絮凝、吸附和超濾預(yù)處理谷氨酰胺發(fā)酵液研究

張偉　鐘麗梅　劉峰

摘 要：為進(jìn)一步純化和精制谷氨酰胺，采用絮凝、離心、活性炭吸附和超濾等方法對發(fā)酵液進(jìn)行了預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了絮凝的最佳條件，研究了活性炭對色素的吸附能力，嘗試了3種超濾膜的去蛋白和脫色效果。結(jié)果表明，殼聚糖濃度為250mg/L，殼聚糖和海藻酸鈉濃度比為1∶3，pH控制在5左右，溫度在25℃左右，攪拌強(qiáng)度為80r/min，絮凝時(shí)間為15min，絮凝效果最好，菌體去除率超過97%。用GH-15活性炭對絮凝后的發(fā)酵液脫色，脫色率達(dá)75%。使用截留分子量為6 000的超濾膜，脫色率進(jìn)一步提高了43.82%，蛋白去除率為75.33%。

關(guān)鍵詞：谷氨酰胺；殼聚糖；絮凝；吸附；超濾

中圖分類號 TS20 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）06-19-04

Pretreatment on Glutamine Fermentation Broth by Flocculation，Adsorption and Ultrafiltration

Zhang Wei et al.

（College of Life Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108， China）

Abstract：In order to purify L-glutamine further，flocculation，centrifugalization，adsorption and ultrafiltration were used to pretreat fermentation broth.In this study，the flocculation condition has been optimized，the adsorption capacity of activated carbon （GH-15） for pigments was researched and the effect on removing proteins and decolourization of ultrafiltration was studied.This study showed the optimal condition of flocculation was as follows： chitosan 250mg/L，sodium alginate 750mg/L，pH 5，temperature 25℃，stirring intensity 80r/min，response time 15min，the removal rate of bacterial body exceeded 97%.The decolourization ratio was up to 75% with GH-15.The decolourization ratio incresed by 43.82% and the removal rate of proteins was 75.33% using the UF membrane with molecular weight cut off 6000.

Key words：L-glutamine；Chitosan；Flocculation；Adsorption；Ultrafiltration

L-谷氨酰胺是L-谷氨酸r-基酰胺化的一種氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，在機(jī)體內(nèi)含量豐富，對于生物體的代謝具有極其重要的作用，同時(shí)也是一種極具開發(fā)前途的新藥[1-3]?，F(xiàn)階段，谷氨酰胺的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法[4]，但由于發(fā)酵法產(chǎn)生的發(fā)酵液成分復(fù)雜，含有大量的菌體、蛋白質(zhì)、色素等其它物質(zhì)，這些雜質(zhì)對于谷氨酰胺的提取與精制帶來了很大困難，最終影響到谷氨酰胺的收率與質(zhì)量。因此，在提取純化之前，必須對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，目前去除菌體、蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)的方法主要有絮凝、離心、吸附、微濾，超濾等，這些方法單獨(dú)使用效果不佳，必須結(jié)合使用才能達(dá)到理想的效果。

