率，所測(cè)結(jié)果即為慢病毒載體感染RMCs的效率。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄水平干涉效果檢測(cè) 將RMCs按1×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分為3組（分組同1.2.4），各組分別加入含100μl的培養(yǎng)液、100μL的LV-empty-FoxO1病毒原液和100μl的LV-CA-FoxO1病毒原液的2m l完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后，提取總RNA并測(cè)定RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-RCP擴(kuò)增。引物序列分別為：FoxO1上游：5'-AATTTGCTAAGAGCCGAGGA-3'，下 游：5'-AAGTCATCATTGCTGTGGGA-3'，擴(kuò) 增片段長度為136 bp；以GAPDH為內(nèi)參，上游：5'-GC CACTCAGAAGACTCTGGA-3'，下游：5'-GTTCAGCT CTGGGATGACCT-3'，擴(kuò)增片段長度為129 bp。兩步法qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，10min；變性95℃，15 s；退火/延伸60℃，1min（變性+退火/延伸，40個(gè)循環(huán)）；溶解曲線分析：95℃，15 s；60℃，1min；95℃，15 s；60℃，15 s。采用相對(duì)定量法，以Folds=2-△△Ct[5]表示待測(cè)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)量的倍比關(guān)系，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算平均值。

1.2.6 翻譯水平干涉效果檢測(cè) 上述同樣條件鋪板并處理細(xì)胞。培養(yǎng)72 h后，提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳、半干轉(zhuǎn)膜、封閉和剪膜，將含有目的蛋白Fox-O1（80 kD）與內(nèi)參蛋白β-actin（43 kD）的PVDF膜分別置于1∶1 000稀釋的抗FoxO1抗體及1∶1 000稀釋的抗β-actin抗體，室溫孵育1 h。漂洗后，加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育1 h。再次漂洗后，加入電化學(xué)發(fā)光顯影劑，暗室內(nèi)曝光顯影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶密度掃描并分析，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用所測(cè)目的條帶與相應(yīng)β-actin條帶信號(hào)強(qiáng)度的比值表示目的蛋白的相對(duì)含量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換正態(tài)化后，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的測(cè)序鑒定

圖1 重組慢病毒質(zhì)粒載體部分堿基測(cè)序圖

圖1分別為起、止部分的測(cè)序片段。測(cè)序結(jié)果表明，除3個(gè)高度保守的磷酸化位點(diǎn)由丙氨酸替代外（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），其他堿基序列與FoxO1基因完整編碼序列相符，CA-FoxO1編碼序列共1 950 bp。此外，該重組基因正確插入了兩端含NsiI和BamHI酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體pGLV4-GFP中，成功構(gòu)建了組成性激活突變型FoxO1過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒。

2.2 測(cè)定重組慢病毒載體的病毒滴度

不同梯度的病毒稀釋液感染293T細(xì)胞72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各個(gè)梯度的GFP表達(dá)情況。見圖2。計(jì)數(shù)最后一個(gè)含有熒光細(xì)胞的孔中的熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)約為10個(gè)，將得到的數(shù)值除以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)10-5/10μl，即可計(jì)算出該病毒原液的滴度值約為1×108TU/ml。

圖2 不同梯度慢病毒稀釋液感染293T細(xì)胞72 h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況（×40）

2.3 檢測(cè)重組慢病毒載體感染RMCs感染效率

RMCs被感染72 h后，LV-empty-FoxO1組與LV-CA-FoxO1組的RMCs均高效表達(dá)GFP。見圖3。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，NC組的RMCs無GFP表達(dá)，而LV-empty-FoxO1組與LV-CA-FoxO1組RMCs的GFP陽性表達(dá)率高達(dá)84.5%和81.4%，即慢病毒載體對(duì)RMCs的感染效率，且兩組GFP表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.69，P>0.05）。見圖4。由此可知，慢病毒載體已經(jīng)成功、高效地感染RMCs，重組CA-FoxO1編碼序列也已整合到宿主基因組中。因重組質(zhì)粒中攜帶有鏈霉素抗性基因，所以用鏈霉素篩選RMCs，已整合有外源基因的RMCs才能夠抗鏈霉素存活下來。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)各組FoxO1 mRNA的表達(dá)

