齊墩果酸對雄性小鼠化學性肝損傷的作用研究

郗艷麗，陳航宇，李雅玲，張洋婷，葛紅娟，劉 敏 (吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林 132013)

齊墩果酸是一種天然產(chǎn)物化學成分，廣泛存在于青葉膽、血膽、女貞子、西洋參、連翹、柿葉、景天三七、夏枯草等植物中［1-3］。從1908 年齊墩果酸首次被分離出來以后，其新的藥用價值不斷被發(fā)現(xiàn)。目前，已經(jīng)證實齊墩果酸具有降糖、降脂、抗病毒、抗癌等多種生物學活性［4-6］。此外，齊墩果酸還被證實具有抑制自由基生成，保肝、護肝的作用。由于齊墩果酸不斷地被開發(fā)和利用，其作用機制也不斷地被探索。齊墩果酸能抑制四氯化碳(CCl4)所致自由基生成，其作用機制與齊墩果酸本身帶有一些活潑的官能團有關。這些官能團可以與毒CCl4結合，起到解毒的作用［7］，且在注射CCl4之前預先皮下注射齊墩果酸有保肝作用［8］。但注射CCl4的同時給予齊墩果酸灌胃是否也能起到保肝、護肝作用則鮮有報道。本研究通過檢測齊墩果酸對小鼠臟器系數(shù)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影響，觀察CCl4與齊墩果酸同時給藥的方法對小鼠氧化損傷的作用，為齊墩果酸的開發(fā)奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

齊墩果酸(西安文竹生物科技有限公司，用時制備成300 mg/mL 豆油溶液)，肝素鈉(天津生物化學制藥有限公司)，CCl4(天津市巴斯夫化工有限公司)，無水乙醇和氯仿(天津市永大化學試劑有限公司)。

電子分析天平(BS224S，北京賽多利斯)，分光光度計(722 型，中國廈門分析儀器廠)，離心機(TDZ5-WS，湖南湘儀離心機儀器有限公司)，冰箱(海爾)。

1.2 動物分組

健康雄性小鼠30 只，體重(25 ～28)g，購于長春市億斯實驗動物技術有限公司。用普通飼料飼養(yǎng)1周后使用。隨機分為3 組:空白組(3 mL/kg 生理鹽水腹腔注射同時給予0.1 mL/100 g 豆油灌胃，隔天相同劑量豆油再灌胃一次)、模型組(3 mL/kg CCl4原液腹腔注射一次同時給予0.1 mL/100 g 豆油灌胃，隔天相同劑量的豆油再灌胃一次)，同時給藥組(3 mL/kg CCl4原液腹腔注射一次同時給予0.1 mL/100 g 齊墩果酸油溶液灌胃，隔天齊墩果酸油溶液再灌胃一次)，每組10 只。各組于末次給藥后禁食24 h，不禁水，眼球取血，制成抗凝血。同時取出臟器(心、肝、脾、肺、腎)。

1.3 臟器系數(shù)計算

每只小鼠處死前稱量活體體重，處死后立即摘取臟器，快速浸于生理鹽水中，洗去血污，用濾紙吸干水分，稱量臟器濕重，小鼠活體體重和臟器濕重均以(g)為單位。臟器系數(shù)= 臟器濕重/活體體重×100%。

1.4 全血SOD 含量檢測

取抗凝血50 μL，迅速沖入含有1 mL 生理鹽水的2 mL 具塞刻度離心管中，在漩渦混合器上混合均勻，3 000 rpm 離心10 min，棄去上清。加入4 ℃預冷的雙蒸餾水0.2 mL，使其完全溶血，再加入4 ℃預冷的乙醇-氯仿混合液0.2 mL，于漩渦混合器上混懸1 min，3 000 rpm 離心15 min。離心后的液體分為三層:上層為SOD 抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為氯仿。吸取上層SOD 抽提液，按照鄰苯三酚法測定全血中SOD 的含量［9］。

肝組織勻漿SOD 含量檢測:留取肝臟相同部位0.5 g，以1∶ 9(m/V)的生理鹽水制成組織勻漿，鄰苯三酚法檢測肝組織SOD 含量。

1.5 MDA 含量測定

血清 MDA 含量檢測:將抗凝血靜止后，3 000 rpm離心10 min，吸取血清，采用硫代巴比妥鈉法測定血清中MDA 的含量，比色后利用公式求出MDA 含量［10］。

肝組織勻漿MDA 含量檢測:留取肝臟相同部位0.5 g，以1∶ 9(m/V)的KCl 溶液(150 mmol/L)制成勻漿，硫代巴比妥鈉法測定肝組織MDA 含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)應用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行分析。各項數(shù)據(jù)以(±s)表示，用單因素方差分析及t 檢驗比較組間差異。

2 結 果

2.1 臟器系數(shù)

與對照組比較，模型組和同時給藥組肝臟臟器系數(shù)明顯升高(P ＜0.05)，腎臟臟器系數(shù)、肺臟臟器系數(shù)、脾臟臟器系數(shù)、心臟臟器系數(shù)均沒有明顯變化(P ＞0.05);與模型組比較，同時給藥組肝臟臟器系數(shù)、腎臟臟器系數(shù)、肺臟臟器系數(shù)、脾臟臟器系數(shù)、心臟臟器系數(shù)均沒有明顯改變(P ＞0.05)。

