TLR-2和TLR-4受體單核苷酸多態(tài)性與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性

林茂虎，朱曉應(yīng)，苗 芮，何 蕾，賈 寧

1解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，北京 100051；2解放軍總醫(yī)院 肝膽外科，北京 100853；3解放軍總醫(yī)院 感染管理與疾病控制科，北京 100853

近年來，醫(yī)院和社區(qū)內(nèi)鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii，Ab)感染呈快速增長的趨勢，在美國、法國、西班牙、比利時、英國、韓國等均有醫(yī)院內(nèi)大規(guī)模暴發(fā)[1-4]的報道，給病人和醫(yī)院造成了很大經(jīng)濟損失；盡管目前國內(nèi)外關(guān)于醫(yī)院和社區(qū)內(nèi)鮑曼不動桿菌暴發(fā)和流行的報道很多，但造成該菌流行的原因尚不明確。TOLL樣受體(tolllike receptors，TLRs)被認(rèn)為是最重要的模式識別受體，是IL-1R超家族的成員之一，可見于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，參與細(xì)菌和病毒的感染介導(dǎo)和調(diào)控。目前所知TLR家族成員有11種，為了探討鮑曼不動桿菌感染和TOLL樣受體成員TLR-2、TLR-4的相關(guān)性，為鮑曼不動桿菌感染的早期預(yù)防提供依據(jù)，進(jìn)行如下研究。

材料和方法

1 入選病例 經(jīng)解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意后，利用全國醫(yī)院感染監(jiān)測網(wǎng)收集2009年1月- 2012年12月醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌的感染病例(病人發(fā)熱伴白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞升高，且痰、血液、腦脊液或尿等標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)鮑曼不動桿菌陽性)。感染病人423例作為試驗組；選擇同一病房與病例性別相同、年齡相差不超過2歲但未感染病人385例作為對照組，記錄兩組患者年齡、性別等臨床資料。為了減少人群分層因素的干擾，本研究選擇的患者均為中國漢族。

2 標(biāo)本收集 收集感染病人痰、血液、腦脊液或尿標(biāo)本，按常規(guī)方法分離鑒定并-80℃保存，分離自同一病例的菌株入選首次分離的菌株；采集每例患者外周EDTA抗凝全血3 ml，按照DNA提取試劑盒說明，提取每例基因組DNA約150 mg，-80℃保存。

3 單核苷酸多態(tài)性檢測 根據(jù)http：//innateimmunity. net網(wǎng)站公布的SNPs數(shù)據(jù)庫，編碼序列同義或非同義突變、頻率＞5%的SNPs位點，以及文獻(xiàn)報道的與細(xì)菌感染相關(guān)SNPs位點作為候選SNPs位點。選 擇TLR-2(rs3804099，rs7656411和rs76112010)和TLR-4(rs1927914和rs10759932和rs11536889)位點，根據(jù)各基因多態(tài)性位點設(shè)計引物，采用iMLDR SNP分型技術(shù)(上海天昊專利技術(shù))進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測。

4 遺傳特性分析 應(yīng)用SNPalyze V4.0軟件(DYNACOM，Kanagawa，Japan)，分別在兩組患者中對上述候選基因變異型進(jìn)行最小等位基因頻率、雜合性、哈迪-溫伯格平衡和連鎖不平衡等遺傳特性的分析。應(yīng)用χ2-檢驗，檢測所有SNP是否遵守哈迪-溫伯格平衡；應(yīng)用r2數(shù)值評價任意兩個SNP之間的成對連鎖不平衡；應(yīng)用最大期望預(yù)測法則，估計每個個體的二倍體性。

5 候選基因SNPs與鮑曼不動桿菌感染相關(guān)性分析 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素分析估計各基因型與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性，然后將是否發(fā)病作為因變量，單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量作為自變量，進(jìn)行多元Logistic回歸分析，篩選出與感染有關(guān)聯(lián)的基因SNP位點。

