膽管上皮細(xì)胞與缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

謝 芳，羅渝昆，唐 杰

解放軍總醫(yī)院 超聲科，北京 100853

肝移植是目前治療終末期肝病的一種有效方法，在此過程中供肝需經(jīng)過切取、保存和植入3個步驟，不可避免要經(jīng)歷缺血再灌注的病理生理過程。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是一個多細(xì)胞參與、多種介質(zhì)共同作用的復(fù)雜病理過程，包括缺血引起的器官損傷以及炎癥介導(dǎo)的再灌注組織損傷，是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的重要因素，嚴(yán)重影響著術(shù)后肝功能和移植物的存活?，F(xiàn)已證實，肝內(nèi)膽管細(xì)胞對缺血再灌注損傷的反應(yīng)比肝細(xì)胞更為敏感，與再灌注密切相關(guān)[1]。膽管缺血再灌注損傷主要表現(xiàn)在膽管壁和膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cell，BEC)的損傷以及膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙，臨床上可引起膽管炎、膽道狹窄，甚至出現(xiàn)膽道缺血性壞死、膽瘺。因此，進(jìn)一步了解膽管缺血再灌注損傷的機(jī)制將有助于其防治策略的研究，減少肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。

1 膽管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷

膽管上皮細(xì)胞是一族高耗氧、高代謝、缺氧耐受能力差的細(xì)胞群體，僅占肝細(xì)胞總數(shù)的3% ～ 5%，形態(tài)和功能上都具有多樣性。線粒體是細(xì)胞的活性代謝中心，對各種損傷因子極為敏感，是最常見的用于觀察超微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器之一。在許多病理性損傷因子(缺血、缺氧)的作用下，線粒體首先受損，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)迅速耗竭，進(jìn)而損傷整個細(xì)胞的功能。因此，超微結(jié)構(gòu)的觀察是研究肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞IRI的一個重要手段。實驗表明，膽管上皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察可反映膽道組織IRI的程度[2]。缺血缺氧時，膽管上皮細(xì)胞基底膜脫落，同時中性粒細(xì)胞浸潤，線粒體腫脹、數(shù)量減少，細(xì)胞核皺縮，炎細(xì)胞浸潤。再灌注后，鈣超載與氧自由基大量生成，二者相互影響、協(xié)同作用，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷進(jìn)一步加重，微絨毛逐漸減少，甚至消失，線粒體膜結(jié)構(gòu)和骨架破壞，通透性增加，能量代謝障礙，直接造成了膽管上皮細(xì)胞的損傷。

2 膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙

膽管的動脈血供相當(dāng)復(fù)雜，隨著肝膽外科的發(fā)展，肝動脈的終末分支—膽管周圍毛細(xì)血管叢(peribiliary blood plexus，PBP)作為膽管直接的血供來源，在維持其正常生理功能中的作用越來越受到重視[3]。肝細(xì)胞接受門靜脈和肝動脈的雙重血供，血管腔較大；而膽管只接受肝動脈分支PBP的血供，管腔較細(xì)，因而在IRI時，膽管細(xì)胞受到的傷害比肝細(xì)胞更加嚴(yán)重。黃志強(qiáng)和黃曉強(qiáng)[4]通過觀察兔肝微血管鑄型掃描電鏡也證實了PBP的這種血流灌注特點，這正是肝移植術(shù)后肝動脈血流通暢但卻會發(fā)生缺血性膽管狹窄的解剖學(xué)原因。肝移植過程中，供肝冷凍保存時間過長，可直接損害肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，并破壞PBP的微循環(huán)。在原位肝移植手術(shù)過程中，膽管還要經(jīng)歷兩個階段的熱缺血損傷[5]，一是供肝切取過程中的短暫熱缺血損傷，二是門靜脈血流開放至肝動脈血流開放過程中的肝動脈缺血損傷。在此期間，肝尚有門靜脈單純血供，而膽管仍處于熱缺血狀態(tài)，因此，膽管缺血再灌注損傷更加明顯。病理實驗證實，門脈區(qū)膽管上皮細(xì)胞損傷程度與二次熱缺血時間密切相關(guān)[6]。