圖3 倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒載體感染RMCs 72 h后的綠色熒光蛋白表達(dá)情況（×100）

按不同要求處理各組RMCs 72 h后，qRT-PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示：NC組與LV-empty-FoxO1組FoxO1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與NC組比，LV-CA-FoxO1組FoxO1 mRNA相當(dāng)于NC組的27.92倍（t=439.1，P<0.05）。見附表。

2.5 Western bolt檢測(cè)各組FoxO1蛋白的表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞儀分析慢病毒載體感染RMCs的綠色熒光蛋白陽性表達(dá)率

通過Gel-Pro analyzer軟件對(duì)條帶密度掃描并分析可知，RMCs被處理72 h后，NC組與LV-empty-FoxO1組FoxO1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.92，P>0.05），與NC組相比，LV-CA-FoxO1組FoxO1蛋白表達(dá)量相當(dāng)于NC組的5.41倍（t=45.91，P<0.05）。見圖5。由此可知，該重組慢病毒載體能夠高效、穩(wěn)定的上調(diào)組成性激活突變型FoxO1蛋白的表達(dá)。

附表 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組FoxO1 m RNA相對(duì)表達(dá)量情況 （n=6，±s）

附表 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組FoxO1 m RNA相對(duì)表達(dá)量情況 （n=6，±s）

注：1）與NC組相比，P<0.05；2）與LV-empty-FoxO1組相比，P<0.05

組別 2-ΔΔCt（FoxO1）NC組 -LV-empty-FoxO1組 0.98±0.03 LV-CA-FoxO1組 27.92±1.321）2）Ct（GAPDH） Ct（FoxO1）16.81±0.24 23.44±0.34 16.29±0.14 23.10±0.40 19.21±0.381）2）18.44±0.371）2）

圖5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組FoxO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子目前被分為17個(gè)亞家族，F(xiàn)ox-A～Q。FoxO轉(zhuǎn)錄因子是其中的一個(gè)重要亞家族，F(xiàn)oxO1又是FoxO亞家族中被最早發(fā)現(xiàn)的成員之一。FoxO1轉(zhuǎn)錄因子是INS/IGF-1通路中重要信號(hào)分子，對(duì)下游靶基因的表達(dá)有一定調(diào)控作用。FoxO1有多個(gè)高度保守的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。無刺激因子時(shí)，F(xiàn)oxO1處于非磷酸化狀態(tài)并位于細(xì)胞核內(nèi)；在生長因子或血清刺激下，F(xiàn)oxO1被上游活化的蛋白激酶B（PKB）磷酸化，相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化可抑制FoxO1與DNA的結(jié)合，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)從而失去調(diào)控下游靶基因的活性[6-7]。因此，根據(jù)JEAN BUTEAU的研究[8]，通過人工合成將高度保守的磷酸化位點(diǎn)絲氨酸與絲氨酸替換成丙氨酸（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），使FoxO1蛋白不能被磷酸化，從而持續(xù)保持活性調(diào)控下游靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)堿基測(cè)序確定重組FoxO1基因合成正確且插入質(zhì)粒載體位置正確；根據(jù)倒置熒光顯微鏡觀察，計(jì)算出該慢病毒滴度為1×108TU/ml；LV-CA-FoxO1慢病毒載體以優(yōu)化條件感染RMCs 72 h后，F(xiàn)ACS檢測(cè)RMCs的GFP表達(dá)率為81.4%，表明慢病毒載體已成功將重組外源基因整合到RMCs基因組中；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，LV-CA-FoxO1組FoxO1 mRNA表達(dá)量相當(dāng)于對(duì)照組的27.92倍；免疫蛋白印跡法檢測(cè)LV-CA-FoxO1組FoxO1蛋白表達(dá)量相當(dāng)于對(duì)照組的5.41倍。上述結(jié)果證實(shí)，本研究成功構(gòu)建了大鼠組成性激活突變型FoxO1基因的過表達(dá)慢病毒載體，并建立了高效、穩(wěn)定的過表達(dá)活性FoxO1的系膜細(xì)胞株。

