Hedgehog信號通路分子在食道鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義*

崔宏偉 師迎旭 張滿 楊凌

我國食道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率占全世界總和的70%，在我國因腫瘤死亡的疾病中排名第四。食道癌在組織學(xué)上有兩種主要的類型：鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）和腺癌（EAC）型，其在不同的地區(qū)有不同的發(fā)病率且在世界范圍內(nèi)食道鱗狀細(xì)胞癌是主要的食道癌類型。由于早期診斷方法有限，食道鱗狀細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)較晚，導(dǎo)致其預(yù)后很差，5年生存期在10%~25%[1]。因此，細(xì)致地研究食道鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)理，可為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。作為一個(gè)重要的發(fā)育相關(guān)信號通路，hedgehog信號通路對維持組織極性和干細(xì)胞群體起到重要作用。Hh通路組分也在多種上皮腫瘤中持續(xù)有活性，包括小細(xì)胞肺癌、胰腺癌，其他胃腸道腫瘤和前列腺癌[2-8]。為了更好的闡明hedgehog信號激活在食道癌發(fā)生和發(fā)展過程的作用，筆者檢測了hedgehog靶基因和通路信號分子在食道鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2013年3月-2014年5月經(jīng)手術(shù)切除、病理科確診為食道鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)本共12例，其中男9例，女3例，年齡36~78歲，平均（53.61±10.63）歲，所有患者于術(shù)前均未行放化療治療。病理類型均為鱗狀細(xì)胞癌，其中Ⅱ級8例，Ⅲ級4例。另選擇距腫瘤邊緣2 cm處經(jīng)病理證實(shí)為正常組織的食道黏膜作為對照，全部實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，切厚度為5 μm片，烤片備用。

1.2 主要試劑 堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體、底物BCIP/NBT購于Roche公司，蛋白激酶K購于Promega公司，探針購于愛科博生物公司，無水乙醇、二甲苯等試劑均為分析純。

1.3 原位雜交方法檢測 將事先粘片備好的石蠟切片脫蠟經(jīng)梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理，置于蛋白激酶K中，37 ℃水浴箱消化15 min，PBS清洗2次（每次5 min）。4%多聚甲醛固定，PBS清洗2次（每次5 min）。在預(yù)雜交液中，37 ℃孵育2 h。切片滴加探針，蓋上蓋玻片置于42 ℃水浴箱中雜交過夜。滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體（Dig-AKP），室溫放置30 min，專用洗液洗2次（每次5 min），加BCIP/NBT于暗處顯色，顯微鏡下觀察染色程度，終止顯色，常規(guī)脫水，透明封片。結(jié)果判定：以細(xì)胞核或/和細(xì)胞漿呈藍(lán)色、藍(lán)紫色、紫色顆粒為陽性表達(dá)。每張切片中任取5個(gè)具有代表性的400倍光鏡視野，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

筆者發(fā)現(xiàn)在12例食道癌中10例（83%）分別表 達(dá) Gli1、Hip或 是 PDGFRα 基 因，Gli1、Hip和PDGFRα的轉(zhuǎn)錄只在組織的癌細(xì)胞中檢測到，而在其周圍的間質(zhì)組織中未發(fā)現(xiàn)，見圖1。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在10例食道癌組織中Gli1、Hip和PDGFRα出現(xiàn)共表達(dá)，在對照組中均未表達(dá)，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明在食道癌中PDGFRα和Hip與PTCH1或是Gli1一樣可以用來作為hedgehog通路激活的分子標(biāo)記。筆者還對這三種基因的表達(dá)與患者的臨床資料進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與患者的性別、年齡，食道鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分化、分期無相關(guān)性（P>0.05），見表1。12例癌旁組織中未發(fā)現(xiàn)三個(gè)通路靶基因的表達(dá)。

