外源BR對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉片超微結(jié)構及葉綠素熒光特性的影響

李 悅，宋士清，王久興

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

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外源BR對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉片超微結(jié)構及葉綠素熒光特性的影響

李 悅，宋士清*，王久興

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

為探索外源油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)誘導黃瓜幼苗Ca(NO3)2脅迫抗性的機制，以‘改良津春2號’為試材，硝酸鈣[Ca(NO3)2]為鹽脅迫試劑，研究了外源BR的3種施用方法(0.01 mg/L BR浸種、0.10 mg/L BR噴葉及兩者結(jié)合施用)對Ca(NO3)2(60 mmol/L)脅迫下黃瓜幼苗生長、葉綠素熒光特性、葉綠體和線粒體超微結(jié)構的影響。結(jié)果表明：外源BR的3種施用方法均能誘導黃瓜幼苗的Ca(NO3)2脅迫抗性，但效果有所差別。其中，以浸種處理效果最優(yōu)，可緩解Ca(NO3)2脅迫對黃瓜幼苗生長的抑制、提高葉片ФPSⅡ值、保持葉綠體基粒片層、基質(zhì)片層的數(shù)量和排列整齊度，維持線粒體結(jié)構的完整；而噴葉處理、浸種+噴葉處理，Ca(NO3)2脅迫下的黃瓜幼苗反而出現(xiàn)了葉綠體基粒片層紊亂、類囊體褶皺的現(xiàn)象。表明外源BR浸種能通過保護葉片細胞器結(jié)構的完整和葉片PSⅡ反應中心功能來提高黃瓜幼苗的Ca(NO3)2脅迫抗性。

油菜素內(nèi)酯；黃瓜；Ca(NO3)2脅迫；葉綠素熒光；超微結(jié)構

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)是廣泛存在于植物中的天然產(chǎn)物[5]，參與多方面植物生理過程，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，緩解一系列非生物脅迫，如高溫脅迫、重金屬脅迫、氧化脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫等[6～10]。目前，鹽脅迫抗性機制的研究，多集中在外源BR對植株生理生化指標的影響；以葉片超微結(jié)構的變化來揭示植物的抗鹽脅迫機制，尚未見報道；外源BR對植物超微結(jié)構影響的研究，報道也較少[11，8]。

黃瓜(CucumissativusL.)是世界重要蔬菜，設施栽培面積位于我國之首，因其根系不發(fā)達、分布淺、再生能力差等特點，對土壤鹽分較敏感，在連年設施栽培中極易出現(xiàn)鹽害現(xiàn)象。本次試驗將外源BR以不同方法施用于Ca(NO3)2脅迫下黃瓜種子和幼苗，用透射電鏡觀察其葉片超微結(jié)構，并測定葉綠素熒光參數(shù)，以期探索外源BR誘導植株Ca(NO3)2脅迫抗性機制，為尋求有效緩解設施土壤次生鹽漬化的方法和途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種為改良津春2號，由天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所選育。BR購于北實縱橫科技發(fā)展有限公司(BRZH)，純度為95%，配制時先用少量乙醇溶解，再用蒸餾水配成2 mg/L的母液，4 ℃下保存，使用時根據(jù)所需濃度稀釋。

1.2 試驗方法

試驗于2014年10～11月在河北科技師范學院華夏溫室進行。共設1個對照和4個處理，詳見表1。Ca(NO3)2脅迫濃度、BR浸種濃度、BR噴葉濃度均經(jīng)前期預備試驗確定。

黃瓜種子首先進行溫湯浸種，水溫55～60 ℃，時間5 min；隨后在30 ℃水溫下浸種4 h。其中ck，處理1，處理3用去離子水浸種；處理2，處理4用0.01 mg/L BR溶液浸種。然后將種子置于鋪有2層去離子水浸潤濾紙的瓷盤內(nèi)，28 ℃暗光催芽24 h，選發(fā)芽整齊一致的種子播于V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1基質(zhì)的72孔穴盤中。

