B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子、維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt對(duì)急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

陳菊屏，原淑莉，張 明，王文軍，范賢明

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，四川 瀘州 646000)

B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子、維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt對(duì)急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

陳菊屏，原淑莉，張 明，王文軍，范賢明

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，四川 瀘州 646000)

目的 探討B(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子(BATF)、白細(xì)胞介素-17及維甲酸孤兒核受體γt(RORγt)對(duì)急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法(1)將24只健康雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、哮喘模型組(AS組)、地塞米松治療組(DEX組)，每組8只。第0、7、14天，AS組、DEX組小鼠用卵清蛋白(OVA)抗原液腹腔內(nèi)注射致敏，NS組用等體積生理鹽水腹腔內(nèi)注射。第21天起，NS組超聲霧化吸入生理鹽水，AS組、DEX組超聲霧化吸入2%的OVA液，均為每天1次，每次40 min，連續(xù)5 d。每次霧化前30 min，DEX組以地塞米松1.0 mg/kg腹腔注射，NS組、AS組則以等體積的生理鹽水腹腔注射。末次霧化結(jié)束24 h后，各組小鼠留取肺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(1)肺組織切片顯示：NS組肺組織無明顯炎癥反應(yīng)，AS組及DEX組均存在炎癥反應(yīng)，且AS組炎癥反應(yīng)明顯高于DEX組。(2)免疫組化結(jié)果顯示：AS組肺組織BATF、IL-17、RORγt的表達(dá)明顯高于NS組、DEX組(P＜0.05)；DEX組肺組織IL-17、BATF、RORγt的表達(dá)較AS組明顯降低(P＜0.05)。(3)肺組織BATF的表達(dá)與BALF中白細(xì)胞(WBC)總數(shù)及中性粒細(xì)胞(NEU)計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.487、0.531、0.515，P＜0.05)；肺組織BATF的表達(dá)與IL-17、RORγt的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.502、0.493，P＜0.05)；肺組織IL-17的表達(dá)與RORγt的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.536，P＜0.05)。結(jié)論(1)急性哮喘小鼠肺組織中BATF、IL-17、RORγt表達(dá)上調(diào)。(2)地塞米松可能是通過下調(diào)BATF、IL-17、RORγt的表達(dá)而減輕氣道炎癥性損害。

支氣管哮喘；白細(xì)胞介素17；B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子；維甲酸孤兒核受體γt；氣道炎癥

支氣管哮喘(Bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見疾病，由多種細(xì)胞和細(xì)胞組份參與，氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性(AHR)為其重要特征[1]。哮喘的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明；糖皮質(zhì)激素類藥物在哮喘治療方面作用顯著，但其作用途徑亦不甚明確。B細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子(BATF)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(Retinoic acid-related orphan receptor，RORγt)近年研究較多的炎癥因子，本研究以哮喘模型小鼠為研究對(duì)象，觀察BATF、IL-17、RORγt與哮喘及地塞米松之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制及對(duì)哮喘治療的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及哮喘動(dòng)物模型的制備 24只SPF級(jí)健康雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重15～18 g，購自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、哮喘模型組(AS組)、地塞米松治療組(DEX組)，每組8只。AS組、DEX組小鼠分別于第0、7、14天用卵清蛋白(OVA，美國(guó)Sigma公司)原液100 μg加1 mg氫氧化鋁及生理鹽水配置成200 μl混懸液，4℃冰箱放置30 min后腹腔內(nèi)注射致敏，NS組用等量0.9%的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。第21天開始AS組、DEX組小鼠分別置于自制的30 cm×40 cm×40 cm大小的透明封閉箱內(nèi)，以2%的OVA超聲霧化吸入30～40 min，每天1次，連續(xù)5 d，NS組則予以等量生理鹽水同頻次霧化[2]。DEX組于每次霧化前30 min，予以地塞米松1.0 mg/kg(湖北頂輝化工有限公司)腹腔注射，NS組、AS組則予以等體積生理鹽水腹腔注射，時(shí)間同上。

