N/P比對(duì)煙草黑脛病菌生長(zhǎng)的影響研究

陳方旭　黃保宏　高正良等

摘 要：煙草黑脛病是煙草上的毀滅性病害，主要通過(guò)帶菌土壤和病殘?bào)w進(jìn)行傳染。該文通過(guò)研究不同N/P比與煙草黑脛病菌生長(zhǎng)的關(guān)系，找出病菌生長(zhǎng)的最適氮磷比例。試驗(yàn)以硝酸鈉為氮源，以磷酸二氫鉀為磷源，最終得出黑脛病病菌生長(zhǎng)的最適氮磷比為3∶2，若氮肥量過(guò)多高出磷肥，病菌生長(zhǎng)速率也很快，單施鉀肥使病菌生長(zhǎng)速率減慢。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)避免加重病害發(fā)生的施肥比例，以控制病害的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：煙草；黑脛病病菌；生長(zhǎng)；氮磷比

中圖分類(lèi)號(hào) S43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）06-79-04

煙草黑脛病（Phytophora nicotiana Breda deHaan）是煙草上主要的毀滅性病害之一，最早是1896年由van Breda de Haan發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇[1]，從苗期到成株期均可發(fā)病，發(fā)病率高，分布范圍廣，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。人們?cè)鴩L試用農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等多種方法控制該病害的危害，但由于該病菌的游動(dòng)孢子形成速度快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可以發(fā)生多次再侵染，有時(shí)還與其他病害混合發(fā)生，因而始終無(wú)法獲得理想的防治效果。煙草對(duì)于農(nóng)藥殘留、病原菌耐藥性以及在質(zhì)量有特殊的要求[2]，因此，在煙草及煙草制品逐漸向無(wú)公害方向發(fā)展的趨勢(shì)下，有必要從多角度探討控制煙草黑脛病的最佳途徑，以尋找新的防治方法。

N、P是微生物及煙草生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，只有確定合理的N、P施肥比例，才能產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)煙草，同時(shí)又不人為地加重病害發(fā)生程度。為此，筆者以生態(tài)防治為指導(dǎo)思想，從施肥的角度，研究不同N/P比對(duì)煙草黑脛病菌生長(zhǎng)速率、形態(tài)等方面的影響，找出最適于病菌生長(zhǎng)的N/P比，從而指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)中合理施肥，并以此來(lái)控制煙草黑脛病病害的發(fā)生，以減輕煙草種植過(guò)程中的損失，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器 顯微鏡、全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌箱（YXQ-LS-SⅡ）、立式循環(huán)通風(fēng)干燥箱（101A-2C）、智能人工氣候箱（RXZ 106L-A光照度3000）、潔凈工作臺(tái)（SW-OJ-2F）、分析天平等。

1.1.2 器具 培養(yǎng)皿、1mL注射器、接種餅、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、棉花、紗布、棉線、酒精燈、接種環(huán)、接種針等。

1.1.3 藥品 硝酸鈉、磷酸二氫鉀、升汞溶液、酒精、蒸餾水、無(wú)菌水、葡萄糖、馬鈴薯、瓊脂等，試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 菌種 采集鳳陽(yáng)煙草所煙田中典型煙草黑脛病株進(jìn)行分離純化得到煙草黑脛病菌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)方法 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)二因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法[3]。

1.2.2 有效含量及各處理設(shè)計(jì) 根據(jù)大田實(shí)際情況施肥量5～20kg/667m2[4]以及培養(yǎng)皿面積為0.063 585m2（培養(yǎng)皿半徑為4.5cm），試驗(yàn)設(shè)計(jì)以有效含量為0.15g/皿為標(biāo)準(zhǔn)。由于硝酸鈉有效含氮量為16.47%，磷酸二氫鉀有效含磷量為22.19%，因此有效氮0.910 7g（硝酸鈉）=有效磷0.658 7g（磷酸二氫鉀）。根據(jù)前期預(yù)備試驗(yàn)，不斷細(xì)化配比，處理Ⅰ、Ⅱ加入單純氮源和單純磷源以探索單一施肥對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響，并與氮磷配合施肥作比較；中間（處理Ⅲ～Ⅶ）共5個(gè)處理按等比數(shù)列分別設(shè)置N/P比為6∶1、3∶1、3∶2、3∶4、3∶8，探索最適病菌生長(zhǎng)比例，最后一個(gè)處理設(shè)為空白對(duì)照，共8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理質(zhì)量設(shè)計(jì)如下：（1）保證天平所造成的測(cè)量誤差≤±0.1%；（2）因PDA易凝固，所以將試劑制成試液，各組處理試劑均用10mL無(wú)菌水水稀釋，且均加入10mL培養(yǎng)基，使得實(shí)際配置藥液稀釋2倍；因此，試劑質(zhì)量依有效含量質(zhì)量的2倍（即0.30g/皿）來(lái)設(shè)計(jì)稱量質(zhì)量。8個(gè)處理試劑質(zhì)量如下：Ⅰ：1.821 4g硝酸鈉；Ⅱ∶1.3162g磷酸二氫鉀；Ⅲ∶硝酸鈉（1.561 2g）∶磷酸二氫鉀（0.188 0g）=6∶1；Ⅳ：硝酸鈉（1.366 0g）∶磷酸二氫鉀（0.329 0g）=3∶1；Ⅴ：硝酸鈉（1.092 8g）∶磷酸二氫鉀（0.536 4g）=3∶2；Ⅵ：硝酸鈉（1.040 8g）∶磷酸二氫鉀（0.752 0g）=3∶4；Ⅶ：硝酸鈉（0.496 8g）∶磷酸二氫鉀（0.957 2g）=3∶8；Ⅷ：空白對(duì)照（ck）。

