白蛋白發(fā)酵液大孔樹脂法脫色過程研究

李辰雨，戰(zhàn)偉超，單守水，林 劍，徐世艾*

（1.煙臺大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

人血清白蛋白（human serum albumin，HAS）是臨床應(yīng)用較多的一種蛋白質(zhì)，目前臨床使用的人血清白蛋白大多來自人類血漿[1]。80年代以來，人們通過基因工程技術(shù)使人血清白蛋白在細(xì)菌等宿主中得到表達(dá)[2-5]，其中，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最廣，在白蛋白純化方面，目前多采用超濾法、離子交換法[6]等方法。由于分離純化過程中色素難以除去，為白蛋白分離純化增加難度，對于發(fā)酵液中色素除去的基礎(chǔ)理論方面的研究則鮮見報道。選用LS-305、LS-610B、SP-207、HP-20和DM-21五種大孔吸附樹脂，進(jìn)行樹脂預(yù)選、靜態(tài)吸附試驗和動態(tài)吸附試驗。研究了發(fā)酵液中的色素在大孔樹脂上的靜態(tài)吸附動力學(xué)和動態(tài)吸附動力學(xué)行為，討論了發(fā)酵液中的色素在Langmuir方程和Freundlich方程擬合程度的熱力學(xué)過程，一階動力學(xué)模型、二階動力學(xué)模型和粒子內(nèi)擴(kuò)散模型對靜態(tài)吸附動力學(xué)過程的影響，及動態(tài)吸附過程的脫色率，并檢測整個吸附過程的蛋白質(zhì)的損失率，為樹脂吸附法除去發(fā)酵液中的色素從而為從發(fā)酵液中分離純化白蛋白的工程應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤氏酵母（Pichia pastoris）：山東大學(xué)；8萬u分子質(zhì)量聚砜超濾膜：上海摩速科學(xué)器材有限公司；牛血清蛋白：北京索萊寶科技有限公司；LS-305樹脂、LS-610B樹脂：陜西藍(lán)深特種樹脂有限公司；SP-207、HP-20樹脂：日本三菱化學(xué)公司；DM-21樹脂：山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司；各樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見表1。

表1 樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Physical structure parameters of resins

1.2 儀器與設(shè)備

YC-2層析實驗冷柜：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RO-NF-VF-40實驗室用膜分離設(shè)備：上海摩速科學(xué)器材有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；AR1530電子天平：奧豪斯儀器有限公司；SPH-2102B振蕩培養(yǎng)器：上海智械儀器制造有限公司；Anke TDL-5-4臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

首先將發(fā)酵液離心處理20 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min；然后將上清液超濾處理，將透過分子質(zhì)量為8萬u膜的液體作為樹脂脫色的溶液。

1.3.2 樹脂的預(yù)處理

首先將樹脂用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡24 h，用去離子水洗幾次；然后將樹脂用1 mol/L氫氧化鈉浸泡5 h，用蒸餾水洗至中性；隨后將樹脂用1 mol/L鹽酸浸泡5 h；用蒸餾水洗至中性；最后用濾紙吸去樹脂表面的水，將這種處理的樹脂稱為濾紙片干（filter paper dried，F(xiàn)PD）樹脂。FPD樹脂經(jīng)過80 ℃恒溫干燥12 h，樹脂質(zhì)量恒定時稱為干樹脂。研究全部使用FPD樹脂的質(zhì)量為基準(zhǔn)，計算全部使用干樹脂的質(zhì)量為基準(zhǔn)。

1.3.3 發(fā)酵液中色素特征吸收波長的測定

首先將發(fā)酵液稀釋10倍，然后將稀釋后的發(fā)酵液在350～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定發(fā)酵液中色素的特征吸收波長λt。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定

用考馬斯亮藍(lán)法作為蛋白質(zhì)含量的測定方法。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備見參考文獻(xiàn)[7]。以牛血清蛋白質(zhì)含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=188.26x-1.647 3（R2=0.998 6），根據(jù)回歸方程計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 樹脂的預(yù)選