黃瓜一葉一心時，挑選整齊一致的幼苗定植于裝有20 L營養(yǎng)液的泡沫培養(yǎng)箱內(nèi)，進行預培養(yǎng)，每箱18株。調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH值為6.5±0.1，電導率值為2.2～2.5 ms/cm，氣泵每間隔20 min通氣40 min[12]，營養(yǎng)液配方如下[13]：Ca(NO3)2·4H2O 3.5 mmol/L，KNO37 mmol/L，KH2PO41 mmol/L，MgSO4·7H2O 2 mmol/L，H3BO346.3 μmol/L，MnSO4·H2O 10 μmol/L，ZnSO4·7H2O 1.0 μmol/L，(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.38 μmol/L，CuSO4·5H2O 0.76 μmol/L，EDTA-FeNa 90 μmol/L。試驗所用水均為去離子水，配制溶液時用梯度濃度的H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)pH值。

小麥是非常重要的糧食作物之一，全球有35%～40%的人口以小麥為主要糧食，也是我國北方地區(qū)的主食之一。因此，小麥種植技術直接關系到百姓生活和農(nóng)業(yè)發(fā)展，同時提高小麥種植技術，做好病蟲害的防治工作，也是目前小麥種植工作中的重中之重。為提高我國小麥種植水平，闡述了目前我國小麥種植存在的問題及注意事項，并提出了小麥病蟲害的防治措施。

黃瓜二葉一心時，于早晨8∶00對處理3，處理4進行0.10 mg/L BR噴葉處理，噴灑BR溶液至幼苗葉片，量足而不下滴(流)為宜，每株每次約3 mL；ck，處理1，處理2噴灑等量的去離子水。隔天再處理1次，共處理2次。外源BR處理結(jié)束后24 h，處理1～處理4均進行60 mmol/L Ca(NO3)2脅迫。首先用分析純固體Ca(NO3)2·4H2O配制成3 mol/L的母液，然后從泡沫培養(yǎng)箱中取出適量的營養(yǎng)液，將等量母液添加至相應泡沫培養(yǎng)箱中，達到并保持各處理所需鹽脅迫濃度，且營養(yǎng)液總體積仍保持在20 L。采用隨機區(qū)組排列，每小區(qū)18株，3次重復，試驗過程中保持各小區(qū)其他環(huán)境條件及苗期管理一致。

表1 外源BR誘導黃瓜幼苗Ca(NO3)2脅迫抗性處理設置

注：ck—對照；1—Ca(NO3)2脅迫；2—BR浸種；3—BR噴葉；4—BR浸種+BR噴葉。下表、圖同。

1.3 測定指標

Ca(NO3)2脅迫第10天，取各處理黃瓜植株生長點下數(shù)第2片展開葉，用德國WALZ公司PAM-2500葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數(shù)。用暗適應葉夾DLC-8葉片充分暗適應30 min，打開測量光測定初始熒光產(chǎn)量(Fo)，隨后進行8 000 μmol·(m2·s)-1飽和脈沖光處理，得到最大熒光產(chǎn)量(Fm)，PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學效率(ФPSⅡ)等參數(shù)均由系統(tǒng)計算得出。

Ca(NO3)2脅迫第21天，每處理隨機取黃瓜幼苗6株，測定形態(tài)指標。株高：子葉節(jié)至黃瓜幼苗生長點；莖粗：子葉節(jié)下1 cm處，與2片子葉平行方向；單株地上部、地下部鮮質(zhì)量；單株地上部、地下部干質(zhì)量測定：105 ℃殺青10 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

Ca(NO3)2脅迫第21天取黃瓜幼苗頂端第1片完全展開葉，切成l mm2大小的材料，經(jīng)過戊二醛前固定、鋨酸后固定、梯度濃度丙醇脫水、樹脂包埋、聚合、切片、染色后，在日立公司H-7650型透射電鏡下觀察葉片細胞葉綠體、線粒體等結(jié)構的變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗(P﹤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源BR對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗生長的影響