1.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集及檢查 各組小鼠末次激發(fā)結(jié)束24 h后，分別予戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，用1 ml注射器行氣管插管，注入37℃生理鹽水0.5 ml，反復(fù)抽吸肺泡灌洗液(BALF)，重復(fù)3次，回收率均在80%以上，離心BALF取上清轉(zhuǎn)移到EP管中，-20℃冰箱保存待檢。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)及嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)。

1.3 小鼠肺組織病理切片、染色及BATF、IL-17、RORγt表達(dá)的檢測(cè) 取右肺組織制備病理切片，HE(蘇木素-伊紅)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)左肺組織IL-17、BATF、RORγt的表達(dá)。石蠟包埋組織，常規(guī)脫蠟、切片，抗原修復(fù)后行內(nèi)源性過氧化物酶封閉，分別加IL-17A兔抗人多克隆抗體(購于北京博奧森生物有限技術(shù)公司)、BATF兔抗人多克隆抗體(購于NOVUS BIOLOGICALS)及RORγt兔抗人多克隆抗體(購于北京博奧森生物有限技術(shù)公司)過夜，加二抗(bs-0360R試劑盒，購于北京博奧森生物有限技術(shù)公司)，按試劑盒說明步驟操作。以普通光鏡觀察切片，胞漿呈棕褐色或棕黃色為陽性。利用彩色圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)采集，隨機(jī)測(cè)量每高倍鏡視野下積分吸光度(IA)，以IA的值反映切片中陽性物質(zhì)的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用雙變量相關(guān)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠哮喘模型的氣道炎癥改變

2.1.1 各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變 NS組小鼠肺組織鏡下可見支氣管管腔光滑、規(guī)則，氣道上皮完整，黏膜皺襞低平，管壁平滑肌較薄，管腔內(nèi)未見明顯分泌物。AS組支氣管管腔狹窄，管壁增厚，多處氣道上皮斷裂、脫落，氣道黏膜增生肥厚，纖毛結(jié)構(gòu)紊亂，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚明顯，管腔內(nèi)可見大量黏液堆積；DEX組的上述表現(xiàn)較AS組減輕，但較NS組明顯。

2.1.2 各組小鼠BALF中WBC總數(shù)、PMN計(jì)數(shù)及EOS計(jì)數(shù)比較 與NS組比較，AS組及DEX組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.01)；DEX組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)較AS組明顯減少(P＜0.01)，見表1。

表1 各組小鼠BALF中WBC總數(shù)、NEU及EOS計(jì)數(shù)比較(±s,×104/ml)

表1 各組小鼠BALF中WBC總數(shù)、NEU及EOS計(jì)數(shù)比較(±s,×104/ml)

注：a表示與NS組比較，P＜0.01；b表示與AS組比較，P＜0.01。

NS組AS組DEX組1.13±0.84 6.00±0.93a2.50±0.93ab8 8 8 4.88±1.25 20.50±0.93a9.25±1.04ab0.88±0.84 5.25±0.89a2.88±0.84ab

2.2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17、RORγt的表達(dá) 鏡下可見AS組、DEX組小鼠支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞顯示IL-17、BATF、RORγt表達(dá)的陽性顆粒明顯多于NS組；與AS組比較，DEX組顯示IL-17、BATF、RORγt表達(dá)的陽性顆粒明顯減少(如圖1)；積分吸光度分析提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 相關(guān)性分析 肺組織BATF的表達(dá)與BALF中WBC總數(shù)及NEU計(jì)數(shù)、EOS計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.487、0.531、0.515，P＜0.05)；肺組織BATF的表達(dá)與IL-17、RORγt的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.502、0.493，P＜0.05)；肺組織IL-17的表達(dá)與RORγt的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.536，P＜0.05)。