殼聚糖是一種新型的高分子絮凝劑。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有很好的濃縮溶液、形成凝膠和成膜的能力，與絮凝劑殼聚糖結(jié)合使用，具有很好的助凝能力[5]。殼聚糖呈陽離子型，通過“橋架”作用和壓縮膠體雙電層結(jié)構(gòu)而絮凝，對于帶負(fù)電荷的菌體、蛋白具有很好的絮凝效果。對于蛋白、色素和多糖等大分子物質(zhì)，超濾有很好地去除效果[6]。在超濾前，先進(jìn)行絮凝、離心和吸附，大部分懸浮物被去除，在一定程度上減輕了超濾膜的污染問題。本文采用絮凝、離心、活性炭吸附和超濾等方法對谷氨酰胺發(fā)酵液進(jìn)行了預(yù)處理，為谷氨酰胺生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和設(shè)備 谷氨酰胺發(fā)酵液（本實(shí)驗(yàn)室提供）；殼聚糖；海藻酸鈉；GH-15活性炭，其它試劑均為AR。Ultrospec 2100 pro（Amersham Biosciences）；ZNCL-B（予華儀器有限責(zé)任公司）；SORVALL RC6+ Centrifuge（Thermo Scientific）；SBA-40D型生物傳感自動分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；PHS-3B型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；QuixStand臺式膜過濾分離系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絮凝實(shí)驗(yàn) 取100mL谷氨酰胺發(fā)酵液于200mL燒杯中，調(diào)節(jié)其pH。開啟溫度攪拌器，設(shè)定好溫度和轉(zhuǎn)速后，將盛有發(fā)酵液的燒杯放在其上，待溫度達(dá)到設(shè)定溫度后，將殼聚糖和海藻酸鈉慢慢加入其中，在400r/min攪拌速度下使發(fā)酵液和絮凝劑助凝劑充分接觸，2min后設(shè)定絮凝攪拌速率。

1.2.2 菌體去除率測定 以原發(fā)酵液菌含量為100%，純水為0，原發(fā)酵液通過稀釋，可以制備一系列菌含量不同的溶液，通過這些溶液和其對應(yīng)的OD600值，可以制備兩者之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 沉淀和活性炭吸附實(shí)驗(yàn)[7] 待絮凝結(jié)束后，在8 000r/min下離心沉淀，取上清液進(jìn)行活性炭吸附。吸附條件為：炭量60g，柱高30cm，柱直徑2.5cm，流速93mL/h，進(jìn)樣液體積650mL。在390nm處測定吸光度，脫色率DR（%）=（A0-A）/A0×100，式中：A0為脫色前吸光度，A為脫色后吸光度。

1.2.4 超濾實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵液經(jīng)絮凝、離心沉淀和活性炭吸附后，進(jìn)行超濾，超濾流程如圖1所示。

1.2.5 谷氨酰胺檢測 采用酸解-酶膜聯(lián)用法[8]。

1.2.6 蛋白含量測定 考馬斯亮藍(lán)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝最佳優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)

2.1.1 殼聚糖濃度對絮凝效果的影響 由圖2可知，當(dāng)殼聚糖濃度為250mg/L時(shí)，絮凝清液OD600值降到1左右，對應(yīng)的菌體除去率達(dá)到90%。當(dāng)殼聚糖濃度小于250mg/L時(shí)，絮凝劑用量不足，許多菌體還未與絮凝劑絮凝而留在溶液中。當(dāng)殼聚糖濃度大于250mg/L時(shí)，絮凝劑加入過量，菌體形成帶絮顆粒，其不能形成網(wǎng)狀狀態(tài)，使得絮凝顆粒小，因此絮凝效果差。

2.1.2 殼聚糖和海藻酸鈉的比例對絮凝效果的影響 為了增強(qiáng)絮凝效果，選擇海藻酸鈉作為助凝劑。由圖3可知，殼聚糖和海藻酸鈉濃度之比為1∶3時(shí)，絮凝效果最好，菌體去除率接近96%，比殼聚糖單獨(dú)使用提高6%，助絮凝效果良好。[98.00

2.1.3 pH值對絮凝效果的影響 有研究表明：在pH較低時(shí)，殼聚糖和蛋白結(jié)合體系更加穩(wěn)定，對外抵抗能力增強(qiáng)，造成這種現(xiàn)象的原因是低的pH有利于增強(qiáng)其氫鍵和靜電力[9]。由圖4可知，pH較低時(shí)，絮凝效果較好，pH在3～7，菌體去除率超過80%，其中pH值為5左右效果最佳，菌體去除率超過95%。pH值在3～5時(shí)，加入殼聚糖，殼聚糖和菌體表面作用蛋白、發(fā)酵液中少數(shù)游離蛋白結(jié)合，通過絮凝作用，菌體和少數(shù)游離蛋白沉淀下來。