Ca(NO3)2脅迫顯著抑制了黃瓜幼苗的生長，施用外源BR能有效緩解Ca(NO3)2脅迫對幼苗生長造成的傷害，且不同施用方法緩解效果存在差異(表2)。處理3的黃瓜幼苗各項生長指標均低于處理2和處理4的，株高、展開葉片數(shù)、地上部干質(zhì)量甚至低于僅Ca(NO3)2脅迫的處理1的。處理2在3種施用外源BR的處理中表現(xiàn)最優(yōu)，與僅Ca(NO3)2脅迫的處理1相比：株高、展開葉片數(shù)、葉面積、地上部干質(zhì)量分別提高了19.14%，8.82%，22.04%，31.77%；莖粗和地上部鮮質(zhì)量雖未達到顯著水平，也提高了8.60%和35.26%；地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別提高了52.88%和26.17%，但在三種施用方法中并非最優(yōu)表現(xiàn)。

2.2 外源BR對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗Fv/Fm和ФPSⅡ的影響

ck和其他各處理下黃瓜幼苗葉片F(xiàn)v/Fm值相對穩(wěn)定，差異均未達到顯著水平(圖1)。Ca(NO3)2脅迫顯著降低了黃瓜幼苗葉片的ФPSⅡ值(圖2)；與僅Ca(NO3)2脅迫的處理1相比，處理4和處理2的ФPSⅡ值分別提高了19.52%和4.35%，且處理4的ФPSⅡ值基本恢復到無Ca(NO3)2脅迫的ck的水平；處理3的ФPSⅡ值反而比僅Ca(NO3)2脅迫的處理1還降低了5.9%。

表2 外源BR對Ca(NO3)2脅迫黃瓜幼苗生長指標的影響

注：同列不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P﹤0.05)。

2.3 外源BR對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉肉細胞、葉綠體、線粒體超微結(jié)構的影響

ck黃瓜幼苗葉肉細胞內(nèi)細胞質(zhì)豐富，具有完整的細胞核結(jié)構，核仁致密，清晰可見，葉綠體呈梭形，緊貼細胞膜接連分布(圖3 ck，A)；葉綠體內(nèi)基質(zhì)濃密，雙層被膜結(jié)構清晰完整，淀粉粒大而多，類囊體排列方向與葉綠體長軸平行，基粒片層排列整齊、致密(圖3 ck，B；圖3 cK，C)；線粒體內(nèi)含物多，間質(zhì)濃密，嵴清晰、豐富(圖3 ck，D)。

處理1的黃瓜幼苗葉片較ck葉肉細胞內(nèi)細胞質(zhì)明顯減少，細胞失水變形，細胞核核質(zhì)模糊，核仁變淡(圖3 處理1，A)；葉綠體貼近細胞膜一邊向內(nèi)彎曲，呈橢圓形，與細胞膜間有空隙、間斷分布，淀粉粒明顯減少且體積變小，嗜鋨顆粒變大，基粒片層與基質(zhì)片層之間存在斷裂，較對照均減少且排列松散、稀疏(圖3 處理1，B；圖3 處理1，C)；線粒體雙層膜結(jié)構模糊，內(nèi)含物、內(nèi)嵴均減少(圖3 處理1，D)。

處理2與處理1相比，黃瓜幼苗葉肉細胞內(nèi)細胞質(zhì)較多，葉綠體雖有變形，仍連續(xù)分布在細胞膜周圍(圖3 處理2，A)；基粒片層與基質(zhì)片層數(shù)量和排列整齊度增加(圖3 處理2，B；圖3 處理2，C)，接近ck水平；線粒體內(nèi)含物、內(nèi)嵴增多，雙層膜結(jié)構完整(圖3 處理2，D)。

處理3與處理1相比，黃瓜幼苗葉肉細胞中淀粉粒數(shù)量和體積增加，葉綠體嚴重變形為近球形，基粒片層與基質(zhì)片層排列嚴重混亂，疏密程度不均，基粒類囊體彎曲褶皺(圖3 處理3，A；圖3 處理3，B；圖3 處理3，C)；線粒體結(jié)構基本完整，雙層膜結(jié)構少量破壞，內(nèi)嵴清晰可見(圖3 處理3，D)。