表2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17和RORγt的表達(dá)比較(±s)

表2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17和RORγt的表達(dá)比較(±s)

注：a表示與NS組比較，P＜0.05；b表示與AS組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù)BATFIL-17RORγt NS810.00±5.1335.50±8.6031.13±11.30 AS827.75±9.10a81.75±17.30a79.75±18.45aDEX817.88±7.06ab49.38±9.15ab45.25±8.51ab

圖1 NS組、AS組和DEX組小鼠肺組織BATF、IL-17及RORγt免疫組化染色(×400)

3 討論

哮喘是一種炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與其中。糖皮質(zhì)激素是目前臨床用于控制哮喘急性發(fā)作、延長(zhǎng)哮喘緩解周期最重要的藥物之一，其治療哮喘的主要作用是抑制哮喘的氣道炎癥、氣道黏液高分泌及氣道高反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，AS組小鼠氣道炎癥表現(xiàn)明顯，BALF中炎癥細(xì)胞明顯增多，伴隨BATF、IL-17、RORγt表達(dá)顯著增加，說明BATF、IL-17、RORγt參與了哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。而在DEX組，肺組織的氣道炎癥表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕，BALF中炎癥細(xì)胞亦減少，同時(shí)伴有BATF、IL-17、RORγt表達(dá)顯著下降，說明當(dāng)BATF、IL-17、RORγt受到抑制時(shí)，氣道炎癥會(huì)隨之減輕，進(jìn)一步表明炎癥因子BATF、IL-17、RORγt確實(shí)有促進(jìn)哮喘發(fā)病的作用。

B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子(B cell activating transcription factor，BATF)是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，屬于激活蛋白1(AP-1)超家族中的一員[3]。BATF與氣道炎癥密切相關(guān)。BATF(+/+)小鼠可被OVA致敏出現(xiàn)氣道高反應(yīng)、黏液分泌增加、IgE水平增高及氣道肥大細(xì)胞增多，而BATF(-/-)小鼠表現(xiàn)則相反[4]。BATF表達(dá)增多導(dǎo)致兒童哮喘病理生理反應(yīng)增加，阻斷BATF表達(dá)可改善哮喘兒童病理生理反應(yīng)。BATF可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞參與的哮喘免疫應(yīng)答。研究表明，BATF受IL-6調(diào)控，繼而影響Th17細(xì)胞，從而致哮喘發(fā)生發(fā)展。另有研究也證實(shí)BATF可致Th17生成增加[5]。進(jìn)一步的研究表明BATF激活可致RORγt表達(dá)增加，從而促進(jìn)Th17分化致哮喘發(fā)展。上述研究與本試驗(yàn)相一致。

孤兒核受體家族是核受體超家族中較獨(dú)特的成員，沒有確定的配體[6]，能通過調(diào)節(jié)基因參與免疫、炎癥反應(yīng)。視黃酸相關(guān)孤兒核受體(RORγt)是孤兒核受體的一種，是Th17的轉(zhuǎn)錄因子。哮喘發(fā)生時(shí)，Th17細(xì)胞在氣道大量聚集并產(chǎn)生IL-17。研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)生時(shí)，RORγt增高，Th17亦增高，伴隨IL-17產(chǎn)生增多，同時(shí)哮喘病理生理反應(yīng)亦明顯。當(dāng)RORγt表達(dá)受到抑制時(shí)，Th17數(shù)量亦下降，伴隨IL-17減少，同時(shí)哮喘病理生理反應(yīng)亦得到控制[7-8]。與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。

