豆瓣中腐敗菌蠟樣芽孢桿菌性能及對(duì)抗生素敏感性研究

董 丹，車(chē)振明，楊 娜，周欣悅，關(guān)統(tǒng)偉*

（西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）又名仙人掌桿菌，是芽孢桿菌屬中的一種[1]，分布廣泛，常見(jiàn)于土壤、灰塵和污水中，在植物性食品和許多生熟食品中都常見(jiàn)；是一種好氧性、在厭氧情況下也可很好生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性桿菌[2]。有的蠟樣芽孢桿菌菌株可作為益生菌添加到食品和飼料中；有的菌株則為條件致病菌，容易污染食物，引起人畜腸道疾病，甚至嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染[3]。蠟樣芽孢桿菌存在于生活中的各個(gè)地方，如冷藏不當(dāng)?shù)氖澄?、飲水、空氣中等[4-7]。蠟樣芽孢桿菌對(duì)人體造成危害的方式主要是通過(guò)食物進(jìn)入人體，在人體內(nèi)產(chǎn)生毒素。有的菌株能產(chǎn)生耐熱的催吐毒素，引起嘔吐。剩飯冷藏不當(dāng)后容易產(chǎn)生很多蠟樣芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入人體后或有8～16 h的潛伏期，若食用放置過(guò)久的剩飯易出現(xiàn)胃痛、嘔吐癥狀[8-10]，這就是常見(jiàn)的蠟樣芽孢桿菌中毒。此外，人體發(fā)生食物中毒，也可能是由蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性毒素所造成的?；谝陨蠁?wèn)題，本研究通過(guò)檢測(cè)豆瓣中分離蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性以及抗生素敏感性能更好地了解蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境。根據(jù)這些生長(zhǎng)特性，可以在豆瓣生產(chǎn)過(guò)程中更好地控制生產(chǎn)條件，從而抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，保證豆瓣醬的安全性；此外，在日常生活中也可以利用其生長(zhǎng)特性來(lái)預(yù)防食物因蠟樣芽孢桿菌造成的食物中毒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用菌株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為郫縣豆瓣醬中分離所得，編號(hào)ZZ1001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、氯化鈉、瓊脂：成都市科龍劑化工廠。

抗菌藥物：本實(shí)驗(yàn)共選用25種常用藥敏試紙，分別為鏈霉素、慶大霉素、青霉素G、可奇霉素、林克霉素、多粘菌素B、奈替米星、奈替米星、呋喃妥因、新生霉素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、妥布霉素、克林霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、諾氟沙星、頭孢噻胯、利福平：杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂1.5 g，水100 mL，調(diào)整pH值至7.2～7.6。

LB培養(yǎng)基（固態(tài)）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SC-316海爾立式冷藏柜：青島海爾特種電冰柜有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TB-214電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蠟樣芽孢桿菌在不同溫度條件下生長(zhǎng)研究

菌種的活化：將保存在-20 ℃下的甘油管放置于4 ℃條件下解凍，待甘油完全融化過(guò)后，迅速吸取100 μL的菌種保存液于LB培養(yǎng)基上，用涂布棒在無(wú)菌條件下涂布均勻后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出明顯的菌落。

將活化蠟樣芽孢桿菌用無(wú)菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無(wú)菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用涂布棒均勻涂布，再分別置于5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[11]，每個(gè)溫度下做3個(gè)平行，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況并計(jì)算各個(gè)培養(yǎng)基上菌落數(shù)，并計(jì)算不同溫度條件下每個(gè)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下生長(zhǎng)研究

將活化蠟樣芽孢桿菌用無(wú)菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無(wú)菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至0.02%的鹽酸以及0.005%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)的pH值分別為3.0、4.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、10.0、11.0的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)pH值條件下做3個(gè)平行，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況并計(jì)數(shù)各個(gè)pH值培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并計(jì)算各個(gè)pH值條件下菌落數(shù)的平均值。

