魟魚軟骨多糖滴眼液在家兔眼內(nèi)的藥代動力學研究

李明月，郭 斌，曹見敏

1遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121000；2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000

郭斌等[1]首次從魟魚軟骨中得到兩個單一糖胺聚糖RCGⅠ和RCGⅡ。魟魚軟骨多糖(Ray cartilage glycosaminoglycans，RCG)具有抗腫瘤、可抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生長、增強免疫力的作用[2]；體外試驗表明，RCG可抑制膠原酶對膠原蛋白的水解[3]、抑制內(nèi)皮細胞的增殖、防治角膜新生血管[4]。其滴眼液為角膜新生血管等病癥提供了新的解決方案[5]。本實驗通過紫外-可見光分光光度計檢測家兔眼部使用魟魚軟骨多糖滴眼液后角膜、虹膜、玻璃體及房水的藥物濃度，并進一步對兔眼內(nèi)藥物的藥代動力學進行研究，在今后的臨床用藥等方面具有一定的應(yīng)用價值。

材料和方法

1 試劑與儀器 魟魚軟骨多糖(錦州海洋藥業(yè)研究開發(fā)中心研制，純度99.9%，批號：080901)，魟魚軟骨多糖滴眼液(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院制劑室制備，濃度為50.03 mg/ml，批號：080301)葡萄糖醛酸標準品(Alfa公司，批號：L2271112)0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司，批號：Q1309019)，20%烏拉坦溶液，由遼寧醫(yī)學院藥理教研室提供。UV 255紫外-可見分光光度計(日本島津)，F(xiàn)C 204型電子分析天平(上海市精科天平)，旋混合器(碧云天生物技術(shù)研究所)。

2 實驗動物 健康家兔20只(遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證lnyxy20140507)，體質(zhì)量2.2 ～2.7 kg，雌雄各半。實驗前1 d，將家兔左右眼分別進行簡單的眼部檢查，檢查指標包括是否有眼睛刺激性癥狀，觀察兔眼內(nèi)結(jié)膜顏色及是否有損傷、不完整等，如有以上情況排除。

3 給藥及樣品采集 將家兔隨機分成10組，每組2只，用拇指和示指將家兔眼瞼捏拉成漏斗狀，用中指壓住鼻淚管在家兔左右兩眼內(nèi)分別使用微量取樣器滴入魟魚軟骨多糖滴眼液200μl，滴入藥后輕揉眼瞼15 s。滴眼后于10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，用10 ml的0.9%氯化鈉注射液沖洗兔眼，用紙吸干眼表水分，在角膜緣處吸取房水，迅速取出眼球，固定眼球位置后用滅菌注射器在角膜后緣2 ～3 mm處刺進玻璃體腔，收集膠黏膠液體狀的玻璃體，再分離出角膜、虹膜，每個時間點取4只眼，準確稱重后將所有樣品置于-20℃冰箱中冷凍保存[6-8]。4 兔眼房水及玻璃體處理 分別取含藥房水200μl和玻璃體200μl于EP管中并加入500μl飽和硼酸溶液，渦旋震蕩1 min充分混合，沉淀蛋白質(zhì)及雜質(zhì)，以10 000 r/min離心15 min，精確量取上清液200μl待測，計算兔眼房水及玻璃體中魟魚軟骨多糖的藥物濃度。

5 兔眼固體樣本處理 將兔角膜與虹膜，分別剪成約1 mm3小塊后分別倒入勻漿器中充分勻漿后，分別取200μl，并于EP管中與500μl飽和硼酸溶液混合后渦旋震蕩5 min，在10 000 r/min條件下離心20 min后精確取出上清液200μl，用來測定兔眼角膜與虹膜中魟魚軟骨多糖的藥物濃度。