IL-17是一種強(qiáng)大的炎癥因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生[9-10]。在哮喘的表達(dá)明顯增高，IL-17能刺激成纖維細(xì)胞、上皮及內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E2(PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP、細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道IL-17增加，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞刺激Th17細(xì)胞生成更多的IL-17。在兒童哮喘患者氣道亦發(fā)現(xiàn)Th17及RORγt表達(dá)增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉誘發(fā)氣道高反應(yīng)的小鼠所表達(dá)的IL-17是增加的，而不能誘發(fā)氣道高反應(yīng)的小鼠所表達(dá)的IL-17是明顯減少的[11]。蟑螂變應(yīng)原介導(dǎo)的哮喘中IL-17的表達(dá)亦增高[12]。因此，IL-17參與了氣道高反應(yīng)及哮喘的發(fā)生，與本實(shí)驗(yàn)相吻合。

急性哮喘小鼠肺組織中BATF、IL-17、RORγt表達(dá)上調(diào)，且三者的表達(dá)一致。地塞米松可能是通過下調(diào)BATF、IL-17、RORγt的表達(dá)而減輕氣道炎癥性損害及哮喘癥狀，最終達(dá)到抑制氣道炎癥的效果。BATF、IL-17、RORγt參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，針對(duì)BATF、IL-17、RORγt靶向藥物將是我們研究治療哮喘的又一個(gè)新的方向。

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Effects of B cell activating transcription factor,retinoic acid-related orphan nuclear receptor γt on acute airway inflammation in asthmatic mice.

CHEN Ju-ping,YUAN Shu-li,ZHANG Ming,WANG Wen-jun,FAN Xian-min.The 2ndDepartment of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000, Sichuan,CHINA

Objective To study the role of the B cell activating transcription factor(BATF),IL-17 and the retinoic acid-related orphan nuclear receptor(RORγt)in acute airway inflammation of asthmatic mice.Methods(1)Twenty-four healthy female BALB/c mice were randomly divided into the normal saline group(NS group),the asthma group(AS group),and the dexamethasone group(DEX group),with 8 mice in each group.On days 0,7 and 14,ovalbumin(OVA)fluid was injected into the abdominal cavity of the mice in AS group and DEX group,and normal saline was injected into the abdominal cavity of the mice in NS group.From the 21stday,the mice in NS group were inhaled normal saline with 40 minutes of ultrasonic atomization once a day for five consecutive days,while the mice in AS group and DEX group were inhaled 2%OVAsolution in the same way.The mice in DEX group were given intraperitoneal injection of dexamethasone(1.0 mg/kg)at 30 minutes before the inhalation each time,and the mice in other groups were given the normal saline group in the same way.24 hours after the final inhalation,mice were collected the lung tissue samples for testing.Results(1)According to lung tissue sections,lung tissue in NS group had no significant inflammation,while the lung tissue in AS and DEX groups showed inflammation response.AS group's inflammatory response was higher than DEX group's.(2)Immunohistochemistry results showed the expression of BATF,IL-17 and RORγt in AS group were higher than that in NS group and DEX group(P＜0.05),and the expression in DEX group was significantly lower than the AS group(P＜0.05).(3)The expression of BATF in lung tissue was positively correlated with the count of WBC,NEU and EOS in the BALF differently(r=0.487,0.531,0.515,P＜0.05).The expression of BATF in lung tissue was positively correlated with the one of RORγt and IL-17 differently(r=0.502, 0.493,P＜0.05).The expression of IL-17 in lung tissue was positively correlated with the one of RORγt(r=0.536,P＜0.05).Conclusion(1)The expression of BATF,IL-17 and RORγt in AS group's lung tissue was increased significantly.(2)Dexamethasone could down-regulate the expression of BATF,IL-17 and RORγt in asthmatic mice,which would improve airway inflammatory.

Bronchial asthma;IL-17;B cell activating transcription factor(BATF);Retinoic-acid-related orphan nuclear receptor(RORγt);Airway inflammation

R-332

A

1003—6350（2015）07—0937—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0337

2014-10-21)

四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(編號(hào)：120328)；四川省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)資金(編號(hào)：川財(cái)社[2013]176號(hào))

范賢明。E-mail：fxm129@163.com