鄭州地區(qū)秋冬季腹瀉患兒輪狀病毒基因分型及干預(yù)研究*

王艷麗 杜遠(yuǎn)舉 李春力 程艷波

輪狀病毒（rotavirus，RV）由澳大利亞科學(xué)家Bishop等在1973年首次發(fā)現(xiàn)，是引起嬰幼兒感染性腹瀉的主要病原體。據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年統(tǒng)計，RV感染造成45.3萬（42.0~49.4萬）幼童死亡，在發(fā)展中國家，小兒腹瀉常常是嬰幼兒死亡的主要原因，僅次于肺炎，排在第2位[1]。大約90%的RV感染相關(guān)死亡病例發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國家[2]。我國每年有4萬嬰幼兒因RV性腹瀉而死亡[3]。RV感染普遍，目前尚無治療RV腹瀉的特效藥，主要采用對癥治療，糾正脫水，維持電解質(zhì)平衡，因此預(yù)防極其重要[4]。

目前由于RV的型別眾多且多變，其流行病學(xué)相當(dāng)復(fù)雜，在不同地區(qū)不同時期的流行株各不相同，因此有必要建立廣泛的RV監(jiān)測網(wǎng)，動態(tài)監(jiān)測RV流行株的變化，從而為疫苗研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。鄭州地區(qū)為北溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冷暖適中，四季分明，也是我國RV流行的代表性地區(qū)之一，流行高峰一般在9-12月份。本研究選擇常見的6種A組RVVP7基因型（G基因型）特異引物和5種A組RVVP4基因型（P基因型）特異引物，采用RT-PCR及net-PCR技術(shù)對鄭州地區(qū)嬰幼兒A組RV腹瀉進(jìn)行P和G基因型的分子流行病學(xué)研究，并探討使用RV干預(yù)后再次感染患兒的血清分型及臨床癥狀嚴(yán)重程度的關(guān)系，為研制適合本地區(qū)的安全有效的RV疫苗提供流行病學(xué)依據(jù).并對RV的流行病學(xué)檢測提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年9月-2012年3月、2012年9月-2013年3月鄭州市第一人民醫(yī)院和鄭州人民醫(yī)院兒科住院部和門診秋冬季腹瀉患兒共900例。其中2011年9月-2012年3月500份，2012年9月-2013年3月400份，均符合以下臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<5歲，大便次數(shù)增多，呈水樣、蛋花湯樣便或稀糊狀、黃綠色稀便，無黏液及膿血[5]。（2）標(biāo)本逐月收集，詳細(xì)記錄腹瀉患兒口服輪狀病毒疫苗史及免疫調(diào)節(jié)劑（如干擾素、免疫球蛋白）使用史。（3）所有標(biāo)本存于-70 ℃冰柜備用，詳細(xì)記錄每例患兒腹瀉的臨床表現(xiàn)（發(fā)熱程度、每日腹瀉次數(shù)、有無嘔吐、有無脫水癥狀及脫水癥狀的輕重）、療程以及有無合并呼吸道感染癥狀。

1.2 主要試劑 A群RV診斷試劑盒（購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所），小量柱離心式/液體樣品RNA/DNA抽提試劑盒（購自上海華舜工程有限公司），PCR擴增試劑（均購自寶生物工程大連有限公司），PCR產(chǎn)物鑒定利用瓊脂糖凝膠電泳法。

1.3 試驗方法 （1）RV的RNA提取及檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法（ELISA）檢測RV抗原，其操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作：檢測陽性標(biāo)本用病毒/液體樣品的RNA/DNA抽提試劑盒（購自上海華舜工程有限公司）抽提RNA，將裝有RVRNA的1.5 mL離心管置于-70 ℃冰柜備用。（2）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴增RV的VP7全長基因及巢式-聚合酶鏈反應(yīng)（net-PCR）VP7血清型分型。分型方法見參考文獻(xiàn)[6]。（3）巢式-聚合酶鏈反應(yīng)（net-PCR）進(jìn)行VP4血清型分型，分型方法見參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RV檢測結(jié)果以及RV感染的年齡和性別分布 通過ELISA方法檢測結(jié)果顯示，900份糞便標(biāo)本中RV陽性樣本為612份，陽性率為68.0%。其中男女患兒比例為2.01∶1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在7~18月年齡段患兒中RV陽性率最高（73.9%），與其他各年齡段0~6個月（7.0%）、19~36個月（16.3%）、37~60個月（2.8%）的檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在輪狀病毒感染病例中，小于2歲患兒所占比例較高，各年度基本一致；其中高發(fā)年齡段為6~24個月，平均發(fā)病月齡為（10.1±7.2）個月。612份陽性標(biāo)本中年齡和性別分布見表1。

