人CD63真核表達質粒的構建及在TCA8113細胞中的表達與定位

劉文慧，闞麗麗，侯美玲，梁雪雪，趙 微，李 新

1遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121200；2盤錦市遼河油田總醫(yī)院，遼寧盤錦 124000；3遼寧醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州 121200

我國口腔癌中舌癌的發(fā)病率居第一位[1]。近年來，舌癌發(fā)病趨于年輕化，嚴重威脅人民健康[2-3]。研究舌癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制及探尋積極有效的治療方法顯得十分迫切和必要。CD63是最具表征的的四次跨膜蛋白，參與細胞的活化、黏附、變異與腫瘤的侵襲、轉移等多種生命過程。文獻報道CD63的表達量與多種腫瘤的侵襲、轉移存在負相關，如惡性黑色素瘤、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌和結腸癌等，CD63的消減沉默促進了腫瘤的侵襲與轉移[4]。Lupia等[5]的研究結果揭示了CD63在抑制黑色素瘤上皮-間質轉換過程中的重要作用，為探尋黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展的機制提供了新的線索。Toricelli等[6]研究表明，CD63、基質金屬蛋白酶抑制劑1及整合素β1通過激活獨立于Akt磷酸化的PI3-K信號通路在黑色素瘤的起源、失巢凋亡抵抗過程中相互作用。Kang等[7]研究指出，在TM4SF5與CD151相互作用下，細胞表面的CD63內化并轉運到晚期溶酶體，可能導致CD63抑瘤作用的終止，進而影響肝癌的轉移。目前，CD63與舌癌侵襲、轉移相關性的研究尚未見報道，鑒于CD63表達量與多種腫瘤侵襲、轉移密切的相關性，本研究通過構建人CD63真核表達質粒，觀察其在人舌鱗癌細胞TCA8113中的表達與定位，為進一步研究CD63與舌癌侵襲、轉移的相關性奠定基礎。

材料和方法

1 實驗材料 pcDNA3.1(+)質粒、TCA8113細胞株由本實驗室保存，CD63鼠IgG、β-actin鼠IgG、HRP標記二抗、FITC標記二抗均購自北京中衫金橋公司；E.coli DH5α購自天根生物；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、PCR試劑、限制性核酸內切酶HindⅢ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL1000 DNA marker、170 kU protein marker均購自大連寶生物公司。

2 引物設計與合成 利用Primer 5.0軟件設計擴增CD63基因的特異性引物，在上游引物的5'端設計HindⅢ酶切位點，下游引物的5'端設計了XhoⅠ酶切位點，上游引物序列：5'-CCCAAGCTT GCCACCATGGCGGTGGAAGGAGGAATGAAATG-3'，下游引物：5'-CCGCTCGAGCATCACCTCGTAGCCA CTTCTGATAC-3'，引物由上海生工合成。

3 CD63基因的擴增和重組真核表達質粒的構建提取舌癌細胞TCA8113總RNA，參照Takara逆轉錄試劑盒說明配置反轉錄體系，反轉錄反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到cDNA，以此為模板PCR擴增CD63基因，擴增體系為50μl：無菌水35μl；cDNA 2μl；上下游引物各1μl；rTaq酶1μl；dNTPs 5μl；10×PCR buffer 5μl。擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，再于72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA凝膠回收試劑盒對目的片段純化回收。純化后的CD63基因片段與真核表達質粒pcDNA3.1(+)分別進行雙酶切反應。反應體系50μl：無菌水31μl；10×buffer 5μl；質粒/DNA片段10μl；HindⅢ、XhoⅠ各2μl，37℃反應4 h。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后，T4連接酶16℃連接過夜。連接體系15μl：無菌水1.5μl；10×T4連接酶buffer 1.5μl；T4連接酶1μl；質粒1μl；DNA片段10μl。將連接產物轉化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂于AMP+的固體LB瓊脂培養(yǎng)板上，次日挑取陽性克隆37℃擴大培養(yǎng)后抽提質粒，經HindⅢ、XhoⅠ雙酶切鑒定正確后，行DNA序列測定，測序由上海生工完成，測序正確后，得到構建成功的重組真核表達質粒pcDNA3.1-CD63。