預(yù)先稱取5 種FPD 樹 脂LS-610B、LS-305、SP-207、HP-20、DM-21（5.35 g、5.45 g、4.85 g、4.35 g、4.27 g）（相當(dāng)于1 g干樹脂）分別加入到具塞錐形瓶（300 mL）中，并加入初始濃度（以吸光度值計）相同（1.704）發(fā)酵液到錐形瓶中各100 mL，然后放入到振蕩培養(yǎng)器（20 ℃、220 r/min）進(jìn)行吸附8 h，用紫外分光光度計測定發(fā)酵液中色素的吸光度值，并測定蛋白質(zhì)的吸光度值（在595 nm波長條件下測定），評估其色素脫色率和蛋白質(zhì)損失率。色素脫色率和蛋白質(zhì)損失率計算公式如下：

式中：A0是發(fā)酵液脫色前的吸光度值；Aa發(fā)酵液脫色后的吸光度值。

式中：C0、C分別為脫色前后蛋白質(zhì)含量，μg。

1.3.6 不同pH值對吸附性能的試驗

預(yù)先稱取2 種FPD 樹 脂LS-610B、LS-305（5.35 g、5.45 g），分別加入到具塞錐形瓶（300 mL）中，并加入100 mL不同pH值（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）初始濃度（0.276）相同的發(fā)酵液，然后放入到振蕩培養(yǎng)器（20 ℃、220 r/min）進(jìn)行吸附8 h，用紫外分光光度計測定發(fā)酵液中色素的吸光度值，并測定蛋白質(zhì)的吸光度值，評估其色素脫色率和蛋白質(zhì)損失率。

1.3.7 靜態(tài)吸附等溫線試驗

預(yù)先稱取2 種FPD 樹 脂LS-610B、LS-305（5.35 g、5.54 g），分別取pH值為6.0不同初始濃度（0.732、1.303、1.643、1.911、2.201）的發(fā)酵液100 mL加入到具塞錐形瓶（300 mL）中。然后將錐形瓶放入到振蕩培養(yǎng)器（20 ℃、220 r/min）中，充分吸附8 h。用紫外分光光度法測吸光度值，并用以下公式計算色素吸附容量。

式中：qe是平衡時樹脂的吸附容量，△AV/g；C0是料液初始濃度（以吸光度值計）；Ce是料液平衡濃度（以吸光度值計）；V是料液的體積，mL；W是干樹脂質(zhì)量，g。

1.3.8 靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗

預(yù)先稱取2 種FPD 樹 脂LS-610B、LS-305（5.35 g、5.54 g），分別加入到具塞錐形瓶（300 mL）中，并加入pH值為6.0，初始濃度（1.704）相同發(fā)酵液各100 mL，然后將錐形瓶放入到振蕩培養(yǎng)器（20 ℃、220 r/min）中，在不同時間取樣，并用紫外分光光度法測定色素吸光度值，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，直至吸附平衡。樹脂吸附容量按以下公式計算：

式中：qt是時間t樹脂的吸附容量，△AV/g；C0是料液初始濃度（以吸光度值計）；Ct是料液在時間t的濃度（以吸光度值計）；V是料液的體積，mL；W是干樹脂質(zhì)量，g。

1.3.9 動態(tài)吸附試驗

根據(jù)靜態(tài)試驗，樹脂LS-610B被選擇進(jìn)行動態(tài)試驗。動態(tài)吸附試驗按以下方法：

預(yù)處理好的大孔樹脂被裝入到玻璃柱（20 cm×1.6 cm）中，為20 mL，然后用去離子水以3倍柱床體積（bed volumn，BV）洗脫大孔樹脂。然后上樣pH為6.0，用紫外分光光度計檢測發(fā)酵液色素吸光度值和蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

發(fā)酵液中色素在350～900 nm 波長范圍內(nèi)的掃描結(jié)果如圖1所示，圖1表明發(fā)酵液在波長380 nm處有特征吸收，故將波長380 nm作為測定發(fā)酵液中色素的吸光度的最佳波長。

圖1 發(fā)酵液中色素紫外可見光吸收曲線Fig.1 UV absorption curve of pigment in the fermentation broth