3 膽管上皮細(xì)胞的炎癥損傷

現(xiàn)已證實，結(jié)構(gòu)特殊的膽管也是冷、熱缺血及再灌注損傷的重要靶組織。目前認(rèn)為，缺血再灌注損傷的機(jī)制與鈣超載、氧自由基增多及炎性細(xì)胞聚集等有關(guān)。缺血期，由于組織缺氧導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，ATP耗竭及微循環(huán)障礙，膽管上皮細(xì)胞脫落，微絨毛數(shù)量減少，甚至出現(xiàn)黏膜全層水腫、壞死、纖維化形成而致狹窄。隨著再灌注時間的延長，中性粒細(xì)胞不斷聚集，組織損傷反而加劇，進(jìn)而引起一系列炎癥反應(yīng)，并且生成的氧自由基和蛋白酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞損傷放大效應(yīng)[7]。許多炎癥介質(zhì)參與了膽管IRI這一復(fù)雜的病理生理過程，如激活的枯氏細(xì)胞、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)、5-羥色胺、血小板活化因子、內(nèi)皮素、一氧化氮、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、前列腺素、趨化因子和黏附分子等。這些介質(zhì)通過自分泌、旁分泌或類似激素的方式誘導(dǎo)其自身及其他因子產(chǎn)生，形成一個細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子鏈，使膽管上皮細(xì)胞的損傷呈進(jìn)行性加重。膽管上皮細(xì)胞來源的5-羥色胺(5-HT)以及門管區(qū)成纖維細(xì)胞來源的TGF-β介導(dǎo)了BEC與成纖維細(xì)胞之間的自分泌與旁分泌效應(yīng)，以維持BEC的增殖，在膽管病發(fā)病機(jī)制中具有重要的意義[8]。此外，由于膽管上皮細(xì)胞內(nèi)缺乏抗氧化酶系，如過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽，因而較肝細(xì)胞更容易受到再灌注時氧自由基的損傷。

肝移植缺血再灌注損傷后，PBP和其內(nèi)皮細(xì)胞也廣泛參與了膽管免疫炎癥反應(yīng)的病理過程，包括血管通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、血管收縮、血細(xì)胞淤塞以及補體系統(tǒng)的激活，其中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血小板—白細(xì)胞聚合物進(jìn)一步加劇了PBP的微循環(huán)障礙。

4 膽管上皮細(xì)胞的免疫學(xué)損傷

肝是最重要的具有天然免疫功能的器官，它通過門靜脈接收并過濾其他系統(tǒng)80%的血液。再灌注損傷后，膽管上皮細(xì)胞積極參與肝內(nèi)免疫介導(dǎo)的無菌性炎癥，激活炎癥細(xì)胞；并通過自身免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)主要組織相容性抗原分子的上調(diào)或表達(dá)，完成抗原提呈過程；分泌和表達(dá)促炎性細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及黏附分子，激活天然和獲得性免疫反應(yīng)，引發(fā)移植物損傷，使膽管成為肝移植后膽道并發(fā)癥的靶器官[9]。

目前，在缺血再灌注免疫損傷中研究較多的是Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)，它是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)，也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR廣泛表達(dá)于肝的實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞，包括肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯氏細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及星狀細(xì)胞，對肝及膽道的功能起著至關(guān)重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，TLR不僅可識別外源性病原體，如疾病相關(guān)分子模式，還能夠識別機(jī)體自身產(chǎn)生的內(nèi)源性配體，即損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattems，DAMPs)，并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答[10]。DAMPs通常隱藏于細(xì)胞內(nèi)，缺血再灌注損傷后，被一些受損或死亡的細(xì)胞激活，釋放到細(xì)胞外而引起免疫反應(yīng)。也有證據(jù)表明，細(xì)胞外的DAMPs是在代謝過程中生成或釋放的，缺血再灌注損傷時，這種在分解代謝中產(chǎn)生的DAMPs既可以激活免疫反應(yīng)，也可以作為一個安全信號，抑制有害的免疫反應(yīng)，而保護(hù)組織的完整性[11-12]。最近的研究表明，TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對天然免疫及獲得性免疫均有重要的調(diào)控作用[13]。TLR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎參與了所有的肝疾病，如急性和慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝缺血再灌注損傷、肝再生和肝細(xì)胞癌。TLR被配體識別后，激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B、促分裂原活化蛋白激酶以及Ⅰ型干擾素信號通路，分泌促炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-6、IL-1β)和化學(xué)趨化因子，從而調(diào)節(jié)機(jī)體輔助性T細(xì)胞的平衡[9]。

枯氏細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞及NK/ NKT細(xì)胞也都參與了缺血再灌注損傷引起的免疫反應(yīng)。目前，T細(xì)胞在無菌性炎癥環(huán)境下被激活的機(jī)制仍然沒有深入了解，但證據(jù)表明，T細(xì)胞激活具有抗原特異性及抗原獨立性[14]。實驗表明，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞參與了腸道組織缺血再灌注損傷的過程[15]，CD2和CD28 T淋巴細(xì)胞在鼠肺缺血再灌注損傷中均具有損傷的作用[16]；補體調(diào)節(jié)蛋白CD59在小鼠腦缺血再灌注24 h后顯著降低，其可能也參與了腦缺血再灌注的免疫損傷過程[17]。