1.3.3 蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下生長(zhǎng)研究

將活化蠟樣芽孢桿菌用無(wú)菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無(wú)菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的牛肉膏蛋白胨養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)鹽含量條件下做3個(gè)平行，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況并計(jì)數(shù)各個(gè)鹽濃度下培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并計(jì)算每個(gè)鹽含量下菌落數(shù)的平均值。

1.3.4 蠟樣芽孢桿菌的藥敏性研究[12]

將活化蠟樣芽孢桿菌用無(wú)菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無(wú)菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并用無(wú)菌鑷子夾取含有抗生素片的藥敏片均勻放在平板上，每個(gè)平板放置5種藥片[13]。再分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生。

1.3.5 菌落計(jì)數(shù)方法

實(shí)驗(yàn)中菌落數(shù)的計(jì)算參考GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌在不同溫度條件下生長(zhǎng)狀況

經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)之后，蠟樣芽孢桿菌ZZ1001在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)菌株ZZ1001生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of strain ZZ1001

由圖1可知，菌株ZZ1001在5～35 ℃條件下，隨著溫度的升高，菌落數(shù)增加，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)溫度從35 ℃升至55 ℃時(shí)，菌落數(shù)急劇下降。因此，可認(rèn)為菌株生長(zhǎng)的最適溫度是35 ℃左右，當(dāng)溫度＜5 ℃或＞55 ℃時(shí)，菌株不生長(zhǎng)。

2.2 蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下生長(zhǎng)情況

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)菌株ZZ1001生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on the growth of strain ZZ1001

由圖2可知，菌株ZZ1001在pH值3.0～7.0范圍內(nèi)隨著pH值的升高，菌落數(shù)逐漸增多，在pH值達(dá)到7.0時(shí)菌株生長(zhǎng)最佳，當(dāng)pH在7.0～10.0，菌落的生長(zhǎng)急劇降低，且在pH＞10.0或＜3.0時(shí)，菌株停止生長(zhǎng)，故菌株ZZ1001的最適生長(zhǎng)pH值為7.0。

2.3 蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下生長(zhǎng)情況

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖3。

圖3 鹽含量對(duì)菌株ZZ1001生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of salt concentration on the growth of strain ZZ1001

由圖3可知，菌株ZZ1001在鹽含量2%時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最大值，隨著鹽含量的增大，菌落數(shù)逐漸降低，在鹽含量為10%時(shí)菌株停止生長(zhǎng)。故菌株ZZ1001的最適鹽含量為2%。

2.4 蠟樣芽孢桿菌的藥敏性研究結(jié)果

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，菌株ZZ1001在不同抗生素抗性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株抗藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of strain resistance experiment