2.2 樹脂的預(yù)選

5種FPD樹脂LS-610B、LS-305、SP-207、HP-20、DM-21吸附量及蛋白質(zhì)損失率結(jié)果見表2。

表2 不同樹脂的吸附性質(zhì)Table 2 Adsorption properties of different resins

由表2可以看出，LS-610B樹脂與LS-305樹脂吸附容量相對高于另外3種樹脂，且蛋白損失率相對較低，故選取LS-610B和LS-305作為發(fā)酵液靜態(tài)吸附脫色樹脂。

2.3 不同pH值對吸附性能的影響

不同pH值下LS-610B和LS-305樹脂的吸附容量與蛋白質(zhì)損失率，結(jié)果見表3。由表3可知，2種樹脂pH 6.0時較其他pH值時，色素吸附效果好，蛋白損失率較低。故以LS-610B和LS-305樹脂脫色時，發(fā)酵液pH 6.0為宜。

表3 不同pH值的大孔樹脂吸附參數(shù)Table 3 Adsorption parameters of macroporous resins with different pH

2.4 靜態(tài)吸附等溫線

兩種普遍的理論模型（Langmuir模型和Freundlich模型）被用來比較大孔樹脂的等溫吸附[8]。

Langmuir方程：

Freundlich模型：

式中：qe是平衡吸附量，△AV/g；qmax是最大吸附容量，△AV/g；ce是平衡時發(fā)酵液中色素濃度（以吸光度值計）；KL是Langmuir常數(shù)；KF和n 是Freundlich常數(shù)。

圖2表示兩種樹脂在20 ℃下發(fā)酵液中色素靜態(tài)吸附等溫線，Langmuir模型中的KL和qmax通過ce/qe和ce的線性關(guān)系擬合得到。Freundlich模型中的KF和n通過log（qe）和log（ce）的線性擬合得到。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理及相關(guān)系數(shù)R2的值見表4。

圖2 兩種樹脂在20℃下對發(fā)酵液中色素的靜態(tài)吸附等溫線Fig.2 Static adsorption isotherms of pigment in the fermentation broth by two kinds of resins at 20℃

由表4可知，比較相關(guān)系數(shù)R2，實驗數(shù)據(jù)較好符合Langmuir模型，比較最大吸附容量qmax（Langmuir模型）LS610B＞LS305，原因可能是LS610B的比表面積大于LS305的比表面積。所以兩種樹脂的吸附等溫線更符合Langmuir模型，LS610B的最大吸附量計算值為123.00△AV/g。

表4 在20℃下Langmuir和Freundlich吸附等溫方程參數(shù)Table 4 The parameters of adsorption isothermal equation from Freundlich and Langmuir at 20℃

2.5 靜態(tài)吸附動力學(xué)性質(zhì)

LS305和LS610B兩種樹脂在20 ℃下吸附容量（qt）隨時間（t）的變化趨勢，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，在8 h之內(nèi)LS305和LS610B兩種樹脂達(dá)到吸附平衡。LS610B吸附容量比LS305的吸附容量高10△AV/g左右，LS610B在吸附過程中蛋白質(zhì)的損失率比LS305吸附過程中蛋白質(zhì)的損失率高0.5%左右。

圖3 兩種樹脂在20℃下對發(fā)酵液中色素的吸附動力學(xué)曲線及蛋白質(zhì)損失率Fig.3 Kinetic curves of the pigment in the fermentation broth and the protein loss rate by two kinds of resins at 20℃

吸附容量與時間的數(shù)據(jù)按照一階動力學(xué)模型[9]、二階動力學(xué)模型[10]和顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型[11]進(jìn)行處理。

一階動力學(xué)模型：

動力學(xué)參數(shù)計算結(jié)果見表5。由表5可知，從二階動力學(xué)模型中的相關(guān)系數(shù)（R2）略高于一階動力學(xué)模型中的相關(guān)系數(shù)（R2），而且二階動力學(xué)模型qe的計算值比一階動力學(xué)模型的計算值更接近與實驗數(shù)據(jù)值。結(jié)果表明，發(fā)酵液中的色素在這兩種樹脂中的吸附動力學(xué)更好的符合二階動力學(xué)模型，相似的結(jié)果已經(jīng)被其他作者所報道[12-14]。

