黑花生衣原花色素和花色苷的提取工藝研究

歐陽(yáng)燕林，譚興和 *，王 鋒，郭紅英，鄧潔紅，李 林，張春艷，張 喻

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

黑花生衣中含有原花色素、花色苷、白藜蘆醇、槲皮素等黃酮類化合物，具有很好的保健作用。杜蕾等[1]研究表明，黑花生衣中的原花色素含量達(dá)29.19%，王鋒[2]研究表明，黑花生衣花色苷含量達(dá)4.93 mg/g干質(zhì)量。黑花生衣約占黑花生仁質(zhì)量的3%～4%[2]，在黑花生加工過(guò)程中被剝除，造成資源浪費(fèi)。開發(fā)和利用黑花生衣色素對(duì)資源的綜合利用具有重大意義。

原花色素（proanthocyanidins）又稱原花青素，是黃烷-3-醇衍生物的總稱，由兒茶素和表兒茶素組成，有多種聚合體形式[3]。花色苷（anthocyanin）是花色素的糖苷衍生物，常見的花色素有矢車菊色素、飛燕草色素、天竺葵色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?、錦葵色素等[4]。原花色素和花色苷都是高活性的天然抗氧化劑，原花色素的抗氧化能力是VC的20倍，是VE的50倍[5]。研究表明，原花色素和花色苷都有清除自由基、抗癌、抗心血管疾病、降血脂等作用[6-11]。目前，已運(yùn)用到食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。

響應(yīng)面分析法（response surface method，RSM）可以分析試驗(yàn)指標(biāo)與多個(gè)試驗(yàn)因素間的回歸關(guān)系，是用于優(yōu)化工藝條件的有效分析方法。根據(jù)相關(guān)研究，原花色素和花色苷的提取工藝條件相似，故本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法同時(shí)優(yōu)化黑花生衣原花色素和花色苷的提取工藝參數(shù)，使提取液中原花色素和花色苷的含量同時(shí)達(dá)到最大，節(jié)約分別提取的成本。本試驗(yàn)研究同時(shí)提取黑花生衣原花色素和花色苷的工藝條件，旨在減少提取時(shí)間和提取劑用量，從而提高提取效率，降低成本，減少環(huán)境污染，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑花生衣：湖南省江永縣義華花生制品有限公司；乙醇、甲醇、鹽酸、硫酸等試劑（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SKY-恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；WFJ7200型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花色素、花色苷的提取

黑花生衣磨碎，過(guò)30目篩，準(zhǔn)確稱取0.2 g黑花生衣碎末于50 mL的錐形瓶中，加入一定體積、濃度和pH值的乙醇溶液，用保鮮膜封口，置于一定溫度的恒溫?fù)u床中，遮光，保持搖動(dòng)頻率為120 r/min，振蕩一定的時(shí)間。提取完成后進(jìn)行抽濾，取1/2濾液（按加入的乙醇提取劑體積計(jì)算），經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用水定容至10 mL，測(cè)定花色苷含量，稀釋3倍后測(cè)定原花色素含量。

1.3.2 原花色素含量的測(cè)定

原花色素含量的測(cè)定：采用香草醛-硫酸法測(cè)定，參考SUN B等[12]方法。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.5 mL標(biāo)液，加入2.5 mL 1%香草醛-甲醇溶液，再加入2.5 mL 25%硫酸-甲醇溶液，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定其吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品原花色素含量的測(cè)定：取0.5 mL樣液，加入2.5 mL 1%香草醛-甲醇溶液，再加入2.5 mL 25%硫酸-甲醇溶液，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)1；對(duì)照組：取0.5 mL樣液，加入2.5 mL甲醇，再加入2.5 mL 25%硫酸-甲醇，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0。

原花色素吸光度值A(chǔ)=A1-A0，計(jì)算原花色素含量。原花色素得率計(jì)算公式如下：

式中：c為原花色素質(zhì)量濃度，mg/mL；v為樣液體積，mL；m為樣品黑花生衣質(zhì)量，mg。

1.3.3 原花青素的回收率試驗(yàn)

由于黑花生衣提取液中含有花色苷，呈紅色，原花色素在香草醛和硫酸的作用下也呈紅色，故本試驗(yàn)采取對(duì)照試驗(yàn)消除花色苷引起的誤差。稱取10 mg黑花生衣粗提物粉末，用水定容至10 mL，稀釋一倍后，按上述方法測(cè)定原花色素含量；稱取6.4mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容到10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.64mg/mL溶液。在黑花生衣提取液中加入一定量的原花青素標(biāo)液，測(cè)定原花色素含量。

1.3.4 花色苷含量的測(cè)定

用pH示差法測(cè)定，參考GINSTI M M等[13]方法測(cè)定花色苷的含量。花色苷得率的計(jì)算公式如下：

式中：A為吸光度差值；Mw為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量，449.2；DF為稀釋因子；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，26 900；1為光程，cm。