6 兔眼內(nèi)各組織濃度的測定 1)對照品儲備液的制備：分別精確稱量0.099 1 g、0.107 4 g、0.101 5 g、 0.100 3 g烘干恒重后的葡萄糖醛酸，分別置于50 ml容量瓶中，加入飽和的硼酸溶液使溶解定容至刻度并搖勻，并在該容量瓶中量取2 ml溶液，與飽和的硼酸溶液在另一50 ml容量瓶混勻定容至刻度，搖勻，再精確稱量0.2 ml溶液分別加至0.2 ml已去好蛋白的空白角膜、虹膜、玻璃體及房水溶液中，渦旋1 ～ 2 min并搖至均勻，所得40.12 μg/ ml、42.96 μg/ml、40.60 μg/ml、39.62 μg/ml分別為含葡萄糖的角膜樣品、虹膜樣品、玻璃體樣品以及含葡萄糖房水樣品，作為對照品儲備液。2)樣品溶液的制備：將處理后的兔眼角膜、虹膜、玻璃體以及房水的0.1 ml溶液加至10 ml具塞試管放置在冰鹽浴中，使其冷卻，緩慢滴加四硼酸鈉硫酸溶液5.0 ml，期間不停地用玻璃棒攪拌，攪拌均勻后保持瓶塞密閉，在水浴鍋內(nèi)以90℃加熱20 min，迅速冷卻后，加0.2%咔唑乙醇溶液0.2 ml并混勻，處理后的混合溶液放在沸水浴中，并在加熱20 min后將其冷卻至室溫。將經(jīng)過以上處理后的樣品置于波長為529 nm處采用紫外-可見光分光光度法分別測定角膜、虹膜、玻璃體及房水中樣品的吸收度A值[9]。3)標準曲線和線性范圍：配制濃度為1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ ml、5 μg/ml的葡萄糖醛酸(房水或玻璃體)溶液于10 ml具塞試管中，另配制葡萄糖醛酸角膜溶液的濃度為1.5 μg/ml、7.5 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml，葡萄糖醛酸虹膜溶液的濃度為0.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml，后續(xù)方法同上述操作測定樣品吸光度A值，繪制標準曲線并確定線性范圍。4)精密度實驗：配置不同濃度的含藥房水、玻璃體、角膜、虹膜溶液，每個樣品濃度重復(fù)測定5次得到日內(nèi)精密度，-20℃冰箱內(nèi)將樣品密封保存以待測定日間精密度，每個樣品連續(xù)5 d進行重復(fù)測定，所有樣品測定3次即得到日間精密度。5)加樣回收率實驗：精密稱取已知準確濃度的魟魚軟骨多糖加至去蛋白角膜、虹膜、玻璃體及已去蛋白的房水試液中，后續(xù)方法同上述操作測定吸收度A值?；厥章?檢出量/加入量。

結(jié) 果

1 魟魚軟骨多糖在角膜，虹膜，玻璃體及房水中的濃度變化 家兔在不同時間點給藥后，兔眼內(nèi)角膜、虹膜、玻璃體及房水中的藥物濃度見表1，以時間為橫坐標，藥物在兔眼內(nèi)的濃度為縱坐標，通過軟件繪制出魟魚多糖滴眼液在兔眼內(nèi)角膜、虹膜、玻璃體及房水中代謝的藥物濃度-時間曲線(圖1)并擬和出藥代動力學參數(shù)(表2)，符合二室模型。

2 標準曲線和線性范圍 以葡萄糖醛酸濃度為橫坐標，以其相應(yīng)的吸收度為縱坐標，繪制標準曲線，經(jīng)回歸處理，其回歸方程（角膜、虹膜、玻璃體、房水）分別為Y= 0.029 1x+0.349 3，r2=0.999 5、Y=0.036x+0.223 71，r2=0.999 2、Y=0.033x+0.284 4，r2=0.999 1、Y=0.039 6x+0.253 7，r2=0.999 6。結(jié)果表明，兔眼角膜、虹膜、玻璃體及房水中葡萄糖醛酸分別在1.5 ～ 30 μg/ml、0.5 ～ 20 μg/ml、1.0 ～5.0 μg/ml、0.5 ～ 1.5 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表3。

3 精密度實驗 《中國藥典》(2010版)規(guī)定，日內(nèi)精密度與日間精密度＜5%，魟魚軟骨多糖在角膜、虹膜、玻璃體及房水中的平均日內(nèi)精密度分別是1.73%、1.46%、1.46%、1.28%，平均日間精密度分別是1.57%、2.16%、1.60%、2.16% 。結(jié)果見表4、表5。

圖1 魟魚軟骨多糖滴入眼內(nèi)后在兔眼中的藥物濃度-時間曲線Fig. 1 Concentrations of RGC eye drops in rabbit eyes

表1 魟魚軟骨多糖滴眼液滴眼后角膜、虹膜、玻璃體及房水中藥物濃度變化Tab. 1 Drug concentration in cornea, iris, vitreous and aqueous humor after RCG eye drops

4 方法回收率試驗 《中國藥典》(2010版)規(guī)定回收率＞90%，RSD值＜5%，魟魚軟骨多糖在角膜、虹膜、玻璃體及房水中的平均回收率分別是97.93%、96.4%、96.3%、96.98%。結(jié)果見表6、表7。