按照二階動力學(xué)模型的速率常數(shù)k2，兩種樹脂的吸附速率大小為：LS610B＞LS305。

表5 在20℃下兩種樹脂動力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters from two resins at 20℃

一階動力學(xué)模型和二階動力學(xué)模型主要考慮粒子外膜擴(kuò)散，內(nèi)部擴(kuò)散和吸附過程的相互作用。雖然粒子擴(kuò)散動力學(xué)模型不能代表整個吸附過程，但可用來解釋一定的吸附原理，且在吸附過程中會造成一定量的蛋白質(zhì)損失，但損失率相對較低，故選取LS-610B作為發(fā)酵液動態(tài)吸附脫色樹脂。

將吸附容量qt與時間t1/2進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖4。由圖4可知，顆粒內(nèi)擴(kuò)散是吸附速率的控制步驟，因為這條線如果經(jīng)過原點，且為直線，說明該過程是單一的顆粒擴(kuò)散速控步驟。由圖4可知，顆粒擴(kuò)散圖形不經(jīng)過原點，也不是直線，證明該過程不是唯一的顆粒擴(kuò)散速控步驟，液膜擴(kuò)散也在一定程度上影響吸附過程。吸附過程包括兩個階段，第一階段（0～2.5 h）屬于逐漸吸附階段，顆粒擴(kuò)散速率很?。坏诙A段（2.5～8.0 h）被認(rèn)為是最終的平衡吸附階段。因此，顆粒擴(kuò)散與液膜擴(kuò)散交互影響色素在LS305和LS610B樹脂上的吸附[15-16]。

二階動力學(xué)模型：

顆粒擴(kuò)散動力學(xué)模型：

式中：qe和qt分別是平衡時的吸附容量和時間t的吸附容量，△AV/g；k1是一階動力學(xué)模型的速率常數(shù)，h-1；k2是二階動力學(xué)模型的速率常數(shù)，g/（△AV·h）；kp是顆粒內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)，△AV/（g·h1/2）；X是常數(shù)。

圖4 兩種樹脂吸附發(fā)酵液中色素的顆粒擴(kuò)散模型Fig.4 Particle diffusion model for adsorption of pigment in fermentation broth by two resins

2.6 動態(tài)吸附試驗

由圖5可以看出，4 BV/h的流速脫色率（進(jìn)料10 BV時約為68%）小于2 BV/h的脫色率（進(jìn)料10 BV時約為81.5%），原因可能是吸附物質(zhì)沒有足夠的時間與發(fā)酵液中色素進(jìn)行相互作用[17]。兩種流速的蛋白質(zhì)損失率相對較低（進(jìn)料4 BV時蛋白質(zhì)損失率約為1%）。故LS-610B可以用于發(fā)酵液分離白蛋白的脫色預(yù)處理。

圖5 不同流速的脫色率及蛋白質(zhì)損失率Fig.5 Decolourization ratio and protein loss rate at different flow rates

3 結(jié)論

通過預(yù)選5種大孔樹脂LS-305、LS-610B、SP-207、HP-20和DM-21，得到大孔樹脂LS305和LS610B吸附容量較大且蛋白損失率較低。又在不同pH值下對大孔樹脂LS305和LS610B進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗，得出發(fā)酵液在pH=6.0下脫色為宜。靜態(tài)吸附等溫線試驗表明，試驗數(shù)據(jù)在Langmuir 吸附等溫線模型有較高的相關(guān)系數(shù)，靜態(tài)吸附試驗表明，試驗數(shù)據(jù)在二階動力學(xué)模型有較高的相關(guān)系數(shù)。顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型能較好的描述發(fā)酵液中色素在這兩種樹脂上的吸附動力學(xué)，說明顆粒內(nèi)擴(kuò)散不是唯一的控制步驟，吸附速率還受液膜擴(kuò)散的影響。最后對大孔樹脂LS610B進(jìn)行動態(tài)吸附試驗，試驗表明，在上柱液pH值為6.0，流速2 BV/h，進(jìn)料體積10 BV條件下，發(fā)酵液脫色率約81.5%，蛋白質(zhì)損失率約3%。因此，大孔樹脂LS610B可以用于白蛋白發(fā)酵液脫色處理。

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