多菌混合發(fā)酵鮮棗果醋的工藝研究

楊建紅，張惠玲*，張衛(wèi)峰

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

2012年4月國(guó)家出臺(tái)了果醋飲料標(biāo)準(zhǔn)，這意味著純發(fā)酵型高品質(zhì)果醋將會(huì)替代勾兌型果醋。發(fā)酵型紅棗果醋的開發(fā)，不但解決了一些次果、落果的再加工問題，提高了附加值，而且為紅棗深加工方面開辟了一條新的道路。本試驗(yàn)采用鮮棗為原料進(jìn)行果醋發(fā)酵，由于傳統(tǒng)式果醋的發(fā)酵過程是用酵母發(fā)酵后再經(jīng)過醋酸菌發(fā)酵制得果醋，口感有些尖酸，香氣淡薄，為了提高棗醋的品質(zhì)與口感上的柔和度，試驗(yàn)采用酵母菌和乳酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵完成酒精發(fā)酵階段，增加乳酸等其他代謝物，賦予果醋特殊的風(fēng)味。試驗(yàn)中采用的乳酸菌是從自然發(fā)酵的鮮棗汁中分離得到的一株乳酸菌，通過試驗(yàn)以獲得最佳混菌發(fā)酵棗醋工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏靈武鮮棗：寧夏靈武果業(yè)有限公司。葡萄酒活性干酵母：法國(guó)XR公司；植物乳酸菌：寧夏大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室分離選育；醋酸菌AS.1.41：寧夏靈武果業(yè)有限公司。果膠酶：諾維信公司；檸檬酸、抗壞血酸：廣州市利士諾丹生物科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫鈉2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

麥芽汁液體培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)麥芽經(jīng)過粉碎、糊化、糖化、過濾得到麥芽汁培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

HW-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠；PHS-3B型精密pH 計(jì)：上海雷諾儀器廠；SP7BOO型氣相色譜儀：北京譜萊析科技有限公司；WZ1110/ATC型手持糖度儀：北京陽光億事達(dá)貿(mào)易有限公司；JS31-300型水果榨汁機(jī)：蘇泊爾公司；HI98168型溶氧測(cè)定儀：上海鉑勒機(jī)電設(shè)備有限公司；AME10升玻璃小型發(fā)酵罐：南京潤(rùn)澤生物工程設(shè)備有限公司；酒精比重計(jì)：銀川偉博鑫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

成熟靈武鮮棗→篩選→清洗→去核→用含60 mg/L SO2水清洗殺菌→撈出→加無菌水打漿（料水比為1∶3）→酶解、澄清過濾→護(hù)色、調(diào)整成分→鮮棗汁→接種（酵母菌、乳酸菌）→酒精發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→接種醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過濾→巴氏滅菌→棗醋

1.3.2 酒精發(fā)酵試驗(yàn)

乳酸菌接種量的確定：乳酸菌與酵母菌生長(zhǎng)條件相似，并且二者的代謝產(chǎn)物對(duì)彼此的生長(zhǎng)代謝具有互相制約、互相促進(jìn)的作用[2-3]，所以在發(fā)酵過程中只有控制合適的接種比例才能更好地發(fā)揮其作用，進(jìn)而使棗醋的香味物質(zhì)更加豐富[4-5]。在酵母菌接種量2.0%，發(fā)酵溫度28 ℃，初始糖度15%，初始pH 4.5的條件下，調(diào)整乳酸菌的接種量分別為0.4%、1.0%、1.6%、2.0%、3.0%，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度和乳酸含量。

發(fā)酵pH值確定：本試驗(yàn)選用的乳酸菌的適宜pH為4.5～6.5，酵母菌的適宜pH值范圍為3.0～4.5，在混菌發(fā)酵過程中綜合考慮兩種菌的適宜pH值[6]，設(shè)置pH梯度為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。發(fā)酵過程中酵母菌接種量為2.0%，乳酸菌接種量為1.6%，初始糖度為15%，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中酒精度和乳酸含量。

發(fā)酵溫度的確定：在酵母菌接種量為2.0%，乳酸菌接種量為1.6%，酵母菌與乳酸菌的接種比為1∶0.8，發(fā)酵液初始pH值為4.5，最初糖度為15%條件下，調(diào)整發(fā)酵溫度分別為24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的酒精度和乳酸含量。

初始糖度的確定：在酵母菌接種量為2.0%，乳酸菌接種量為1.6%，初始pH為4.5，發(fā)酵溫度為28 ℃的條件下，調(diào)整初始糖度分別為11%、13%、15%、17%、19%，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的酒精度和乳酸含量。

正交試驗(yàn)：在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵pH值（B）、初始糖度（C）、乳酸菌接種量（D）4個(gè)因素，以發(fā)酵液的酒精度為評(píng)介指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件[7-8]，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcohol fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸發(fā)酵試驗(yàn)

發(fā)酵溫度的選擇：在攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min、接種量為10%的條件下，調(diào)整發(fā)酵溫度分別為24℃、26℃、28℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液酸度。

接種量的選擇：在發(fā)酵溫度為32 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下，調(diào)整接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的酸度[9-10]。

攪拌轉(zhuǎn)速的選擇：醋酸菌是好氧微生物，采用磁力攪拌進(jìn)行供氧，并控制裝液量為40%，使醋酸菌充分利用氧氣。在發(fā)酵溫度為32 ℃、接種量為10%的條件下，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速分別為160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的最終酸度。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇發(fā)酵溫度A（℃）、攪拌轉(zhuǎn)速B（r/min）、接種量C（%）3個(gè)因素，以發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的總酸含量為評(píng)介指標(biāo)進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)確定醋酸發(fā)酵的最佳條件[10-11]，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