討 論

魟魚軟骨多糖是魟魚軟骨經(jīng)鹽酸胍提取，膜超濾、丙酮分級沉淀、三氯乙酸沉淀、Sephadex凝膠柱層析分離純化獲得的，分子量為9.7×104，純度為99%以上。目前，我國在魟魚生理活性物質(zhì)的研究和分離提取抗腫瘤活性成分方面已經(jīng)取得了一定成就[10]，國內(nèi)一些文獻也研究魟魚軟骨多糖滴眼液抗角膜新生血管的形成[11]；國外在抗腫瘤方面進行了探索，1983年，Lee和Langer[12]首先發(fā)表鯊魚軟骨含抗腫瘤血管增生成分的相關(guān)研究，其他成分也有所研究[13]，但是魟魚軟骨多糖滴眼液在眼部，包括角膜、虹膜、玻璃體、房水中的藥代動力學目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)研究。筆者以此為基礎(chǔ)通過紫外-可見分光光度計法，對給予魟魚軟骨多糖滴眼液后家兔的兔眼內(nèi)角膜、虹膜、玻璃體及房水在不同時間點的魟魚軟骨多糖藥物濃度進行測定，并進一步對家兔兔眼內(nèi)藥代動力學進行研究。由于紫外可見分光光度計在時間上的耗費遠遠低于高效液相色譜儀，突出性地縮短了時間、降低了實驗成本并增加了效率，避免了實驗中帶來的誤差和失誤。選擇家兔為眼用制劑研究對象主要因為兔和人眼結(jié)構(gòu)特點相似[14]，而在實驗中角膜、虹膜、房水及玻璃體可以相對準確地反映兔眼內(nèi)藥物濃度的變化，且比較準確，減少了實驗的誤差[15-17]。本實驗基于魟魚軟骨多糖具有顯著抗角膜新生血管形成作用的論點并在劑型上選擇使用滴眼液制劑，不僅可以延長藥效，還可以提高藥物的生物利用度。1990年，Takigawa等從人克隆軟骨細胞株HCS-2/8細胞獲得了一種多肽因子，此因子能對抗血管新生，還具有抗腫瘤的活性。本實驗選擇作為海洋生物的魟魚，其軟骨多糖在臨床應(yīng)用上應(yīng)用廣泛，并為今后的臨床研究以及魟魚軟骨多糖眼用納米乳的藥代動力學及藥效學的研究提供了參考。

為使實驗結(jié)果更加具說服性，筆者選用了眼內(nèi)不同部分的藥代動力學進行分析，采用紫外-可見分光光度計對空白組織液中的標準品進行方法學的研究分析，以保證實驗的精確性及穩(wěn)定性。在實驗組中，滴眼液滴眼后，角膜內(nèi)在9.81 min左右達到最高濃度29.03±0.38μg/L，而后在58.53 min開始依次到達虹膜、房水、玻璃體，并

且其最高濃度也依次下降，說明滴眼液點眼后的瞬間，藥物滲透到角膜內(nèi)發(fā)揮作用，藥物逐漸與角膜混合，即向角膜轉(zhuǎn)運，進而逐步到達虹膜，保證了藥物的平衡。實驗表明，虹膜中的藥物于58.53±0.54 min達到峰濃度，為16.83±0.12μg/L。隨時間進行10 min后，可看到角膜中的藥物濃度下降的過程，吸收入角膜的藥物轉(zhuǎn)運如房水，房水中的藥物又通過房水循環(huán)從而排出，這是藥物吸收和藥物消除的過程。由于房水是充滿了眼前房和后房的一種循環(huán)液體，浸浴著周邊組織，通過它將藥物轉(zhuǎn)運到玻璃體，以致藥物最終達玻璃體內(nèi)的含量極少，導(dǎo)致藥物在玻璃體內(nèi)的濃度非常低，且波動不大，峰濃度僅為1.51±0.43μg/L。由于藥物最終達玻璃體內(nèi)的含量有限，導(dǎo)致藥物在玻璃體內(nèi)的濃度非常低。通過實驗表明，在臨床上如需使用魟魚軟骨多糖滴眼液治療玻璃體內(nèi)病癥，可考慮通過玻璃體腔內(nèi)注射或提高藥物用量來增加玻璃體內(nèi)的濃度，進而提高藥物的藥效。若使藥物滲透到后面組織部位，研究者也可以在眼用劑型上有所改變，例如魟魚軟骨多糖眼用納米乳的納米乳劑型，也可以在滴眼液中添加少許增加滲透度的添加劑[18]，但國內(nèi)外至今在魟魚軟骨多糖滴眼液方面的研究非常少，還需要一些新型的材料劑型在眼科滴眼液中的應(yīng)用更廣泛以便今后研究[19-21]。

