[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系萃取葡萄皮渣中齊墩果酸

張挺峰，張喜峰*，張芬琴

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

甘肅河西走廊地處北緯36～40°，具有種植葡萄尤其是釀造葡萄的最佳光、熱、水、土資源組合狀態(tài)。在葡萄酒加工過(guò)程中，產(chǎn)生約占葡萄加工量20%～30%的皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前，已從葡萄皮渣中提取到多種多酚類物質(zhì)（如天然花色苷類、原花青素、白藜蘆醇、齊墩果酸等成分[1]），其中齊墩果酸為五環(huán)三萜類化合物，具有護(hù)肝降酶[2]、降脂降糖[3]、抗突變[4]、抗癌及增強(qiáng)免疫[5]等作用。由于齊墩果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難人工合成，多從天然產(chǎn)物中提取制得。因此，開(kāi)展葡萄皮渣的綜合利用，不僅可以獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益，而且能夠有效地減輕環(huán)保壓力，獲得巨大的社會(huì)效益。

目前齊墩果酸提取方法主要有乙醇回流法[6]、微波輔助提取法[7]、超聲波輔助提取法[8]、超臨界萃取法[9]等。這些提取方法或存在提取效率較低、溶劑殘留、毒性較大，或存在設(shè)備要求高、能耗高、成本高等缺點(diǎn)。近年來(lái)，由于雙水相萃取技術(shù)具有高效、溫和、操作簡(jiǎn)便、容易放大和能有效保持生物活性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域，涉及到細(xì)胞、膜、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等生物產(chǎn)品以及其他天然藥物有效成分的分離和純化[10-13]。但傳統(tǒng)的雙水相體系具有原料成本較高、高聚物回收利用困難等缺點(diǎn)。隨著對(duì)雙水相技術(shù)研究的不斷深入，離子液體-鹽雙水相體系（ionic liquid-aqueous two phase system，IL-ATPS）具有使用溫度及酸度范圍寬、黏度相對(duì)較低、分相迅速、界面清晰、萃取過(guò)程不發(fā)生乳化現(xiàn)象、選擇性和專一性較高、不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，利用這項(xiàng)技術(shù)可為從天然植物中提取有效活性成分開(kāi)辟一條嶄新的思路。

本研究以葡萄皮渣為原料，采用離子液體雙水相體系萃取葡萄皮中齊墩果酸，分別對(duì)1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate，[Bmim]BF4）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取溫度、pH值、低級(jí)醇添加量對(duì)齊墩果酸萃取率的影響進(jìn)行了研究，以期為葡萄皮渣資源深層次開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄皮渣：取甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄皮渣。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；香草醛、冰乙酸：天津百世化工有限公司；無(wú)水乙醇：安徽安特食品股份有限公司；丙酮、濃鹽酸：北京化工廠；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[Bmim]BF4）：中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；硫酸鈉（Na2SO4）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；異丙醇、正丁醇、甲醇：上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL-203型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XO-SM5O型超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；722型分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。雷磁PHSJ-5型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 齊墩果酸粗提取物的制備

準(zhǔn)確稱取50 g葡萄皮渣粉末，以1∶10（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，在超聲波反應(yīng)系統(tǒng)（325 W、25 kHz）中超聲5 min，5 000 r/min離心10 min，上清液為含齊墩果酸粗提液，對(duì)其進(jìn)行減壓濃縮，真空干燥，得到葡萄皮齊墩果酸粗提取物。

1.3.2 雙水相萃取方法[14]

稱取一定量[Bmim]BF4、Na2SO4、葡萄皮齊墩果酸粗提物、蒸餾水于小燒杯中，使雙水相體系總質(zhì)量為10.00 g，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，并調(diào)節(jié)體系pH值，靜置10 min，兩相達(dá)到相分離，葡萄皮渣齊墩果酸富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，測(cè)定葡萄皮渣齊墩果酸的上下相體積和質(zhì)量濃度，其相比R、分配系數(shù)K及萃取率Y的計(jì)算公式如下：

式中：R為相比；Vt、Vb分別為上、下相體積，mL。

式中：K為分配系數(shù)；Ct、Cb分別為上、下相齊墩果酸質(zhì)量濃度，μg/mL。

式中：Y為萃取率，%；R為相比；K為分配系數(shù)。

1.3.3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15]及含量測(cè)定方法

精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g，置于250 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL置于具塞試管中，于80 ℃水浴上揮去乙醇，按香草醛-高氯酸法顯色，用乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)547 nm處測(cè)定吸光度值。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.036 2x-0.001 2（R2=0.999 5），根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中齊墩果酸含量。

1.3.4 [Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系的確定

通過(guò)測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的[Bmim]BF4和Na2SO4組成的雙水相體系對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸萃取率和分配系數(shù)的影響，確定雙水相體系的組成。