除了hedgehog通路靶基因，筆者還檢測了Smo和Su（Fu）在食道癌中的表達(dá)。Smo和Su（Fu）的轉(zhuǎn)錄子的陽性表達(dá)率為83%（10/12）和67%（8/12），Smo和Su（Fu）的轉(zhuǎn)錄只在組織的癌細(xì)胞中檢測到，而在其周圍的間質(zhì)組織中未發(fā)現(xiàn)，見圖1。在食道癌中Smo、Gli1、Hip和PDGFRα的轉(zhuǎn)錄子高度共同表達(dá)，在對照組中均未表達(dá)，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Smo、Gli1、Hip和PDGFRα共同表達(dá)的組織中，有2例沒有發(fā)現(xiàn)Su（Fu）的表達(dá)，暗示在2個(gè)組織中Su（Fu）的沉默可能是hedgehog通路異常激活的原因。筆者還對這2個(gè)基因的表達(dá)與患者的臨床資料進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與患者的性別、年齡，食道鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分化、分期無相關(guān)性（P>0.05），見表1。12例癌旁組織中未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)通路分子的表達(dá)。

表1 hedgehog信號通路分子Gli1、Hip、PDGFRα、Smo及Su（Fu）基因在食道鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá) %

圖1 Hedgehog通路分子基因在食道鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（×200）

3 討論

Hedgehog信號通路的主要傳導(dǎo)機(jī)制從果蠅到人類是相對保守的，七次跨膜蛋白smoothened（SMO）是該途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，另一個(gè)跨膜蛋白Patched （PTCH）在沒有Hedgehog配體的情況下會(huì)抑制SMO的功能。在有Hedgehog配體的情況下，Hedgehog和它的受體PTCH結(jié)合，釋放PTCH對SMO的抑制，SMO傳導(dǎo)信號最終到Gli轉(zhuǎn)錄因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，Gli通過與靶基因的起始區(qū)特異序列直接結(jié)合來調(diào)控其表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道在幾種食道癌細(xì)胞系和食道癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)Sonic hedgehog（SHH）和信號通路靶基因的表達(dá)增加[8-10]。Gli的表達(dá)與腫瘤浸潤的深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)[9]。研究還表明進(jìn)行放化療的患者Gli在細(xì)胞核表達(dá)要比Gli在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的患者的預(yù)后差[11]。

為了更好地了解食道鱗狀細(xì)胞癌中hedgehog通路的情況，筆者檢測了Gli1、Hip、PDGFRα、Smo、Su（Fu）基因的表達(dá)。有研究表明，在C3H10T1/2細(xì)胞中，Gli1可以調(diào)控PDGFRα的表達(dá)[12]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDGFRα與靶基因Gli1的表達(dá)一致，說明在腫瘤組織中PDGFRα的表達(dá)可能受到Gli1基因的調(diào)控。目前STI571作為PDGFRα的抑制劑應(yīng)用在臨床治療中，食道鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)PDGFRα的患者，也可以考慮接受STI571的治療[13]。HIP作為已知的hedgehog通路靶基因，能夠與受體PTCH競爭與Hh蛋白的結(jié)合，同時(shí)，它也是該信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)子，形成負(fù)反饋途徑。胃癌、食道癌和直腸癌中HIP啟動(dòng)子的過甲基化導(dǎo)致HIP的表達(dá)下降[14]。而筆者的研究結(jié)果顯示Hip和Gli1基因表達(dá)一致，未發(fā)現(xiàn)Hip基因沉默。Su（Fu）是hedgehog通路中的抑制因子，可以通過抑制Gli分子的活性來抑制hedgehog通路的激活，在肺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)由于過甲基化而導(dǎo)致Su（Fu）基因的沉默[15-16]。筆者的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)Su（Fu）基因表達(dá)的明顯的改變，只有2例癌組織在其他通路組分表達(dá)的情況下Su（Fu）基因的表達(dá)缺失。SMO是hedgehog通路中重要的信號傳導(dǎo)分子，SMO基因的突變在皮膚基底癌中導(dǎo)致hedgehog通路的激活，在部分膀胱癌中也有SMO基因表達(dá)升高的報(bào)道，筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMO基因表達(dá)也升高且和Gli1、Hip表達(dá)一致[17]。