乳酸含量測(cè)定：內(nèi)標(biāo)氣相色譜法；還原糖測(cè)定：斐林試劑法；酒精度的測(cè)定：酒精比重計(jì)法；總酸測(cè)定：酸堿中和法[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸菌接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖1 乳酸菌接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum on fermentation

由圖1可知，乳酸菌接種量為1.6%～2.0%時(shí)，酵母菌與乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵性能好[8]，酒精度達(dá)到7.5%vol左右，乳酸含量為2.42～2.45 g/L。乳酸菌接種量為0.4%及1.0%時(shí)雖然酒精度稍高，但乳酸含量較低，所以選擇乳酸菌接種量1.6%為宜。

2.1.2 pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖2 pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of pH on fermentation

由圖2可知，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，發(fā)酵液中酒精度為8.67%vol，乳酸含量達(dá)到2.4 g/L。pH 4.0時(shí)雖然酒精度稍高于pH4.5，但乳酸含量較低，所以選擇pH 4.5為宜。

2.1.3 溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖3 溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of temperature on fermentation

由圖3可知，溫度為28℃時(shí)，發(fā)酵液中酒精度為8.75%vol，乳酸含量為2.38 g/L。所以選擇溫度28 ℃為最適宜條件。

2.1.4 初始糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖4 初始糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on fermentation

由圖4可知，初始糖度為17%時(shí)酒精度為9.6%vol，乳酸含量為2.04 g/L。酒精度過高或過低會(huì)影響醋酸菌的發(fā)酵[12-14]。所以選擇初始糖度17%為宜。

2.2 混菌酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定酒精發(fā)酵的最佳條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表3 鮮棗果醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fresh date vinegar alcohol fermentation conditions optimization

由表3可知，正交試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即溫度28℃，pH 4.5，乳酸菌接種量2.0%，初始糖度15%時(shí)酒精度最高，為8.4%vol。4個(gè)因素對(duì)酒精度影響的大小為A＞C＞B＞D，即發(fā)酵溫度＞乳酸菌接種量＞pH值＞初始糖度。發(fā)酵結(jié)束后，棗汁醪液中乳酸含量為2.13 g/L，在該含量乳酸存在的條件下，不影響醋酸菌的醋酸發(fā)酵，但會(huì)使醋酸發(fā)酵結(jié)束后酸味變的柔和，香氣更好。

2.3 醋酸發(fā)酵試驗(yàn)

2.3.1 溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖5 溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of temperature on acetic acid fermentation

由圖5可知，當(dāng)溫度在32 ℃時(shí)產(chǎn)酸最高，所以選擇溫度為30 ℃、32 ℃、34 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖6 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

由圖6可知，接種量為12%時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量最高，所以選擇接種量10%、12%、14%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖7 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of stirring speed on acetic acid fermentation

由圖7可知，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量最高，所以選擇攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min、200 r/min、220 r/min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定醋酸發(fā)酵的最佳條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

由表3可知，A3B2C2為最優(yōu)組合，即在發(fā)酵溫度為34 ℃；攪拌速率200 r/min；接種量為12%時(shí)，產(chǎn)酸量最高，總酸含量達(dá)到5.7 g/100 mL。3個(gè)因素對(duì)總酸含量的影響大小為B＞A＞C，即攪拌速率＞發(fā)酵溫度＞醋酸菌接種量。

2.5 產(chǎn)品指標(biāo)

感官指標(biāo)：淡黃色、均勻透亮，無沉淀，有突出的棗香，口感豐富、香氣濃郁、酸度柔和。

理化指標(biāo)：可溶性固形物（20 ℃折光計(jì)法）4.5%；總酸（以醋酸計(jì)）5.7 g/100 mL；揮發(fā)酸（以蘋果酸、檸檬酸、酒石酸計(jì)）0.35 g/100 mL。

表3 鮮棗果醋醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fresh date vinegar acetic fermentation conditions optimization

微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)≤60 CFU/mL；大腸菌群、致病菌、霉菌未檢出。

3 結(jié)論

本研究采用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多菌種發(fā)酵制得鮮棗醋，利用乳酸菌和酵母菌之間的相互作用以共同影響棗醋品質(zhì)的特點(diǎn)，增加香氣和棗醋的柔和度，提高棗醋品質(zhì)。試驗(yàn)對(duì)酒精發(fā)酵過程中乳酸菌與酵母菌的協(xié)同發(fā)酵條件以及醋酸發(fā)酵過程的工藝條件進(jìn)行了研究，確定了酒精厭氧發(fā)酵階段和醋酸有氧發(fā)酵階段的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母菌接種量為2.0%，乳酸菌的接種量為2.0%，發(fā)酵pH值為4.5，發(fā)酵溫度為28 ℃，初始糖度為15%。醋酸菌發(fā)酵接種量為12%，發(fā)酵溫度為34 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。在此條件下乳酸菌、酵母菌協(xié)同作用較好，產(chǎn)生一定量乳酸和其他代謝產(chǎn)物，使棗醋更加柔和，減少了尖酸感；同時(shí)乳酸與酵母菌產(chǎn)生的乙醇可以發(fā)生酯化反應(yīng)，增加了棗醋的醇厚感，增加了風(fēng)味物質(zhì)，提高了鮮棗果醋的品質(zhì)。

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