1.3.5 葡萄皮渣齊墩果酸萃取因素的確定

在確定了雙水相體系組成后，分別研究齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取溫度、體系pH值、低級(jí)醇對(duì)齊墩果酸萃取率和分配系數(shù)的影響，進(jìn)而確定葡萄皮渣齊墩果酸的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 [Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系中，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16%、18%、20%、22%、24%的[Bmim]BF4，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的Na2SO4組成雙水相體系，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 [Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.1 Effect of [Bmim]BF4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖1可知，隨著[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，葡萄皮渣中齊墩果酸萃取率Y和分配系數(shù)K都增加，當(dāng)[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到18%時(shí)，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K均達(dá)到最高，分別為96.23%和16.21，此后，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K都明顯下降，這是因?yàn)殡x子液體[Bmim]BF4咪唑環(huán)上有π電子體系能夠與齊墩果酸π電子形成π-π相互作用，促使齊墩果酸轉(zhuǎn)移至離子液體相中。當(dāng)離子液體[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大（＞18%）時(shí)，黏度增加，影響兩相傳質(zhì)。因此，選用[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系中，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%、14%、16%、18%、20%的Na2SO4，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的[Bmim]BF4組成雙水相體系，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，齊墩果酸在離子液體雙水相中萃取率Y和分配系數(shù)K均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，下相結(jié)構(gòu)性逐漸增強(qiáng)，而富含離子液體的上相結(jié)構(gòu)性較差，更容易形成空腔來(lái)容納齊墩果酸[18]。當(dāng)Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到16%時(shí)，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K均達(dá)到最高，分別為96.92%和15.1。當(dāng)Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞16%以后，可能由于鹽析作用，造成萃取率Y和分配系數(shù)K下降。因此，選用Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.2 Effect of Na2SO4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

2.3 齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入齊墩果酸使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%、14%、16%，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 齊墩果酸對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.3 Effect of oleanolic acid concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖3可知，隨著齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，齊墩果酸萃取率Y和分配系數(shù)K逐漸增加，當(dāng)齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K達(dá)到最大值，分別為95.89%和15.85。齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞10%，萃取率Y和分配系數(shù)K呈明顯下降趨勢(shì)，這可能是齊墩果酸在離子液體相溶解已經(jīng)達(dá)到飽和，從而增加了它在鹽相中溶解量，導(dǎo)致萃取率Y和分配系數(shù)K的下降。因此，選用齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 萃取溫度對(duì)葡萄皮中齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%齊墩果酸，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下攪拌使兩相充分混勻，考察萃取溫度對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 萃取溫度對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖4可知，隨著萃取溫度的逐漸升高，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K逐漸下降，這可能是陰離子BF4-1在較高溫度條件下發(fā)生水解，導(dǎo)致[Bmim]BF4在離子液體相中的濃度降低，從而導(dǎo)致齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K逐漸下降。在室溫條件下，陰離子BF4幾乎不發(fā)生水解，該結(jié)果與ZAFARANI-MOATTAR M T等[19]研究結(jié)果是一致的，在萃取溫度為25 ℃時(shí)，齊墩果酸的Y和K達(dá)到最大值，分別為95.2%和17.95。因此，選用萃取溫度為25℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 pH對(duì)葡萄皮中齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%齊墩果酸，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)體系pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察體系pH對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 p H對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.5 Effect of pH on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖5可知，隨著體系pH逐漸升高，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數(shù)K先增大后減小，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，萃取率Y和分配系數(shù)K達(dá)到最大值，分別為93.69%和15.49。主要原因是隨著pH變化，齊墩果酸和離子液體之間靜電平衡被破壞，因齊墩果酸為一元有機(jī)弱酸HA，易導(dǎo)致有機(jī)酸解離HA≒H++A-，為使分子形式的齊墩果酸存在于離子液體相，電離平衡必須向左進(jìn)行，因此，雙水相體系必須有一個(gè)酸性環(huán)境。因此，選擇體系pH值為4.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.6 低級(jí)醇對(duì)葡萄皮中齊墩果酸萃取率效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%齊墩果酸，分別加入體積分?jǐn)?shù)為2%的甲醇、無(wú)水乙醇、異丙醇和正丁醇，調(diào)節(jié)體系pH值為4.0，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌至兩相充分混勻，考察低級(jí)醇對(duì)葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 低級(jí)醇對(duì)齊墩果酸萃取效果的影響Fig.6 Effect of short-chain alcohol on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖6可知，在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4體系中，與不加醇比較，無(wú)水乙醇的加入使得萃取率Y和分配系數(shù)K最大，分別為97.86%和16.29。這可能是[Bmim]BF4的極性與無(wú)水乙醇最為相似，而甲醇、異丙醇、正丁醇的加入反而使得萃取率Y和分配系數(shù)K降低，是由于低級(jí)醇的加入，取代了體系中的一部分水，使相間界面張力及電位差發(fā)生了變化，從而改變了齊墩果酸在兩相間的分配。因此，選擇在[Bmim]BF4-Na2SO4體系中加入體積分?jǐn)?shù)2%無(wú)水乙醇。