5 膽管缺血再灌注損傷的影像學(xué)診斷及防治

目前，臨床上診斷膽管疾病主要依靠各種影像學(xué)手段，包括ERCP、PTC、MRCP和超聲，都是通過顯示膽管狹窄、擴(kuò)張等形態(tài)學(xué)改變來診斷。而超聲檢查具有無輻射、經(jīng)濟(jì)便捷、實時動態(tài)、可用于術(shù)中及床旁等顯著優(yōu)勢，已成為膽道疾病首選的影像學(xué)檢查之一[18]。由于膽道系統(tǒng)的特殊性，超聲造影劑不僅可以通過靜脈，還能經(jīng)膽管腔內(nèi)注入，從而觀察膽管腔外和腔內(nèi)的結(jié)構(gòu)。鄭榮琴等應(yīng)用經(jīng)靜脈注入超聲造影劑對膽管壁微循環(huán)灌注進(jìn)行實時、無創(chuàng)觀測，通過檢測膽管周圍毛細(xì)血管叢的血流灌注狀態(tài)對膽道缺血進(jìn)行評價，其改變可能早于形態(tài)學(xué)變化[19]。Nunoi等[20]結(jié)合超聲造影與彩色多普勒，為門脈性膽道病的診斷及鑒別診斷提供了直觀而特異的形態(tài)學(xué)檢查方法，避免了病人遭受膽道活檢和外科手術(shù)的痛苦。盡管如此，超聲造影對于膽道炎癥、缺血性病變的診斷價值還缺乏更多的相關(guān)證據(jù)。因此，筆者認(rèn)為超聲造影對于膽道病變的診斷價值還有待進(jìn)一步深入研究。

過去10年，對于再灌注損傷的機(jī)制研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，而且也提出了很多確實有效的策略來預(yù)防缺血或再灌注損傷[21-22]。缺血預(yù)適應(yīng)就是一種重要的臨床治療方法[23]。新近一項研究報道，肝切除術(shù)前采取多次間斷缺血、再灌注，較單純?nèi)毖A(yù)適應(yīng)可更加有效地減輕肝組織損傷，而且，缺血與再灌注間隔時間越短，肝損傷越小[24]。實驗研究表明，低溫機(jī)器灌注與經(jīng)典的靜態(tài)冷藏器官保存方法相比，可更好地保護(hù)肝實質(zhì)，防止膽管周圍血管叢小動脈壞死，有助于更快地恢復(fù)缺血性膽管的血流再灌注[22]。除此之外，大量的藥物實驗研究模擬缺血預(yù)處理的機(jī)制，為缺血再灌注損傷治療提供了新的強(qiáng)有力的依據(jù)。例如，應(yīng)用脯氨酸羥化酶抑制劑或腺苷受體激動劑調(diào)控能量代謝過程可以增加組織缺血耐受力[25-26]；在冠狀動脈旁路移植術(shù)前應(yīng)用激活的線粒體醛脫氫酶可增強(qiáng)患者心肌缺血的耐受性[27]。實驗證明，一些治療性的氣體包括氫氣、一氧化氮、硫化氫和一氧化碳也可以減輕再灌注損傷[28]。另外，Sheng等[29],研究報道，植入自體骨髓單核細(xì)胞能夠顯著減少肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的凋亡，從而預(yù)防及減少肝內(nèi)膽道缺血的發(fā)生。缺血再灌注損傷的干預(yù)及治療措施目前已進(jìn)入了臨床試驗階段，其安全性和有效性正在論證。一些藥劑已經(jīng)在小型臨床試驗中取得了非常好的結(jié)果，但仍需要大樣本的臨床研究證實。

6 展望

膽道缺血再灌注損傷在肝移植后的發(fā)生率仍然很高。只有深入理解缺血再灌注損傷的炎癥免疫學(xué)機(jī)制，深入闡釋缺血再灌注損傷與膽管疾病之間的關(guān)系，利用更完善的外科技術(shù)及更有效的預(yù)防治療策略，才會減少肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。低溫機(jī)器灌注已經(jīng)受到了越來越多的研究和關(guān)注，具有潛在的優(yōu)勢，可以更好地保護(hù)脆弱的膽管。目前，大多數(shù)研究表明，這種技術(shù)(如溫度、時間等)還需要探索與改善。盡管如此，低溫機(jī)器灌注仍然具有良好的前景，有可能成為一種新技術(shù)，有效地減少膽道缺血再灌注的損傷。盡管未來還有很大的挑戰(zhàn)，我們還是希望有更好的探索及新的療法應(yīng)用于缺血再灌注損傷的臨床實踐中，推動肝移植的發(fā)展。

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