1.2.3 菌種、接種方法及培養(yǎng)環(huán)境 （1）菌種：由大田采黑脛病植株，依據(jù)其病原形態(tài)[5]，分離出病菌，并連續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)顯微鏡觀察符合黑脛病病菌病原形態(tài)后，利用柯赫式法則檢驗(yàn)，最后得純種。（2）采用直徑為0.5cm的接種餅接大小一致的菌餅置于培養(yǎng)基中央。（3）培養(yǎng)基：由于煙草黑脛病為真菌（疫霉屬）病害，因此采用PDA培養(yǎng)基。在將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿之前，每皿注入3mL試液，而后倒入培養(yǎng)基，及時(shí)混勻，即成為試驗(yàn)所需培養(yǎng)基。（4）培養(yǎng)環(huán)境：由于煙草疫霉菌喜高溫、喜高濕，菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28～32℃，孢子囊產(chǎn)生最適溫度為24～28℃，游動(dòng)孢子活動(dòng)和發(fā)芽的最適溫度為20℃，孢子囊在空氣相對(duì)濕度97%～100%時(shí)生長(zhǎng)最快，光有抑制孢子囊發(fā)芽的作用[6-8]。綜合以上所有因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件為溫度：30℃；濕度：98%；光暗交替：每12h。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目及測(cè)定方法 （1）顯微鏡鑒定純菌種，并運(yùn)用柯赫式法則鑒定；（2）十字交叉法測(cè)定每個(gè)處理的生長(zhǎng)直徑，每24h測(cè)定一次；（3）目測(cè)菌絲生長(zhǎng)形態(tài)：疏密程度，氣生菌絲生長(zhǎng)情況，菌絲厚薄。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 黑脛病菌種鑒定 由于試驗(yàn)病菌從黑脛病病株上分離純化而得，因此需鑒定病菌。首先依據(jù)煙草黑脛病的病原為卵菌門(mén)疫霉屬，氣生菌絲較細(xì)，無(wú)色透明，無(wú)隔膜，孢子囊頂生或側(cè)生，梨形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起。適宜條件下，可產(chǎn)生3～30個(gè)游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子無(wú)色，側(cè)生兩根不等長(zhǎng)鞭毛[3，9-10]。將所產(chǎn)生孢子挑出（少量），置于載玻片，于顯微鏡下觀察，找出符合病菌生理形態(tài)的菌種。然后將顯微鏡鑒定的菌種培養(yǎng)純種，種植健康煙草，運(yùn)用柯赫式法則回接，依據(jù)其癥狀表現(xiàn)，即莖基部受害后出現(xiàn)黑斑，并環(huán)繞全莖向上部延伸，有時(shí)病斑可達(dá)病株高度的1/3～1/2，病株葉片自下向上依次變黃。由此癥狀證實(shí)試驗(yàn)所用菌種為黑脛病病菌。

1.3.2.2 生長(zhǎng)半徑 依據(jù)十字交叉法[11]測(cè)得直徑為d1、d2，則r=（d1+d2）/2，由于每一個(gè)處理有3組重復(fù)（r1、r2、r3），最后半徑取三者平均數(shù)，即r=（r1+r2+r3）/3即得試驗(yàn)所需半徑。

1.3.2.3 生長(zhǎng)速率 生長(zhǎng)半徑每24h記錄一次，記錄時(shí)均減去菌餅直徑0.5cm，設(shè)第1天記錄的半徑為R1，第2天為R2，第3天為R3，因此第一個(gè)24h生長(zhǎng)速率V1=（R2-R1）/24，第二個(gè)24h生長(zhǎng)速率為V2=（R3-R2）/24。