3 結(jié)論

采用[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系萃取葡萄皮中齊墩果酸，考察了[Bmim]BF4、Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取溫度、pH、低級(jí)醇對(duì)葡萄皮齊墩果酸萃取過(guò)程中分配系數(shù)K及萃取率Y的影響，確定離子液體雙水相萃取葡萄皮中齊墩果酸的最佳條件：在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，室溫（25 ℃）條件下，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%齊墩果酸、體積分?jǐn)?shù)2%無(wú)水乙醇，調(diào)節(jié)體系pH 4.0，齊墩果酸萃取率Y為97.9%，分配系數(shù)K為16.58。

離子液體雙水相萃取技術(shù)具有體系相間張力較低、分離條件溫和、可控制乳化現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，使得離子液體/鹽雙水相的實(shí)際應(yīng)用更具現(xiàn)實(shí)可能性，有望開(kāi)辟萃取技術(shù)應(yīng)用的新途徑。但人們對(duì)分離體系中各組分在離子液體-雙水相體系（IL-ATPS）中的相互作用、各組分的分配情況及其機(jī)理的了解還不深入和全面，因此迫切需要對(duì)萃取分離方面進(jìn)行系統(tǒng)的理論和應(yīng)用研究，使之形成完善的體系。

[1]高昌勇.釀酒葡萄皮渣色素提取及穩(wěn)定性測(cè)定[J].中國(guó)釀造，2010，29（4）：127-130.

[2]羅 奕，劉 文.齊墩果酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝纖維損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥師，2014，17（3）：378-381.

[3]李文良，陳 劍，馬 麗，等.齊墩果酸衍生物的合成及其降血糖活性研究[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2014，24（1）：7-13.

[4]郭艷瑩，吳勃巖，董 靜，等.齊墩果酸與環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)H-22 荷瘤小鼠P53 突變及TNF-α的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014，42（3）：32-33.

[5]蘇春華，程克光，初相伍，等.齊墩果酸-α-氨基膦酸酯衍生物的合成與抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（8）：123-128.

[6]許海燕，鄭伶俐，多本加，等.響應(yīng)面法優(yōu)化秦嶺龍膽有效成分的提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（15）：31-34.

[7]楊艷俊，王一洋.微波輔助法提取景天三七中齊墩果酸的工藝研究[J].北方園藝，2014（10）：152-155.

[8]蔣珍菊，王周玉.超聲波輔助提取女貞子有效成分及其含量分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）：819-820.

[9]來(lái)海中，馬 龍，王 艷，等.葡萄皮渣中齊墩果酸超臨界萃取工藝研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（11）：1549-1550.

[10]LIU X,MU T,SUN H,et al.Optimisation of aqueous two-phase extraction of anthocyanins from purple sweet potatoes by response surface methodology[J].Food Chem,2013,141(3):3034-3041.

[11]JIANG B,LI Z G,DAI J Y,et al.Aqueous two-phase extraction of 2,3-butanediol from fermentation broths using an ethanol/phosphate system[J].Process Biochem,2009,44(1):112-117.

[12]ZHI W,DENG Q.Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous two-phase system by counter-current chromatography[J].J Chromatogr A,2006,1116(1):149-152.

[13]RITO-PALOMARES M.Practical application of aqueous two-phase partition to process development for the recovery of biological products[J].J Chromatogr B,2004,807(1):3-11.

[14]曹 婧，范杰平，孔 濤，等.兩種離子液體雙水相體系萃取葛根素的比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）：1589-1590.

[15]朱沛沛，楊 鵬，郝 歡，等.響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子中齊墩果酸提取工藝的研究[J].杭州化工，2013，43（2）：20-23.

[16]曹 婧.離子液體/鹽雙水相體系萃取分離葛根素研究[D].南昌：南昌大學(xué)碩士論文，2010.

[17]陳梅梅，袁 磊，高 梅，等.離子液體雙水相提取菜籽粕蛋白及其相行為的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（6）：56-61.

[18]戈延茹，潘 如，傅海珍，等.離子液體雙水相溶劑浮選法分離/富集桑黃黃酮類成分[J].分析化學(xué)，2012，40（2）：317-320.

[19]ZAFARANI-MOATTAR M T,HAMZEHZADEH S.Phase diagrams for the aqueous two-phase ternary system containing the ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium bromide and tri-potassium citrate at T=(278.15,298.15,and 318.15)K[J].J Chen Eng Data,2009,54(3):833-841.