近年來廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)研究的脂質(zhì)體介導(dǎo)法雖具有簡單、安全，低免疫原性，可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但不易獲得理想的轉(zhuǎn)染效率[9]。腺病毒載體法雖具有可感染不分裂細(xì)胞、細(xì)胞滴度高、病毒穩(wěn)定易保存等優(yōu)點(diǎn)，但其非整合作用使之不能持續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物，高免疫原性造成對(duì)細(xì)胞損傷[10]。而慢病毒載體具有感染范圍廣、感染效率高、免疫反應(yīng)小、包裝能力強(qiáng)，并能通過基因整合穩(wěn)定持續(xù)的調(diào)節(jié)目的基因等特點(diǎn)，特別是在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)特點(diǎn)尤為突出[4]。

本研究采用第四代慢病毒載體組分已經(jīng)過如下改造：①刪除了全部HIV-1的編碼基因；②對(duì)5’和3’LTR分別進(jìn)行了刪除改造，使其不再具有啟動(dòng)/增強(qiáng)活性，成為自滅活載體；③病毒包裝必需的3個(gè)蛋白Gag/Pol、Rev和VSV-G 分別獨(dú)立放置在pGag/Pol、pRev和pVSV-G 3個(gè)質(zhì)粒上，且相互之間沒有任何同源序列，大大降低了復(fù)制型慢病毒的產(chǎn)生幾率。使其在安全性方面已得到大幅提高。但仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒和致癌的風(fēng)險(xiǎn)，操作者在實(shí)驗(yàn)中仍需要保持高度警惕。

綜上所述，本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)，構(gòu)建組成性激活突變型FoxO1基因過表達(dá)慢病毒載體及篩選出穩(wěn)定、高效過表達(dá)活性Fox-O1蛋白的系膜細(xì)胞株為進(jìn)一步的研究FoxO1蛋白的功能和作用機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。本課題組正以此為方法開展細(xì)胞學(xué)水平及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)一步探索FoxO1的功能及其作用機(jī)制。

[1]KAMAGATE A,KIM DH,ZHANG T,et al.FoxO1 links hepatic insulin action to endoplasmic reticulum stress[J].Endocrinology,2010,151(8):3521-3535.

[2]WU L,ZHANG Y,QIN G,et al.The effect of resveratrol on FoxO1 expression in kidneys of diabetic nephropathy rats[J].Mol Biol Rep,2012,39(9):9085-9093.

[3]吉鴻飛,秦貴軍,張偉偉,等.叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響[J].中華糖尿病雜志,2012,4(11):681-685.

[4]SAKUMA T,BARRT MA,IKEDA Y.Lentiviral vectors:basic to translational[J].Biochem J,2012,443(3):603-618.

[5]LIVAK KJ,SCHMITTGEN TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-CT method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[6]BRUNET A,BONNI A,ZIGMOND MJ,et al.Akt promotes cell survivalby phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor[J].Cell,1999,96(6):857-868.

[7]RENA G,PRESCOTT AR,GUO S,et al.Roles of the forkhead inrhabdomyosarcoma(FKHR)phosphorylation sites in regulating 14-3-3 binding,transactivation and nuclear targeting[J].Biochem J,2001,354(3):605-612.

[8]BUTEAU J,SHLIEN A,FOISY S,et al.Metabolic diapause in pancreatic beta-cells expressing a gain-of-function mutant of the forkhead protein Foxo1[J].J Biol Chem,2007,282(1):287-293.

[9]MOZAFARI MR.Liposomes:an overview of manufacturing techniques[J].Cell Mol Biol Lett,2005,10(4):711-719.

[10]GLASGOW JN,EVERTS M,CURIEL DT.Transductional targeting of adenovirus vectors for gene therapy[J].Cancer Gene Ther,2006,13(9):830-844.