4 pcDNA3.1-CD63蛋白的表達及Westerrn blot檢測 接種TCA8113細胞，次日細胞融合90%時，用 Lipofectamine 2000轉 染 pcDNA3.1-CD63及pcDNA3.1(+)質粒，6 h后更換培養(yǎng)基，48 h后用細胞刮器收集細胞，RIPA + 1% PMSF裂解細胞，BCA蛋白定量后制樣行Western blot檢測CD63表達情況。一抗為CD63單克隆鼠IgG(1∶500稀釋)，β-actin單克隆鼠IgG(1∶1 000稀釋)，二抗為HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀釋)。

5 pcDNA3.1-CD63蛋 白 及 內 源 性CD63在TCA8113細胞內定位 接種TCA8113細胞于六孔板中制備細胞爬片，使次日轉染時細胞融合約90%，用Lipofectamine 2000轉染pcDNA3.1-CD63質粒，6 h后換為完全培養(yǎng)基。48 h后棄液，PBS洗2遍。將正常細胞和轉染后細胞爬片用4℃預冷的4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗3遍，0.1% Triton室溫打孔10 min，PBS洗3遍，1% BSA室溫封閉1 h，加入CD63單克隆抗體(鼠，1∶500稀釋)，37℃孵育1.5 h，PBS洗3遍，加入FITC標記的山羊抗小鼠二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1.5 h，PBS洗3遍后，將爬片取出置于載玻片上，甘油封片，掃描共聚焦顯微鏡觀察。

結 果

1 CD63基因PCR擴增 PCR擴增的CD63基因片段經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，CD63基因在717 bp處有特異性條帶，條帶大小與預期相符。

2 pcDNA3.1-CD63質粒酶切鑒定及測序 挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，提取質粒進行HindⅢ、XhoⅠ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見717 bp和5 428 bp兩條帶，其大小均符合目的片段大小(圖2)。將菌液送上海生工測序，測序結果正確無誤，得到成功構建的pcDNA3.1-CD63質粒。

3 Western blot檢測pcDNA3.1-CD63在TCA8113中的表達 將正常TCA8113細胞，分別轉染pcDNA3.1-CD63空載體和pcDNA3.1-CD63 48 h的細胞分別收樣，裂解后BCA蛋白定量，Western blot檢測可見轉染pcDNA3.1-CD63的TCA8113細胞CD63表達量高于對照組。如圖3。

4 pcDNA3.1-CD63蛋白與內源CD63的表達與定位 pcDNA3.1-CD63轉染TCA8113細胞后48 h行間接免疫熒光檢測，共聚焦顯微鏡觀察可見轉染pcDNA3.1-CD63的TCA8113細胞有明亮綠色熒光表達，熒光主要集中于細胞膜，與內源性CD63蛋白表達定位相似，可見pcDNA3.1-CD63能在TCA8113細胞中高效表達。如圖4。

圖1 CD63基因的PCR擴增 M： DL1000 DNA Marker; Lane 1：CD63 Gene圖 2 重組質粒雙酶切鑒定M: DL1000 DNA marker; Lane 1：recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63 digested by HindⅢand XhoⅠFig. 1 PCR results of CD63 gene M： DL1000 DNA Marker; Lane 1： CD63 GeneFig. 2 Identif cation of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion M: DL1000 DNA marker; Lane 1：recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63 digested by HindⅢand XhoⅠ

圖3 蛋白免疫印跡檢測pcDNA3.1-CD63蛋白的表達

圖4 免疫熒光檢測pcDNA3.1-CD63蛋白在TCA8113中的的表達與定位A：TCA8113 cells control；B：TCA8113 cell transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63；scale bar:25μmFig. 4 Expression and location of pcDNA3.1-CD63 in TCA8113 cells detected by immunof uorescenceA：TCA8113 cells control；B：TCA8113 cell transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63；scale bar:25μm

討 論

舌癌生長快，惡性程度高，浸潤性較強，極易發(fā)生局部侵襲及通過淋巴、血液循環(huán)引起全身轉移，總體5年生存率僅50% ～ 60%，是導致患者死亡的主要因素[8]。雖然以手術為主、放化療為輔的綜合序列治療方案取得較好療效，然而舌癌術后生存率未見顯著提高，且手術治療舌癌存在著諸多不良后果。目前國內外對舌癌的研究多集中在其侵襲與轉移的分子機制。從分子水平進一步探討影響舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預后的因素，對于提高舌癌的療效具有重大意義。