式中：c為花色苷質(zhì)量濃度，mg/mL；v為樣液體積，mL；m為黑花生衣質(zhì)量，mg。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.2 g黑花生衣碎末于50 mL的錐形瓶中，以黑花生衣中原花色素和花色苷的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察pH值（2、3、4、5、自然）、液料比（30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL∶g））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定pH 3，提取時(shí)間120 min。選擇液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以原花色素得率（Y1）和花色苷得率（Y2）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidin

以原花青素含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.826 0x-0.001 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 8，表明原花青素含量與吸光度值在0.1～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 原花青素的回收率

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the recovery tests

由表2可知，該測(cè)定方法的回收率在99.3%～109.6%，平均回收率為104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.30%，由此可知該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度良好，可以用于測(cè)定原花色素含量，彭芳剛等[14]也用到了此法來(lái)消除其他色素引起的誤差。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 pH對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響

圖2 pH對(duì)原花色素(A)和花色苷(B)提取效果的影響Fig.2 Effect of different pH on the extraction of proanthocyanidins(A) and anthocyanins (B)

由圖2可知，原花色素的得率在pH值為3及5處分別出現(xiàn)峰值，分別為12.883 mg/100 mg、12.047 mg/100 mg，由于原花色素中含有酚羥基，呈弱酸性，因此在pH值較低和接近中性時(shí)，提取效果較好，故適宜的酸性條件有利于原花色素溶出；花色苷得率隨pH上升而下降，在pH值為2時(shí)達(dá)到最高，為0.636 mg/100 mg，原因是花色苷在酸性條件下穩(wěn)定。pH值為3時(shí)花色苷得率下降不明顯，綜合考慮原花色素和花色苷的得率，故選擇pH值為3較為合適。

2.3.2 液料比對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響

圖3 液料比對(duì)原花色素(A)和花色苷(B)提取效果的影響Fig.3 Effect of different liquid-material ratio on the extraction of proanthocyanidins (A) and anthocyanins (B)

由圖3可知，原花色素得率和花色苷得率都隨液料比增加先快速上升，再逐漸趨于平穩(wěn)，都在液料比50∶1（mL∶g）時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，分別為12.883 mg/100 mg、0.610 mg/100 mg。液料比的大小與液固兩相的濃度差（即傳質(zhì)推動(dòng)力）有關(guān)，在提取過(guò)程中，液料比小，則液相濃度增加快，兩相濃度差減少快，故傳質(zhì)推動(dòng)力減弱的速度加快，不利于目標(biāo)物的得率增加[15]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，故選擇液料比50∶1（mL∶g）為宜。

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響

由圖4可知，原花色素得率和花色苷得率都隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先上升后下降，都在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)達(dá)到最大，分別為12.774 mg/100 mg、0.651 mg/100 mg。根據(jù)相似相溶的原理，原因可能是原花色素和花色苷的極性與乙醇水溶液極性接近時(shí)，溶出效果最好[16]；還有可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)低，蛋白質(zhì)、糖類等水溶性物質(zhì)易溶出，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，脂溶性物質(zhì)易溶出，影響原花色素和花色苷溶出[17]。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為宜。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花色素(A)和花色苷(B)提取效果的影響Fig.4 Effect of different ethanol concentration on the extraction of proanthocyanidins (A) and anthocyanins (B)

2.3.4 提取溫度對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響

圖5 提取溫度對(duì)原花色素(A)和花色苷(B)提取效果的影響Fig.5 Effect of different extraction temperature on the extraction of proanthocyanidins (A) and anthocyanins (B)

由圖5可知，原花色素得率隨著溫度的上升先上升后下降，在45 ℃達(dá)到最大，為12.519 mg/100 mg；花色苷得率隨著溫度的上升先上升，然后趨于平穩(wěn)，達(dá)到最大值后下降，在50 ℃達(dá)到最大，為0.612 mg/100 mg。花色苷得率在45 ℃和50 ℃時(shí)無(wú)明顯差異，溫度升高可以加快分子的擴(kuò)散速度，但溫度過(guò)高可能導(dǎo)致原花色素分解和花色苷降解。綜合考慮原花色素和花色苷的得率，故選擇45 ℃為適宜提取溫度。

2.3.5 提取時(shí)間對(duì)原花色素和花色苷提取效果的影響

圖6 提取時(shí)間對(duì)原花色素(A)和花色苷(B)提取效果的影響Fig.6 Effect of different extraction time on the extraction of proanthocyanidins (A) and anthocyanins (B)