處理4的黃瓜幼苗葉肉細胞中淀粉粒數(shù)量和體積介于處理1的和處理3的之間，葉綠體有脫離細胞膜的現(xiàn)象(圖3 處理4，A)；部分基粒片層與基質(zhì)片層仍排列疏松，類囊體存在褶皺(圖3 處理4，B;圖3 處理4，C)；線粒體雙層膜結(jié)構完整，內(nèi)嵴清晰，內(nèi)含物豐富(圖3 處理4，D)。

圖3 外源BR對Ca(NO3)2脅迫黃瓜幼苗葉肉細胞、葉綠體、線粒體超微結(jié)構的影響 圖例說明：CP——葉綠體，G——基粒，GL——基粒片層，M——線粒體，N——細胞核，O——嗜鋨顆粒，SL——基質(zhì)片層，S——淀粉粒，V——液泡

3 結(jié)論與討論

在番茄、芹菜、茄子上的研究表明[14]，鹽脅迫對植物造成滲透脅迫而降低植株生長速率和生物積累量，Ca(NO3)2主要通過降低土壤水勢造成生理干旱而影響生長[15]。BR是廣泛存在于植物中的天然激素物質(zhì)，可通過促進細胞體積擴大和細胞分裂等方式來促進植物生長。BR作用于細胞壁，通過壁的松弛，降低膨壓和水勢，促使細胞攝入水分并進行機械的膨大[16]，這是BR促進植物生長的主要因素。本試驗中Ca(NO3)2脅迫顯著抑制了黃瓜幼苗生長，而施用外源BR，尤其是0.01 mg/L BR浸種處理后，幼苗各項生長指標顯著提高，從植株外觀形態(tài)說明BR能有效緩解鹽脅迫對生長的抑制。

細胞器的完整是植物正常進行生理生化活動的基礎，光能向化學能的正常轉(zhuǎn)換由完整的葉綠體基粒片層和基質(zhì)片層結(jié)構保證[17]，光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化所需能量由線粒體呼吸代謝產(chǎn)生的ATP供應。葉綠素熒光被視為研究植物光合與環(huán)境關系的內(nèi)在探針，ФPSⅡ值能準確反映PSⅡ反應中心實際進行光化學反應的效率情況[18]，與凈光合速率、胞間CO2濃度和蒸騰速率等表觀指標比，更精確地反應了逆境脅迫對植物的傷害程度。本次試驗中，Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉片的葉綠體和線粒體結(jié)構均遭到不同程度破壞，與ФPSⅡ值的變化趨勢一致；BR浸種、BR浸種+噴葉處理使葉片ФPSⅡ值較單獨鹽脅迫有所升高，這可能是由于外源BR浸種在一定程度上提高了葉綠體基粒片層的排列整齊度，保證了光合色素和電子傳遞鏈的完整性。

通常葉綠體內(nèi)含大量淀粉粒，白天氣孔張開，淀粉降解，為合成有機溶質(zhì)提供碳骨架，夜間氣孔關閉，淀粉積累[19]。植物受到脅迫時淀粉粒降解加快，合成更多有機溶質(zhì)來調(diào)節(jié)滲透壓[20]。通過觀察發(fā)現(xiàn)，Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉綠體中淀粉粒數(shù)量和體積均低于對照，這說明植物對脅迫采取了積極的防御措施，Ca(NO3)2脅迫并未對細胞結(jié)構造成不可逆?zhèn)ΑＶ参锏墓夂献饔檬艿揭种茣r會導致光合產(chǎn)物輸出能力下降[21]，積累的淀粉降解減緩，BR噴葉處理的黃瓜幼苗葉綠體中淀粉粒含量明顯高于其他3個處理，說明BR噴葉處理使植物的光合作用受阻，這也進一步揭示了BR噴葉處理的黃瓜幼苗株高、展開葉片數(shù)、地上部干質(zhì)量和ФPSⅡ值反而出現(xiàn)了低于Ca(NO3)2脅迫的原因。BR浸種處理與Ca(NO3)2脅迫的淀粉粒數(shù)量和體積基本相當，ФPSⅡ值有所提高，減緩了植物的光合受阻程度。