2.2 SOD 含量測定

模型組和同時給藥組全血SOD 含量較對照組明顯降低(P ＜0.05);同時給藥組全血SOD 含量與模型組相比沒有明顯差異(P ＞0.05)。模型組和同時給藥組肝組織勻漿SOD 含量較對照組明顯降低(P ＜0.05);同時給藥組肝組織勻漿SOD 含量與模型組相比沒有明顯差異(P ＞0.05)。

2.3 MDA 含量測定

模型組和同時給藥組血清MDA 含量較對照組明顯升高(P ＜0.05);同時給藥組血清MDA 含量與模型組相比沒有明顯差異(P ＞0.05)。模型組和同時給藥組肝組織勻漿MDA 含量較對照組明顯升高(P ＜0.05);同時給藥組肝組織勻漿MDA 含量與模型組相比沒有明顯差異(P ＞0.05)。

3 討 論

CCl4誘導肝臟發(fā)生的損傷，會在短時間內快速的出現(xiàn)，經(jīng)一段時間的恢復，可以恢復到用藥前水平，模型具有可逆性。為了避免模型自愈，能及時觀察干預效果，本研究選擇了短期給藥的方式，觀察齊墩果酸對化學性肝損傷的影響。

齊墩果酸廣泛存在于各種藥材植物中，水果當中(如木瓜)也含有豐富的齊墩果酸。考慮到動物給藥方式盡可能與人接近的原則，本研究采用灌胃的方式給予齊墩果酸。

表1 齊墩果酸對化學性肝損傷雄性小鼠臟器系數(shù)的影響(±s，n=10)

表1 齊墩果酸對化學性肝損傷雄性小鼠臟器系數(shù)的影響(±s，n=10)

與對照組比較，* P ＜0.05

?

圖1 齊墩果酸對化學性肝損傷雄性小鼠SOD 含量的影響

圖2 齊墩果酸對化學性肝損傷雄性小鼠MDA 含量的影響

實驗結果表明，與正常對照組比較，CCl4致化學性肝損傷模型組肝臟臟器系數(shù)及各項生化指標均有顯著性改變，說明本試驗建立的化學性肝損傷模型成功。注射CCl4的同時給予齊墩果酸，并未抑制CCl4致化學性肝損傷導致的肝組織和血液中SOD 含量的下降和MDA 含量的升高。說明齊墩果酸沒能提高SOD 的活力，并及時清除產(chǎn)生的自由基，避免由自由基的大量堆積引起的氧化損傷和脂質過氧化，在抗氧化損傷和脂質過氧化過程中沒能發(fā)揮作用。高濃度的CCl4有溶酶的作用，齊墩果酸需要先激活體內的酶系統(tǒng)發(fā)揮作用。本研究表明CCl4與齊墩果酸發(fā)揮效應的酶系統(tǒng)可能是相同的，一旦酶系統(tǒng)受損后，齊墩果酸很難在短時間內恢復受損的酶系統(tǒng)。此外，CCl4腹腔注射以后，會快速進入血液，引起損傷。齊墩果酸通過灌胃的途徑吸收后，需要經(jīng)過肝臟的首過消除作用，大大降低了齊墩果酸入血的量，而且延長了齊墩果酸到達血液的時間，導致齊墩果酸發(fā)揮作用的時間可能晚于損傷的時間，影響了干預效果。綜上所述，注射CCl4的同時給予齊墩果酸灌胃的方式，不能有效抑制損傷，發(fā)揮保肝、護肝的作用。

［1］ 孔陽，馬養(yǎng)民.大孔樹脂分離純化女貞子中齊墩果酸工藝的研究［J］.陜西科技大學學報:自然科學版，2012，30(4):57-60.

［2］ 何新蕾，于棟.響應面優(yōu)化女貞子齊墩果酸提取工藝研究［J］.食品工業(yè)，2014，35(7):92-95.

［3］ 張蜀艷，李政.齊墩果酸研究進展［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46(4):22-24.

［4］ 吳勃巖，王雪，董靜，等.齊墩果酸對S180 荷瘤小鼠細胞色素C 和Caspase-3 表達的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31(4):14-16.

［5］ 柳占彪，王鼎，王淑珍，等.齊墩果酸的降糖作用［J］.中國藥學雜志，1994，29(12):725-726.

［6］ 劉厚佳，胡晉紅，孫蓮娜，等.木瓜中齊墩果酸抗乙型肝炎病毒研究［J］.解放軍藥學學報，2002，18(5):272-273.

［7］ 趙駿，藍茹.從齊墩果酸結構分析抗肝細胞損傷的作用機制［J］.中草藥，1998，29(12):844-884.

［8］ Liu Yaping，Hartley DP，Liu Jie.Protection against carbon tetrachloride hepatotoxicity by oleanolic acid is not mediated through matallothionein［J］.Toxicol Lett，1998，95(2):77-85.

［9］ 許申鴻，杭瑚，李運平.超氧化物歧化酶鄰苯三酚測活法的研究及改進［J］.化學通報，2001(8):516-519.

［10］ 趙淑娥.硫代巴比妥酸法(TBA 模型)預測魚糜制品保藏貨架期研究［J］.江西食品工業(yè)，2012(2):26-27.