由圖6可知，原花色素和花色苷得率都隨著提取時(shí)間的增加而上升，最后下降，原花色素得率在120 min時(shí)達(dá)到最大，為13.536 mg/100 mg；花色苷得率在150 min時(shí)達(dá)到最大，為0.623 mg/100 mg。提取時(shí)間對(duì)于提取效果很關(guān)鍵，提取時(shí)間延長(zhǎng)，原花色素和花色苷溶出越多，最后提取液接近飽和，原花色素和花色苷溶出速度變慢；而且時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致原花色素和花色苷氧化。通過(guò)分析數(shù)據(jù)可知，花色苷在120 min和150 min的得率變化不顯著（P=0.612＞0.05），綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)的得率，故選擇提取時(shí)間120 min為宜。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表3，利用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到數(shù)學(xué)模型，并對(duì)所得模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果分別見表4、表5。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface analysis

表4 以原花色素含量為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model using proanthocyanidins contents as response value

以原花色素得率（Y1）和花色苷得率（Y2）為響應(yīng)值，3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程分別為：

表5 以花色苷含量為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model using anthocyanins contents as response value

比較上述兩個(gè)方程A、B、C對(duì)應(yīng)系數(shù)的絕對(duì)值可以判斷出3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響大小順序。3個(gè)因素對(duì)原花色素提取效果影響的大小為B＞C＞A，對(duì)花色苷提取效果影響的大小為B＞A＞C。

由表4可知，模型P＜0.000 1，說(shuō)明模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.175 3＞0.05，說(shuō)明失擬度不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，說(shuō)明模型擬合度良好，可以用來(lái)對(duì)原花色素提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。決定系數(shù)R2=0.976 6，說(shuō)明該模型擬合97.66%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值越低，說(shuō)明試驗(yàn)可靠性越高。變異系數(shù)CV=0.41%，說(shuō)明本試驗(yàn)的可靠性高。從表4可以看出，B、C、B2、C2對(duì)響應(yīng)值Y1的影響極顯著（P＜0.01），其余項(xiàng)均不顯著。這表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，同時(shí)交互項(xiàng)不顯著，說(shuō)明任意兩因素間不存在交互作用。

由表5可知，模型P=0.005 7＜0.01，說(shuō)明模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.153 7＞0.05，說(shuō)明失擬度不顯著，說(shuō)明模型擬合度良好，可以用來(lái)對(duì)花色苷提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。決定系數(shù)R2=0.912 9，說(shuō)明該模型擬合91.29%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；變異系數(shù)CV=0.90%，說(shuō)明本試驗(yàn)的可靠性高。從表5看出，A2、B2對(duì)響應(yīng)值Y2的影響極顯著，B對(duì)響應(yīng)值Y2的影響顯著，其余項(xiàng)均不顯著。這表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，同時(shí)交互項(xiàng)不顯著，說(shuō)明任意兩因素間不存在交互作用。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化

通過(guò)Design Expert 8.0.5 軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線及等高線，結(jié)果見圖7。

圖7 液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用對(duì)原花色素和花色苷提取效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Responsive surface plots and contour line of effects of interaction between liquid-material ratio,ethanol concentration and extraction temperature on the extraction efficiency of proanthocyanidins and anthocyanins

由圖7可知，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度，任意兩個(gè)因素之間的交互作用都不顯著，對(duì)原花色素和花色苷得率的影響不大，原因可能是各個(gè)因素水平間距不大，原花色素和花色苷得率在所取的水平范圍內(nèi)變化不顯著。

2.4.3 提取工藝優(yōu)化結(jié)果和驗(yàn)證

用Design Expert 8.0.5軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的最佳提取工藝條件為：液料比52.00∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)47.75%、提取溫度43.91 ℃，此條件下原花色素和花色苷的預(yù)測(cè)得率分別為13.779 mg/100 mg和0.659 mg/100 mg。考慮到實(shí)際操作可行性，選擇液料比52∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、提取溫度44 ℃，在此條件下檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，重復(fù)3次提取黑花生衣原花色素和花色苷，得到的原花色素和花色苷得率分別為（13.769±0.015）mg/100 mg、（0.660±0.002）mg/100 mg，與預(yù)測(cè)值很接近，說(shuō)明該模型反映出的提取條件可靠，此優(yōu)化方法可行。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定pH值為3、提取時(shí)間120 min，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，考察各自變量及其交互作用對(duì)原花色素得率和花色苷得率的影響。最終優(yōu)化得到的條件為：液料比52∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、提取溫度44 ℃。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該條件下的原花色素和花色苷得率分別為13.769mg/100mg、0.660 mg/100 mg，與模型預(yù)測(cè)值接近。在優(yōu)化的工藝條件下，原花色素和花色苷得率較高，減少了資源消耗，提高了提取效率，可為進(jìn)一步研究黑花生衣原花色素和花色苷提供參考依據(jù)。

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