1.3.2.4 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、方差分析及多重比較法，并找出菌絲密集，且孢子較多等生理形態(tài)，找出最適病菌生長(zhǎng)的N/P比。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原及形態(tài) 黑脛病病菌氣生菌絲較細(xì)，無(wú)色透明，無(wú)隔膜，孢子囊頂生或側(cè)生，梨形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起。適宜條件下，可產(chǎn)生3～30個(gè)游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子無(wú)色，側(cè)生兩根不等長(zhǎng)鞭毛，在水中游動(dòng)，遇寄主時(shí)失去鞭毛，產(chǎn)生牙狀管侵入植株，條件不適宜時(shí)，孢子囊也能直接萌發(fā)出芽管侵入。

2.2 不同N/P比對(duì)煙草黑脛病病菌生長(zhǎng)速率的影響

2.2.1 不同處理的煙草黑脛病病菌生長(zhǎng)情況 由表1可以看出，處理Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ菌絲生長(zhǎng)較密，且菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度較長(zhǎng)，菌落形態(tài)較厚，處理Ⅱ、Ⅶ菌絲較疏松，菌落形態(tài)薄，菌絲長(zhǎng)度較短，依據(jù)形態(tài)及生長(zhǎng)所需時(shí)間，預(yù)估處理Ⅴ為候選最適煙草黑脛病病菌生長(zhǎng)的氮磷比。

由圖1可以看出，8個(gè)處理中：（1）加單純P和N中，處理Ⅱ（1.316 2g磷酸二氫鉀）即加入單純的磷源，生長(zhǎng)最慢，同時(shí)也比空白生長(zhǎng)慢，長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿所需時(shí)間比空白及其他處理的時(shí)間長(zhǎng)，由此可見(jiàn)單純施磷肥不會(huì)增加病害發(fā)生率；單純給予氮營(yíng)養(yǎng)時(shí)，病菌生長(zhǎng)僅比空白慢，較其他處理生長(zhǎng)快，由此可見(jiàn)氮肥應(yīng)與其他肥料配合施用，單獨(dú)施肥會(huì)增加病害發(fā)生幾率。（2）在N/P二者比例中，處理Ⅴ（N/P=1.5∶1）生長(zhǎng)半徑以及生長(zhǎng)形態(tài)較其他處理均為最快，且比空白生長(zhǎng)快，初步估計(jì)若按此比例施肥會(huì)增加病害發(fā)生幾率；處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ生長(zhǎng)情況相似，且均比較空白生長(zhǎng)慢，預(yù)估生產(chǎn)中與這些處理類(lèi)似的比例施肥會(huì)減少病害發(fā)生幾率。（3）各處理生長(zhǎng)形態(tài)經(jīng)比較，可知當(dāng)N/P比例中，磷多得多時(shí)菌絲疏松且孢子很少甚至沒(méi)有，而氮多得多時(shí)，菌絲普遍比較密集，基本上均產(chǎn)孢。

2.2.2 不同處理的煙草黑脛病病菌平均生長(zhǎng)速率 由圖2可知，各處理生長(zhǎng)速率由慢至快為：Ⅱ<Ⅵ<Ⅳ<Ⅶ<Ⅷ<Ⅲ<Ⅰ<Ⅴ，即當(dāng)?shù)追逝浜鲜┯脮r(shí)，處理Ⅵ（3∶4）生長(zhǎng)速率較慢，處理Ⅴ生長(zhǎng)速率最快；結(jié)合2.2.1分析，可知煙草黑脛病病菌在高氮低磷情況下生長(zhǎng)速率相當(dāng)快，且菌絲密集，產(chǎn)孢多且快，如處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ結(jié)合生長(zhǎng)形態(tài)綜合判定使病菌生長(zhǎng)最慢比例；當(dāng)N/P比相差不大或者高磷低氮時(shí)，黑脛病病菌生長(zhǎng)速率較慢，且菌絲均較短，疏松而產(chǎn)孢少。因此，施肥中氮肥的施肥量一定要把握準(zhǔn)確，以免增加病害的發(fā)生幾率。

3 結(jié)論與討論

3.1 煙草黑脛病病菌最適氮磷比測(cè)定結(jié)果

3.1.1 單一施肥 煙草黑脛病病菌在單純以磷酸二氫鉀為磷源的的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最慢，長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿所需時(shí)間最長(zhǎng)，且當(dāng)其他處理長(zhǎng)滿時(shí)仍未產(chǎn)孢，與其他處理呈顯著性差異，但生產(chǎn)中往往不會(huì)單施鉀肥，若需要單施鉀肥，應(yīng)按處理Ⅱ以計(jì)算每667m2施鉀肥量；而在以單純的硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率僅次于空白和處理Ⅴ，因此在煙草種植過(guò)程中，單施硝酸鈉等氮肥時(shí)，病害發(fā)生可能性較大。

3.1.2 最適氮磷比得測(cè)定 由于實(shí)際施肥中是氮、磷肥配合施用，因此重點(diǎn)在于氮磷配比。綜合分析可知，處理Ⅴ，即N∶P=3∶2，為最適病原菌生長(zhǎng)比例，若按此比例施肥，發(fā)生病害可能性較大，因此應(yīng)避免此種施肥比例。