hedgehog通路中很多變化均可導(dǎo)致信號通路的激活，其可能的機(jī)制有hedgehog蛋白的表達(dá)升高，信號通路負(fù)調(diào)節(jié)子的過甲基化（如HIP，Su（Fu）），信號通路下游分子基因的擴(kuò)增（如Gli轉(zhuǎn)錄因子）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，筆者可以預(yù)測對于hedgehog通路激活的食道癌的治療策略要具體情況具體對待。例如，對于過表達(dá)hedgehog蛋白而引發(fā)hedgehog通路激活的腫瘤可以用hedgehog中和抗體或是SMO拮抗劑來治療；對于Gli1或是Su（Fu）分子變化而引發(fā)的腫瘤可以用Gli1的抑制劑來治療；而對于hedgehog通路沒有激活的腫瘤用hedgehog通路抑制劑來治療可能沒有任何作用。

[1] Pennathur A，Gibson M K，Jobe B A，et al.Oesophageal carcinoma[J].Lancet，2013，381（9864）：400-412.

[2] Yoon C，Park do J，Schmidt B，et al.CD44 expression denotes a subpopulation of gastric cancer cells in which Hedgehog signaling promotes chemotherapy resistance[J].Clin Cancer Res，2014，20（15）：3974-3988.

[3] Peng L，Hu J，Li S，et al.Aberrant methylation of the PTCH1 gene promoter region in aberrant crypt foci[J].Int J Cancer，2013，132（2）：E18-25.

[4] Jiang W G，Ye L，Ruge F，et al.Expression of Sonic Hedgehog（SHH） in human lung cancer and the impact of YangZheng XiaoJi on SHH-mediated biological function of lung cancer cells and tumor growth[J].Anticancer Res，2015，35（3）：1321-1331.

[5] Memmi E M，Sanarico A G，Giacobbe A，et al.p63 Sustains selfrenewal of mammary cancer stem cells through regulation of Sonic Hedgehog signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（11）：3499-3504.

[6] Mimeault M，Rachagani S，Muniyan S，et al.Inhibition of hedgehog signaling improves the anti-carcinogenic effects of docetaxel in prostate cancer[J].Oncotarget，2015，6（6）：3887-3903.

[7] Mar échal R，Bachet J B，Calomme A，et al.Sonic hedgehog and Gli1 expression predict outcome in resected pancreatic adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res，2015，21（5）：1215-1224.

[8] Ma X，Sheng T，Zhang Y，et al.Hedgehog signaling is activated in subsets of esophageal cancers[J].Int J Cancer，2006，118（1）：139-148.

[9] Mori Y，Okumura T，Tsunoda S，et al.Gli-1 expression is associated with lymph node metastasis and tumor progression in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncology，2006，70（5）：378-389.

[10] Berman D M，Karhadkar S S，Maitra A，et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours[J].Nature，2003，425（6960）：846-851.

[11] Yoshikawa R，Nakano Y，Tao L，et al.Hedgehog signal activation in oesophageal cancer patients undergoing neoadjuvant chemoradiotherapy[J].Br J Cancer，2008，98（10）：1670-1674.

[12] Xie J，Aszterbaum M，Zhang X，et al.A role of PDGFRalpha in basal cell carcinoma proliferation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（16）：9255-9259.

[13] Heinrich M C，Corless C L，Demetri G D，et al.Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor[J].J Clin Oncol，2003，21（23）：4342-4349.

[14] Taniguchi H，Yamamoto H，Akutsu N，et al.Transcriptional silencing of hedgehog-interacting protein by CpG hypermethylation and chromatic structure in human gastrointestinal cancer[J].J Pathol，2007，213（2）：131-139.

[15] Barnfield P C，Zhang X，Thanabalasingham V，et al.Negative regulation of Gli1 and Gli2 activator function by Suppressor of fused through multiple mechanisms[J].Differentiation，2005，73（8）：397-405.

[16] Chi S，Huang S，Li C，et al.Activation of the hedgehog pathway in a subset of lung cancers[J].Cancer Lett，2006，244（1）：53-60.

[17] Karhadkar S S，Bova G S，Abdallah N，et al.Hedgehog signalling in prostate regeneration， neoplasia and metastasis[J].Nature，2004，431（7009）：707-712.