Tong H等[22]研究表明，生理濃度下，BR誘導GA合成基因的表達并抑制GA失活基因的表達，導致活性GA的積累，從而促進植物生長；較高濃度的外源BR反饋抑制自身合成，同時會誘導赤霉素(GA)失活基因的表達，導致GA活性水平下降，最終抑制植物生長。本次試驗中，浸種+噴葉處理施用外源BR的濃度高于僅噴葉處理的，前者的效果卻優(yōu)于后者，表明并非外源BR濃度較高造成反饋調(diào)節(jié)抑制的植株生長。

在植物對BR響應的研究中發(fā)現(xiàn)，不同植物對BR的濃度響應效果不同[23]；采用外源2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-EBL)浸種處理，對120 mmol/L NaCl脅迫下的水稻種子萌發(fā)和幼苗生長起促進作用；但非鹽脅迫下，相同濃度2,4-EBL浸種處理反而起抑制作用[24]。本次研究中，Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗葉綠體基粒片層排列稀疏，并未出現(xiàn)類囊體褶皺。BR浸種處理保護了黃瓜幼苗葉綠體和線粒體的結(jié)構完整，而BR噴葉處理的不僅ФPSⅡ值顯著低于僅Ca(NO3)2脅迫的，類囊體還出現(xiàn)了褶皺現(xiàn)象，推測是由于噴施的BR與Ca(NO3)2共同作用，改變了BR誘導植物Ca(NO3)2脅迫抗性的效果，未起到保護葉綠體結(jié)構的作用。

綜上所述，外源BR三種施用方法均能誘導黃瓜幼苗的Ca(NO3)2脅迫抗性，其中0.01 mg/L BR浸種可提高PSⅡ反應中心實際光化學效率、減少葉片葉綠體和線粒體受損程度，誘導黃瓜幼苗的Ca(NO3)2脅迫抗性效果最優(yōu)。

Effects of Exogenous BR on Chlorophyll Fluorescence and Ultrastructure in Leaves of Cucumber Seedlings Under Ca(NO3)2Stress

LI Yue，SONG Shi-qing，WANG Jiu-xing
(College of Horticulture Science and Technology，Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei，066600，China)

To explore the role of exogenous BR on the induced resistance of cucumber seedlings to Ca(NO3)2stress, the effects of different treatments of exogenous BR (0.01 mg·L-1BR soaking seeds, 0.10 mg·L-1BR spraying leaves and combination of both) on growth, chlorophyll fluorescence indexes, and ultrastructure of cucumber seedlings leaves were determined under 60 mmol·L-1Ca(NO3)2stress in this paper. The results showed that three treatments of exogenous BR could induced resistance of cucumber seedlings to Ca(NO3)2stress, but the effects were different. The treatment of BR soaking seeds showed the best results, which alleviated the inhibition of Ca(NO3)2stress, kept the number and arrangement uniformity of grana and stroma lamella, and maintain the structural of mitochondria complete. The arrangement of grana lamellae disordered and thylakoid became wrinkled, after BR spraying leaves and BR soaking seeds+spraying leaves of cucumber seedlings under Ca(NO3)2stress. The results indicated that exogenous BR could enhance the resistance of cucumber seedlings to Ca(NO3)2stress by protecting the structural integrity of the organelle and the function of PSⅡ reaction center.

brassinosteroid；cucumber；Ca(NO3)2stress；chlorophyll fluorescence；ultrastructure

國家科技部科技富民強縣專項行動計劃項目《設施蔬菜無公害生產(chǎn)關鍵技術集成與示范》[國科發(fā)農(nóng)(2013)514號]。

2015-05-11;修改稿收到日期：2015-05-31

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.006

S642.201

A

1672-7983(2015)03-0027-07

李悅(1989-)，女，碩士研究生。主要研究方向：設施蔬菜逆境生理。

(責任編輯：朱寶昌)

*通訊作者，男，博士，教授。主要研究方向：設施蔬菜栽培與逆境生理。E-mail:qhdsuq@163.com。