2.1.4 溫度對絮凝效果的影響 由圖5可知，當(dāng)溫度在25℃左右時(shí)，絮凝效果最佳，菌體去除率超過95%。當(dāng)溫度較低時(shí)，由于絮凝劑與菌體結(jié)合蛋白作用頻率低，絮凝反應(yīng)慢，效果較差；當(dāng)溫度較高時(shí)，雖然絮凝劑與菌體結(jié)合蛋白作用頻率增高，但絮凝體細(xì)小，沉降效果差，因此菌體去除率較低。

圖5 溫度對絮凝效果的影響

2.1.5 攪拌時(shí)間對絮凝效果的影響 由圖6可知，絮凝時(shí)間以15min左右為宜。反應(yīng)時(shí)間太短，許多菌體還未絮凝，菌體去除率較低；反應(yīng)時(shí)間太長，由于攪拌，已經(jīng)形成的絮凝團(tuán)在剪切力的作用下遭到破壞，絮凝效果也較差。

2.1.6 攪拌強(qiáng)度對絮凝效果的影響 由圖7可知，當(dāng)攪拌強(qiáng)度在80r/min左右時(shí)，絮凝效果最佳，發(fā)酵液OD600接近0.5，菌體去除率達(dá)到95%左右。當(dāng)攪拌強(qiáng)度較低時(shí)，有礙于絮凝劑與菌體結(jié)合蛋白的接觸，不利于絮凝；當(dāng)攪拌強(qiáng)度較大時(shí)，機(jī)械剪切力增強(qiáng)，不利于大的絮凝團(tuán)的形成，而且不利于絮凝團(tuán)的沉降。

2.1.7 絮凝對谷氨酰胺收率的影響以及絮凝的去蛋白效果 在絮凝反應(yīng)前后，分別對發(fā)酵液的谷氨酰胺含量進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表1。由表1可以看出，絮凝對谷氨酰胺的影響甚小，發(fā)酵液經(jīng)絮凝后，谷氨酰胺的收率可達(dá)到97%左右；同時(shí)，絮凝去蛋白效果不明顯，殼聚糖作為絮凝劑處理谷氨酰胺發(fā)酵液時(shí)，不能起到去蛋白的作用。

2.2 活性炭脫色實(shí)驗(yàn) 絮凝離心后取上清液進(jìn)行脫色，脫色效果和活性炭對谷氨酰胺收率的影響見表2。由表2可知，GH-15活性炭脫色效果明顯，脫色率超過75%，且對谷氨酰胺的收率影響小。

2.3 超濾實(shí)驗(yàn) 選擇3種中空纖維濾柱（A、B、C），其截留分子量分別為30 000、10 000和6 000。在超濾前后，分別對發(fā)酵液的OD390值和蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)酵液經(jīng)超濾后，脫色和去蛋白效果明顯，蛋白質(zhì)去除率達(dá)60%～80%，脫色率進(jìn)一步提高，經(jīng)過活性炭吸附和超濾后，總的脫色率達(dá)85%；A、B、C相比較，C膜由于孔徑小，脫色率和去蛋白率比A膜和B膜高，但增幅效果不明顯，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，最好使用截留分子量稍大的濾膜。

3 結(jié)論

（1）殼聚糖用作谷氨酰胺發(fā)酵液菌體去除絮凝劑，絮凝效果較好，而且殼聚糖絮凝時(shí)幾乎不影響谷氨酰胺的收率。

（2）絮凝的最佳條件：殼聚糖濃度為250mg/L，殼聚糖和海藻酸鈉濃度為1∶3，pH控制在5左右，溫度在25℃左右，攪拌強(qiáng)度為80r/min，絮凝時(shí)間以15min為宜。

（3）GH-15活性炭對谷氨酰胺發(fā)酵脫色明顯，脫色率達(dá)到75%，對谷氨酰胺幾乎不造成損失。

（4）超濾去蛋白效果明顯，去蛋白率達(dá)到60%～80%，而且對于脫色有一定的增益作用。

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（責(zé)編：張宏民）