表1 RV陽性標(biāo)本年齡與性別分布 例

2.2 不同時間RV感染的時間分布特點 RV腹瀉呈全年發(fā)病，2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV陽性率檢出最高的月份分別為2011年10月和11月，2012年9月和10月。高峰月和其他月份有差異。

2.3 不同時間RV的G血清型和P基因型型別特征 G3型在2011年9月-2012年3月為優(yōu)勢株，2012年9月-2013年3月G9型成為優(yōu)勢株，混合感染型每年均有出現(xiàn)。P8在每年的感染中均為優(yōu)勢株，并發(fā)現(xiàn)有混合感染型別， 2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分別為14.8%和15.0%。具體G血清型和P基因型型別特征見表2、3。

表2 不同時間RV的G血清型分型 份（%）

表3 不同時間RV的P基因型分型 份（%）

2.4 不同時間RV的G血清型和P基因型組合 2011年9月-2012年3月G、P組合以G3P8為主，2012年9月-2013年3月以G9P8型為主。具體G血清型和P基因型的組合見表4。

表4 G血清型、P基因型組合 份

2.5 RV病毒分型與呼吸道感染情況 在612份陽性標(biāo)本中合并有呼吸道感染的147例，其中G9P8型有67例，占45.6%，其余為混合感染型，其中G1+3P8型、G3+9P8型、G3P8+6型、G1+3P8+4型均有出現(xiàn)。2.6 RV病毒分型及口服輪狀病毒疫苗后再次感染 900份標(biāo)本中使用輪狀病毒疫苗的患兒共317份，其中612份陽性標(biāo)本中已使用口服RV疫苗（商品名羅特威，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的口服RV活疫苗）再次受感染的患兒有149例，再感染的患兒149例與未使用輪狀病毒疫苗患兒臨床表現(xiàn)如：腹瀉次數(shù)、發(fā)熱或輕微發(fā)熱及脫水癥狀等情況較未使用輪狀病毒疫苗患兒輕。

3 討論

2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV檢測結(jié)果顯示，鄭州地區(qū)秋冬季腹瀉患兒RV陽性率68.0%，其中2011年9月-2012年3月陽性率77.8%，2012年9月-2013年3月RV陽性率55.7%，高于王建陽等[8]2005年10月-2006年10月檢測的RV感染陽性率51.97%及程艷波等[6]2010年鄭州地區(qū)監(jiān)測陽性率50%，與往年相比感染率有所增高。較國內(nèi)其他城市如北京、上海、廣州等地區(qū)高，證明RV仍是引起鄭州地區(qū)嬰幼兒腹瀉的主要原因。RV檢出率在男性患兒和女性患兒之間國內(nèi)報道各有區(qū)別。本研究顯示RV陽性率在男女患兒之間無差異。

RV的VP7蛋白是位于其外殼的主要蛋白結(jié)構(gòu)，目前已有27個G血清型和35個P基因型被確定[9]。RV全球范圍內(nèi)最流行的組合為G1P8、G2P4、G3P8、G4P8、G9P8[10]。而我國不同地區(qū)不同時間報道的RV流行株不同，我國20世紀(jì)90年代RV感染以G1型為主，2001年以來G3型取代G1型成為成為國內(nèi)主要流行株[11]。例如廣州地區(qū)1994-2001年RV感染以G1型為主，2007年以G3型為主，而2008年轉(zhuǎn)為以G1型為主[10]。上海地區(qū)2001-2007年G基因型以G3為優(yōu)勢株，G1呈下降趨勢[12]。2008年-2011年G基因型出現(xiàn)變化，G3呈下降趨勢，G9和G1呈波動上升趨勢，尤其G9于2011年成為主要流行株[13]。蘭州地區(qū)2001-2007年度RV主要流行株由G3型過渡到G2型，再過渡到近兩年的G1型，可見年份不同流行株不同[14-15]。自1994年國內(nèi)學(xué)者錢淵等[16]首次報道G9型感染病例，近年來國內(nèi)G9病例陸續(xù)出現(xiàn)報道，任斌知等[17]研究太原市嬰幼兒RV腹瀉的分子流行病學(xué)特征發(fā)現(xiàn)2012年該市RV基因型G9成為主要優(yōu)勢株。上海于2011年、廣西2010年均檢測到G9并成為該年最主要的流行優(yōu)勢株[13-17]。本研究顯示鄭州地區(qū)2011年9月-2012年3月以G3型為主要流行株，2012年9月-2013年3月則以G9為主要流行株，證實G9作為以前稀少的流行株逐漸成為優(yōu)勢株，并且在鄭州地區(qū)流行中占主導(dǎo)地位。目前RV疫苗主要是針對4個主要的流行優(yōu)勢株（G1~G4）來控制RV感染，而G9型RV流行越來越普遍，很有可能成為繼G1~G4之后第5種最為流行的血清型，將來的RV疫苗的研制就必須引入所有常見的血清學(xué)中的中和抗原，這促使人們重新認(rèn)識G9型輪狀病毒感染的流行病學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)G血清型混合感染病例比率2011年9月-2012年3月為13.1%，2012年9月-2013年3月混合感染病例比率15.7%，有升高趨勢?；旌细腥颈嚷实某霈F(xiàn)為病毒基因重組所導(dǎo)致流行病毒株血清型改變提供機會，而基因突變是導(dǎo)致病毒株多樣性的主要因素。鄭州地區(qū)RV混合感染病例遠(yuǎn)高于蘭州地區(qū)混合感染比率，與國內(nèi)其他地區(qū)相比也明顯增高，這也說明RV感染比率近兩年逐漸增高可能與基因突變有關(guān)。