表2 兔眼滴入魟魚軟骨多糖滴眼液100μl后在角膜、虹膜、房水及玻璃體中的藥代動力學參數(shù)Tab. 2 Pharmacokinetic parameters of RGC eye drops in cornea, iris, aqueous humor and vitreous after ocular administration of 100μl eye drops

表3 葡萄糖醛酸濃度各點的吸收度Tab. 3 Absorption value (A) of glucuronide concentration in each standard

表4 魟魚軟骨多糖在角膜與虹膜中的精密度Tab. 4 Precision of RCG in cornea and iris

表5 魟魚軟骨多糖在玻璃體與房水中精密度Tab. 5 Precision of RCG in vitreous and aqueous humor

表6 魟魚軟骨多糖在角膜與虹膜中的回收率Tab. 6 Recovery rate of RCG in cornea and iris (-x±s, n=5)

表7 魟魚軟骨多糖在玻璃體與房水的回收率Tab. 7 Recovery rate of RCG in vitreous and aqueous humor (-x±s, n=5)

1 郭斌，韓冠英，李智.魟魚軟骨多糖的分離純化及生物活性的研究［J］.中草藥，2006，37（8）：1210-1214.

2 王富喜，郭斌.魟魚軟骨多糖的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（6）：2979-2980.

3 王洪建，郭斌.魟魚軟骨多糖的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011（8）：4734-4735.

4 郭斌，李兵，韓冠英，等.應(yīng)用魟魚軟骨多糖滴眼液抗大鼠角膜新生血管形成的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：298-300.

5 朱丹.魟魚軟骨多糖的研究［D］.沈陽：遼寧中醫(yī)學院，2004.

6 于佳，范青.中藥靶向制劑的研究進展［J］.沈陽藥科大學學報，2009，26（S1）：71-75.

7 馬守偉，甘勇，甘莉，等.新型眼用陽離子微乳-原位凝膠的制備及其體外角膜滯留特性的研究［J］.藥學學報，2008，43（7）：749-755.

8 孫考祥，彭紹民，孫大衛(wèi)，等.雙氯酚酸鈉滴眼液的眼內(nèi)組織分布及藥代動力學［J］.中國臨床藥理學雜志，2001，17（2）：118-120.

9 曹見敏，張蕾，郭斌.魟魚軟骨多糖眼用納米乳的質(zhì)量評價［J］.山東大學學報：醫(yī)學版，2010，48（5）：157-160.

10 孟康， 郭斌， 王冠. 計數(shù)觀察魚軟骨多糖對小鼠黑色素瘤中血管生成擬態(tài)的時空變化及對CD31的影響［J］. 中國藥理學通報，2013， 29（1）： 143-145.

11 郭斌， 李兵， 韓冠英， 等. 應(yīng)用魟魚軟骨多糖滴眼液抗大鼠角膜新生血管形成的實驗研究［J］. 遼寧中醫(yī)雜志， 2008， 35（2）：298-300.

12 Lee A， Langer R. Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis［J］. Science， 1983， 221（4616）： 1185-1187.

13 Bruce WH. Poisonous and venomous marine animals of the world［M］. Washington DC： U.S.Govt Print Office， 1970： 132.

14 劉冰，徐曉文，林宏達，等.鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中藥物濃度測定及藥動學研究［J］.藥學與臨床研究，2014，22（3）：201-204.

15 王適，何群.眼用制劑藥動學研究實驗方法概述［J］.中國藥房，2009，20（4）：302-304.

16 沈雁，涂家生，陸洋，等.HPLC法測定更昔洛韋在家兔房水內(nèi)的濃度及其市售滴眼液的藥動學研究［J］.藥學與臨床研究，2007，15（2）：100-104.

17 韓培，李娟.加替沙星原位凝膠的體外釋放及兔眼房水藥動學研究［J］.藥學與臨床研究，2012，20（4）：293-296.

18 王海山， 張俊杰. 硝酸益康唑納米粒滴眼液在兔眼內(nèi)藥代動力學研究［J］. 中國實用眼科雜志， 2014， 32（4）： 507-511.

19 張倩瑤，李永吉，王向濤.樹枝狀聚合物在靶向給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用［J］.中國新藥與臨床雜志，2008，27（1）：47-53.

20 肖娟，陸華中，鄒萍.樹枝狀聚合物在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用進展［J］.中國生物工程雜志，2002，22（4）：6-11.

21 Vandamme TF， Brobeck L. Poly（amidoamine） dendrimers as ophthalmic vehicles for ocular delivery of pilocarpine nitrate and tropicamide［J］. J Control Release， 2005， 102（1）：23-38.