3.1.3 生產(chǎn)中適宜施肥配比 通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析可知，處理Ⅳ（3∶1）、Ⅵ（3∶4）、Ⅶ（3∶8）是較單純施磷源生長(zhǎng)較慢的幾個(gè)配比，結(jié)合圖1生長(zhǎng)形態(tài)處理Ⅳ、Ⅵ菌絲生長(zhǎng)較處理Ⅶ密集，處理Ⅵ較處理Ⅳ、Ⅶ菌絲長(zhǎng)，處理Ⅳ、Ⅵ較處理Ⅶ孢子量多，因此，實(shí)際生產(chǎn)中氮磷配比按照與此3個(gè)處理接近比例，均可有效的通過(guò)合理施肥減小病害發(fā)生幾率。在實(shí)際施肥中，應(yīng)遵循低氮的原則，少施氮肥，合理施肥，同時(shí)配合間作栽培模式，采取“預(yù)防為主，防治結(jié)合，綜合防治”的總體策略，通過(guò)加強(qiáng)栽培管理措施，以盡可能減輕煙草黑脛病病害的發(fā)生程度。

3.2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定的不足之處 試驗(yàn)只選擇了硝酸鈉、磷酸二氫鉀2種藥物作為試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)肥來(lái)假設(shè)現(xiàn)實(shí)中的氮、磷肥，且選擇的施用量依南方地區(qū)施肥量而定，并不包含病菌生長(zhǎng)所需的所有氮、磷源，由于目前較少有文獻(xiàn)通過(guò)研究N/P比對(duì)煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)狀況來(lái)指導(dǎo)施肥，控制病害發(fā)生，所以N/P比例設(shè)計(jì)不全面，因而結(jié)果有一定的局限性。

3.3 實(shí)驗(yàn)的實(shí)際意義 研究表明，煙草黑脛病發(fā)生動(dòng)態(tài)與連作狀況、寄主的抗感性及氣象因素呈一定的相關(guān)性。當(dāng)前，較多文獻(xiàn)在栽培措施方面進(jìn)行了大量的研究，對(duì)控制黑脛病的發(fā)生起到了很好的效果，但對(duì)施肥比例研究較少。由于目前仍然多采用藥劑防治，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑，不但會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，而且會(huì)導(dǎo)致品種的抗病性逐年下降。因此，本試驗(yàn)從栽培時(shí)施肥角度，研究不同N/P比與煙草黑脛病菌生長(zhǎng)的關(guān)系，找出使病菌生長(zhǎng)最快的N/P比以及使病菌發(fā)展較慢的N/P比，從而在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)合理施肥起到一定的指導(dǎo)作用，適當(dāng)控制病害的發(fā)生。在今后的工作中，首先，應(yīng)建立以烤煙為主的輪作制度，尤其是水旱輪作，以減少病原物和侵染源；其次，在栽培耕作時(shí)應(yīng)按照適當(dāng)比例施肥，將病害發(fā)生的可能性降至最低；第三，采用無(wú)公害的植物抗逆誘導(dǎo)劑來(lái)提高植物抗性，使易感病的優(yōu)質(zhì)品種轉(zhuǎn)變?yōu)榭共∑贩N；最后，選用少量低毒高效、無(wú)殘留的農(nóng)藥殺死和抑制病原菌。通過(guò)以上措施，可以減少煙葉的農(nóng)藥殘留量，生產(chǎn)出無(wú)公害煙葉[12]。

參考文獻(xiàn)

[1]van Breda de Haan.De Bibitziekte in de deli-tabakveroorzaakt door Phytophthora nicotianae Mded[J].Slands Plentuim，1896，15.

[2]蔡勇，肖啟明，杜桂萍.煙草黑脛病生物防治研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（11）：5708-5710， 5743.

[3]蓋鈞益.試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：22-23，104-108.

[4]郝靜.煙草施肥技術(shù)[M].北京：金盾出版社，2008.

[5]王志愿，姜清治，霍沁建.煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（21）：250-255.

[6]賴傳雅.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)：南方本[M].北京：科學(xué)出版社，2003：157-161.

[7]馬國(guó)勝，高智謀，陳娟.煙草黑脛病菌研究進(jìn)展[J].煙草科技，2003（4）：35-42.

[8]北京農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所.中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害：下冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：575-580.

[9]許志剛.普通植物病理學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：359-362。

[10]陳利鋒，徐敬友.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：267-269.

[11]方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：46-49，110-156，398-414.

[12]魏開(kāi)云，張秀珍.煙草黑脛病的發(fā)生及綜合防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)村科技，2010，24. （責(zé)編：張宏民）