結(jié) 果

1 患者臨床資料 在423例鮑曼不動桿菌感染病人和385例對照人群中，鮑曼不動桿菌感染與性別無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.98)，但是t檢驗顯示鮑曼不動桿菌感染與年齡增加相關(guān)(P=8.6×10-6)，因而接下來的遺傳分析以年齡做校正。

2 基因分型 在感染組和對照組中，采用iMLDR SNP分型技術(shù)對6個SNPs位點[TLR-2(rs3804099，rs7656411和 rs76112010)，TLR-4(rs1927914，rs10759932和rs11536889)]進(jìn)行基因分型，選出的檢測位點的最小等位基因頻率見表1。所有SNP符合哈迪-溫伯格平衡。TLR2和TLR4基因多態(tài)性與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性見表2，提示所檢測的6個SNPs位點的頻率在病例組和對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異。TLR-2，TLR-4的單倍體型分型見表3，其中TLR-4單倍體型GCG與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027)；其余TLR2和TLR4單倍體在實驗組和對照組的分布無統(tǒng)計學(xué)差異。與TLR-4常見單倍型ATG不同，單倍型GCG包含兩個突變點，且均位于啟動子區(qū)域(表1)。

討 論

感染的發(fā)生、發(fā)展是病原體致病性與宿主相互作用的結(jié)果。越來越多的研究表明，TLRs的單核苷酸多態(tài)性與人體對疾病的易感性關(guān)系密切。TLR2與TLR1、TLR6結(jié)合成異源二聚體，其編碼的784個氨基酸的89.8 kU蛋白，可與細(xì)菌的配體如脂肽、肽聚糖、G+菌的脂膜酸等相互作用[5-6]。TLR2的變異型(G2477A/Arg753Gln)在人群中發(fā)生率為2.7% ~ 9.4%，與哮喘、過敏性皮炎、結(jié)核桿菌、葡萄球菌、假絲酵母菌感染的易感性相關(guān)[7-9]。TLR4可形成同源二聚體，其編碼的839個氨基酸95.6 kU蛋白，除了可識別一些G+細(xì)菌的熱休克蛋白、纖毛、逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜糖蛋白、分枝桿菌的不耐熱成分、螺旋體的胞壁酸等[5,10]，其在識別大腸埃希菌、腦膜炎奈瑟球菌、沙門菌、嗜肺性軍團菌等的LPS，且介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用已比較明確[11]。TLR4常見的SNPs(A1287G/Asp299Gly， C13174T/Thr399Ile)可影響受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致TLR4對吸入的LPS反應(yīng)遲緩，增加感染性休克的發(fā)生率；此多態(tài)性還與嚴(yán)重呼吸道合胞病毒支氣管炎的發(fā)生密切相關(guān)[5,8,12]；而另兩個常見變異型(A896G和C1196T)則對人群感染嗜肺性軍團菌有保護(hù)作用[13-14]。

表1 TLR2, TLR4基因單核苷酸多態(tài)性特點Tab. 1 Characteristics of the studied SNPs in TLR2, TLR4 genes

表2 TLR2, TLR4單核苷酸多態(tài)性與鮑曼不動桿菌感染相關(guān)性分析Tab. 2 Association of TLR2, TLR4 gene polymorphisms with Ab infection by logistic regression analysis (n, %)

表3 鮑曼不動桿菌感染病人和對照組TLR-2和TLR-4基因單核苷酸多態(tài)性單倍型分布Tab. 3 Haplotype distribution of TLR-2, TLR-4 polymorphisms in Ab infected patients and controls

本研究對TLR2和TLR4基因6個候選位點的SNP的多態(tài)性檢測中，TLR-4單倍體型GCG與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027)；其余TLR2和TLR4單倍體在實驗組和對照組的分布無統(tǒng)計學(xué)差異。與TLR-4常見單倍型ATG不同，單倍型GCG包含兩個突變點，且均位于啟動子區(qū)域，我們推測位于TLR-4啟動子的兩個SNPs(rs1927914和rs10759932)的可能會影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與鮑曼不動桿菌感染有相關(guān)性，證實在鮑曼不動桿菌感染中宿主因素不容忽視，但對于其如何調(diào)控還需進(jìn)一步實驗研究探討。

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