在1988年Hotta等[9]發(fā)現CD63豐富表達于早期黑色素瘤，隨著腫瘤的惡變，CD63的表達量逐漸下降，而腫瘤細胞變得更具侵襲性。Jang和Lee[10]用RNAi技術使CD63沉默后發(fā)現，黑色素瘤細胞的變形能力及基質降解能力大大增強。而在CD63基因敲除的黑色素瘤細胞，當轉染外源CD63后，細胞的變形和遷移能力降低并且更易于黏附于胞外基質，此過程中有整合素的參與[11]。隨后CD63表達量與腫瘤惡變的相關性也相繼見于其他腫瘤如卵巢癌[12]、肺腺癌[13]、乳腺癌[14]和結腸癌[15]等。整合素介導了腫瘤細胞與細胞外基質的黏附過程，而CD63通過與整合素α4β1，α3β1等之間的相互作用影響了腫瘤細胞的變形和遷移能力[16-20]。同時有研究指出，CD63還參與調節(jié)其他影響腫瘤進展蛋白的轉運過程，如通過參與胞外基質的翻轉進而增強腫瘤侵襲、轉移能力的膜相關型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)。在CD63過表達的人胚胎腎細胞，MT1-MMP通過和CD63 N端結合，開啟其內吞及靶向輸送到溶酶體降解的過程，進而導致MT1-MMP水平降低[21]。除了和腫瘤密切相關，CD63還具有其他重要生物學功能，如參與調節(jié)HIV-1的感染和復制[22]；作為慢性蕁麻疹的分子學標志物介導過敏反應[23]；CD63能使活化的B細胞中CRCX4表達下調，進而影響T細胞免疫[24]；TIMP-1通過CD63和整合素的信號傳導調節(jié)人神經干細胞的趨化性[25]；CD63能促使整合素β1-VEGFR2復合體的形成，調節(jié)下游信號轉導，進而影響白細胞的募集，黏附過程[26]等。目前，CD63與舌癌侵襲、轉移的相關性國內外未見報道，鑒于CD63與許多腫瘤的侵襲與轉移密切相關，我們推測，CD63在舌癌的侵襲與轉移中也起到類似重要作用。為此，本研究根據CD63的基因序列，設計了一對CD63基因特異性引物，通過提取TCA8113細胞總RNA，RT-PCR法獲得CD63基因片段，通過酶切鑒定及DNA測序，成功構建pcDNA3.1-CD63真核表達質粒。Western blot驗證了pcDNA3.1-CD63蛋白在TCA8113細胞中的高效表達，免疫熒光顯示其定位與內源性CD63蛋白定位相似，均表達于細胞膜。

本研究構建的pcDNA3.1-CD63真核表達質?？捎糜谘芯緾D63蛋白對舌癌細胞生物學行為的影響，為進一步探討CD63表達量和舌癌細胞侵襲、轉移能力之間的相關性奠定基礎。后續(xù)我們開展了正常TCA8113細胞和高表達CD63細胞的劃痕實驗以及Transwell細胞遷移實驗，實驗結果顯示，高表達CD63的TCA8113細胞劃痕后24 h遷移距離明顯小于正常細胞，且高表達CD63的TCA8113細胞接種24 h穿過膜的數量明顯少于正常細胞，經統計學分析，差異有統計學意義。

1 Pulte D， Brenner H. Changes in survival in head and neck cancers in the late 20th and early 21st century： a period analysis［J］. Oncologist， 2010， 15（9）： 994-1001.

2 Soudry E， Preis M， Hod R， et al. Squamous cell carcinoma of the oral tongue in patients younger than 30 years： clinicopathologic features and outcome［J］. Clin Otolaryngol， 2010， 35（4）： 307-312.

3 Larsen SR， Johansen J， S?rensen JA， et al. The prognostic significance of histological features in oral squamous cell carcinoma［J］. J Oral Pathol Med， 2009， 38（8）： 657-662.

4 Pols MS， Klumperman J. Trafficking and function of the tetraspanin CD63［J］. Exp Cell Res， 2009， 315（9）： 1584-1592.

5 Lupia A， Peppicelli S， Witort E， et al. CD63 tetraspanin is a negative driver of epithelial-to-mesenchymal transition in human melanoma cells［J］. J Invest Dermatol， 2014， 134（12）： 2947-2956.

6 Toricelli M， Melo FH， Peres GB， et al. Timp1 interacts with beta-1 integrin and CD63 along melanoma Genesis and confers anoikis resistance by activating PI3-K signaling pathway independently of Akt phosphorylation［J］. Mol Cancer， 2013， 12： 22.

7 Kang M， Ryu J， Lee D， et al. Correlations between transmembrane 4 L6 family member 5 （TM4SF5）， CD151， and CD63 in liver fibrotic phenotypes and hepatic migration and invasive capacities［J］. PLoS One， 2014， 9（7）： e102817.