RVVP4是組成RV的對蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，目前引起嬰幼兒腹瀉的P基因型多為P8和P4型，同時也發(fā)現(xiàn)了一些不常見的P6型和P9型。最近研究表明P6型可引起嬰幼兒有癥狀的腹瀉，是一種與RV腹瀉有關(guān)的蛋白[18]。本研究RVVP4基因分型結(jié)果顯示：鄭州地區(qū)2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型均以P8型為主，P4型次之，發(fā)現(xiàn)P6型比率為5.9%（36/612），低于廣州地區(qū)2007年11月-2008年2月的P6比率22.2%[10]，蘭州地區(qū)2001-2005年均未發(fā)現(xiàn)P6型，2006年發(fā)現(xiàn)P6型毒株4例[14]，張玉俠等[19]2006-2008年未發(fā)現(xiàn)P6型病例。李丹地等[20]研究河北省盧龍地區(qū)2008-2009年RV感染未發(fā)現(xiàn)P6型感染病例，發(fā)現(xiàn)混合感染病例較多，占28.7%。鄭州地區(qū)2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分別為14.8%和15.0%，較2010年王艷麗等[21]研究該地區(qū)混合感染病例增加。目前國內(nèi)外均檢出高比率的混合型感染病例，證明RV的多樣易變，導(dǎo)致復(fù)雜分子流行病學(xué)出現(xiàn)，給RV的預(yù)防帶來挑戰(zhàn)。

G、P是兩個相對獨立的血清型，相同的G型毒株可有不同的P血清型。不同國家地區(qū)，同一地區(qū)不同年份流行的P基因型也可不同或出現(xiàn)新的G和P組合類型。隨著檢測方法的不斷改進(jìn)和流行病學(xué)檢測網(wǎng)絡(luò)的日臻完善，發(fā)現(xiàn)先前認(rèn)為不致病或很少致病的基因型也能引起嬰幼兒腹瀉。本研究提示鄭州地區(qū)2011年9月-2012年3月RV流行病學(xué)組合為G3P8型，2012年9月-2013年3月變?yōu)镚9P8型為主，孫立美等[22]監(jiān)測廣州地區(qū)2012年RV分子型別以G1P8型為主，并發(fā)現(xiàn)不常見的G4型。高志勇等[23]監(jiān)測北京地區(qū)2011年RV分子流行型別以G1+G9P8混合型為主。這顯示各地區(qū)不同年份RV分子流行病學(xué)不斷變化。目前國內(nèi)各 地都有RV分子流行病學(xué)檢測，而鄭州地區(qū)既往缺乏RV分子流行病學(xué)系統(tǒng)的研究。

RV腹瀉的嚴(yán)重程度和RV血清型的相關(guān)性研究一直是個熱點。Bern等[24]發(fā)現(xiàn)感染G2型毒株患兒的癥狀比感染其他型別毒株患兒的癥狀嚴(yán)重，但并沒有對此作出系統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)比較。2013年WHO在關(guān)于RV疫苗的意見書中提出RV的型別通常與疾病的嚴(yán)重程度無關(guān)。本課題研究發(fā)現(xiàn)在所有研究的RV分型中合并呼吸道感染的病例G9P8型居多，這是否與RVG9型易合并呼吸道感染有關(guān)還是與G9P8型毒力強有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究證實。

輪狀病毒腹瀉的臨床表現(xiàn)為腹瀉黃綠色稀水樣便，發(fā)熱，腹瀉次數(shù)及病程較未使用患兒輕，本研究發(fā)現(xiàn)使用RV疫苗干預(yù)后再次感染的以混合感染病例居多，這表明疫苗有一定的保護(hù)作用，但目前疫苗保護(hù)具有局限性。曹兵等[25]研究表明我國蘭州羊RV疫苗對RV腹瀉的保護(hù)效果為72%，對嚴(yán)重RV性腹瀉的保護(hù)效果為70%。目前國內(nèi)對使用疫苗干預(yù)再感染的研究報道較少，需要進(jìn)一步深入研究以了解干預(yù)治療后對臨床的影響。

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