從試驗(yàn)結(jié)果可得：多粘霉素、林可霉素、氨芐西林、羧芐霉素這幾種抗生素對(duì)菌株ZZ1001的生長(zhǎng)抑制情況非常弱；復(fù)方霉素、萘啶酸、四環(huán)素、利福平這幾種抗生素對(duì)菌株ZZ1001的生長(zhǎng)具有稍微的抑制情況；慶大霉素、新生霉素、妥布霉素、鏈霉素、氧氟沙星、頭孢西丁、卡那霉素、環(huán)丙霉素、青霉素G、呋喃妥因、諾氟沙星、氯霉素、克林霉素這幾種抗生素對(duì)菌株ZZ1001的生長(zhǎng)抑制稍強(qiáng)；奈替米星、頭孢噻肟、紅霉素、阿奇霉素這幾種抗生素對(duì)菌株ZZ1001的生長(zhǎng)抑制最強(qiáng)。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌作為食品腐敗菌，存在于各種食品中，對(duì)人體健康帶來(lái)了巨大的隱患。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，為了更好的防止蠟樣芽孢桿菌的滋生，可以通過(guò)改變環(huán)境溫度、pH值及鹽含量對(duì)其控制。在環(huán)境溫度＜5 ℃或＞55 ℃時(shí)或pH值＞10或＜3時(shí)蠟樣芽孢幾乎不生長(zhǎng)。在鹽含量＞5%時(shí)不生長(zhǎng)，＜5%時(shí)生長(zhǎng)緩慢，而鹽含量的高低會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，高鹽環(huán)境下由于細(xì)胞膜的滲透作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)離子的流失，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞失水死亡，因此食品在食用前進(jìn)行加熱處理可以很好的殺死蠟樣芽孢桿菌[14-16]，合理的控制鹽濃度也是防止腐敗菌生長(zhǎng)的一種方法。25種試驗(yàn)抗生素中，有21種對(duì)蠟樣芽孢桿菌都具有抗性，如紅霉素、阿奇霉素等。因此，這對(duì)于醫(yī)藥上研制蠟樣芽孢桿菌引起的各種疾病的針對(duì)藥物提供了理論依據(jù)[17]。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)或殺滅蠟樣芽孢桿菌提供了理論依據(jù)，也為豆瓣產(chǎn)品品質(zhì)的控制提供基礎(chǔ)。

[1]周幗萍，袁志明.蠟樣芽孢桿菌污染及其對(duì)食品安全的影響[J].食品科學(xué)，2007，28（3）：357-361.

[2]SCHOENI J L.Bacillus cereusfood poisoning and its toxins[J].J Food Prot,2005,68(3):636-648.

[3]OZAWA K.Sepsis and meningoencephalitis caused byBacillus cereusin a patient with myelodysplastic syndrome[J].Internal Med,2013,52(17):1987-1990.

[4]白鳳翎，馬春穎，劉 巖，等.食品中微生物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性研究[J].食品科學(xué)，2006，11（5）：17-18.

[5]余傳萍，王 彬.由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒分析[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志，2005，3（11）：1121-1124.

[6]楊潔彬.食品微生物學(xué)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

[7]陳 順，孫翠煥，冀寶營(yíng).蠟狀芽孢桿菌LW9809 發(fā)酵條件研究[J].微生物學(xué)雜志，2002（5）：45-47.

[8]LUCA C,PAOLA D,KALLIOPI R.Biodiversity and dynamics of meat fermentations:The contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem[J].Meat Sci,2011,89(1):296-302.

[9]CHEN Q,WEI S,DENG Z,et al.Optimization of DNA extraction from seeds of sorghum sudanense(Piper) Stapf[J].Not Bot Hort Agrobot Cluj,2009,37(1):256-260.

[10]MISHRA M K,RAN N S,RAM A S,et al.A simple method of DNA extraction from coffee seeds suitable for PCR analysis[J].Afr J Biotechnol,2008,7(4):409-413.

[11]周家春.食品工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工藝出版社，2003.

[12]曹偉平，馮書(shū)亮，楊更亮，等.抗生素類(lèi)作為防腐劑對(duì)蘇云金桿菌芽孢及伴胞晶體的影響[J].微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（6）：35-41.

[13]林 毅，陳風(fēng)義，劉 琳，等.蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)青霉素酶的研究進(jìn)展[J].河北工業(yè)科技，2008，25（2）：125-128.

[14]張艷春，賈鈞輝，鄭 宇，等.兩步控制策略優(yōu)化生防菌B579 芽孢生成條件[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，5（13）：23-26.

[15]曾曉希，周洪波，劉飛飛，等.一株膠質(zhì)芽孢桿菌的篩選和鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，32（3）：246-247.

[16]宜 齊，王 冬.世界各國(guó)的飲用水衛(wèi)生檢測(cè)的微生物限量指標(biāo)[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，6（9）：135-142.

[17]劉建國(guó)，裴 炎，叢 威.蠟狀芽孢桿菌S1 發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2001，31（1）：24-25.