8 Lim MS. Re： correlational of oral tongue cancer inversion with matrix metalloproteinases （MMPs） and vascular endothelial growth factor（VEGF） expression， by Kim S-H， Cho NH， Kim K， et al［J］. J Surg Oncol， 2006， 93（4）： 253-254.

9 Hotta H， Ross AH， Huebner K， et al. Molecular cloning and characterization of an antigen associated with early stages of melanoma tumor progression［J］. Cancer Res， 1988， 48（11）： 2955-2962.

10 Jang HI， Lee H. A decrease in the expression of CD63 tetraspanin protein elevates invasive potential of human melanoma cells［J］. Exp Mol Med， 2003， 35（4）： 317-323.

11 Radford KJ， Thorne RF， Hersey P. Regulation of tumor cell motility and migration by CD63 in a human melanoma cell line［J］. J Immunol， 1997， 158（7）： 3353-3358.

12 Zhijun X， Shulan Z， Zhuo Z. Expression and significance of the protein and mRNA of metastasis suppressor gene ME491/CD63 and integrin alpha5 in ovarian cancer tissues［J］. Eur J Gynaecol Oncol， 2007， 28（3）： 179-183.

13 Kwon MS， Shin SH， Yim SH， et al. CD63 as a biomarker for predicting the clinical outcomes in adenocarcinoma of lung［J］. Lung Cancer， 2007， 57（1）： 46-53.

14 Sauer G， Kurzeder C， Grundmann R， et al. Expression of tetraspanin adaptor proteins below defined threshold values is associated with in vitro invasiveness of mammary carcinoma cells［J］. Oncol Rep，2003， 10（2）： 405-410.

15 Sordat I， Decraene C， Silvestre T， et al. Complementary DNA arrays identify CD63 tetraspanin and alpha3 integrin chain as differentially expressed in low and high metastatic human colon carcinoma cells［J］. Lab Invest， 2002， 82（12）： 1715-1724.

16 Rubinstein E， Le Naour F， Lagaudrière-Gesbert C， et al. CD9，CD63， CD81， and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins［J］. Eur J Immunol， 1996， 26（11）： 2657-2665.

17 Berditchevski F， Zutter MM， Hemler ME. Characterization of novel complexes on the cell surface between integrins and proteins with 4 transmembrane domains （TM4 proteins）［J］. Mol Biol Cell， 1996，7（2）： 193-207.

18 Berditchevski F， Bazzoni G， Hemler ME. Specific association of CD63 with the VLA-3 and VLA-6 integrins［J］. J Biol Chem，1995， 270（30）： 17784-17790.

19 Radford KJ， Mallesch J， Hersey P. Suppression of human melanoma cell growth and metastasis by the melanoma-associated antigen CD63（ME491）［J］. Int J Cancer， 1995， 62（5）： 631-635.

20 Skubitz KM， Campbell KD， Iida J， et al. CD63 associates with tyrosine kinase activity and CD11/CD18， and transmits an activation signal in neutrophils［J］. J Immunol， 1996， 157（8）： 3617-3626.

21 Takino T， Miyamori H， Kawaguchi N， et al. Tetraspanin CD63 promotes targeting and lysosomal proteolysis of membrane-type 1 matrix metalloproteinase［J］. Biochem Biophys Res Commun，2003， 304（1）： 160-166.

22 Li G， Endsley MA， Somasunderam A， et al. The dual role of tetraspanin CD63 in HIV-1 replication［J］. Virol J， 2014， 11： 23. 23 Christensen CU， Vestergaard C， Hoffmann HJ. Activation markers CD63 and CD203c are upregulated in chronic urticaria［J］. Ann Dermatol， 2013， 25（4）： 522-523.

24 Yoshida N， Kitayama D， Arima M， et al. CXCR4 expression on activated B cells is downregulated by CD63 and IL-21［J］. J Immunol， 2011， 186（5）： 2800-2808.

25 Lee SY， Kim JM， Cho SY， et al. TIMP-1 modulates chemotaxis of human neural stem cells through CD63 and integrin signalling［J］. Biochem J， 2014， 459（3）： 565-576.

26 Tugues S， Honjo S， K?nig C， et al. Tetraspanin CD63 promotes vascular endothelial growth factor receptor 2-β1 integrin complex formation， thereby regulating activation and downstream signaling in endothelial cells in vitro and in vivo［J］. J Biol Chem， 2013， 288（26）： 19060-19071.