老嶺自然保護(hù)區(qū)天女木蘭莖葉中次生代謝產(chǎn)物的含量分析

魏賢星，常 旭，陳 健，徐艷梅， 龍 茹，郭學(xué)民，徐興友*

(1 河北科技師范學(xué)院野生植物資源應(yīng)用研究所，河北 秦皇島， 066600；2 河北省青龍滿族自治縣農(nóng)牧局)

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老嶺自然保護(hù)區(qū)天女木蘭莖葉中次生代謝產(chǎn)物的含量分析

魏賢星1，常 旭1，陳 健2，徐艷梅2， 龍 茹1，郭學(xué)民1，徐興友1*

(1 河北科技師范學(xué)院野生植物資源應(yīng)用研究所，河北 秦皇島， 066600；2 河北省青龍滿族自治縣農(nóng)牧局)

對河北省老嶺自然保護(hù)區(qū)不同海拔天女木蘭莖葉中的次生代謝產(chǎn)物的含量進(jìn)行了測定與分析。結(jié)果顯示：① 在不同海拔的同一營養(yǎng)器官中，葉和嫩枝中綠原酸、皂苷和鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均以1 100 m處的最高，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以海拔800 m處葉、1 300 m處嫩枝的最高；② 在同一海拔高度的不同營養(yǎng)器官中，綠原酸和黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是葉中的高于嫩枝中的，而鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以嫩枝中的高于葉中的，皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則在莖葉中無明顯差異；③ 在不同海拔高度的營養(yǎng)器官中，總綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都要高于其他3種次生代謝產(chǎn)物，而總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于其他3種次生代謝產(chǎn)物。4種次生代謝產(chǎn)物在海拔1 100 m處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最高，總綠原酸、總黃酮和總鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在海拔500 m處的最低，總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在海拔1 000 m處的最低。

天女木蘭；莖葉；黃酮；鞣質(zhì)；綠原酸；含量分析

天女木蘭(MagnoliasieboldiiK.Koch)又稱小花木蘭，系木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)的落葉小喬木，廣泛分布于我國吉林、遼寧、河北、湖北、江西、福建、廣西、浙江、貴州等省[1]，被《中國物種紅色名錄》列為易危物種，是觀葉、觀花、觀果、芳香兼?zhèn)涞挠^賞樹種，花、果、葉可提取高級香料，葉可提取精油用于制造化妝品，為很有開發(fā)利用前途的珍貴野生植物資源[2～4]。但目前有關(guān)天女木蘭在代謝水平上的研究還未見報道。綠原酸、皂苷、黃酮和鞣質(zhì)作為自然界廣泛分布的一類天然產(chǎn)物具有多種功能，綠原酸具有清除自由基、維持機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能、防止和延緩腫瘤突變和衰老等藥用功效，又可用于食品工業(yè)抗氧化保鮮[5]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值；皂苷具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜、抗癌等藥用作用，又是很強(qiáng)的溶血劑，還能提高機(jī)體的免疫能力[6]；黃酮具有擴(kuò)血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、抗白血病、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗輻射等作用[7～12]；鞣質(zhì)內(nèi)服可用于治療胃腸道出血，潰瘍和水瀉等癥，外用于創(chuàng)傷、灼傷，可減少分泌和防止感染，能使創(chuàng)面的微血管收縮，有局部止血作用,此外,鞣質(zhì)還有抑菌、抗病毒、解毒、清除超氧自由基、抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎、降血壓等作用[13,14]。筆者對河北省老嶺自然保護(hù)區(qū)不同海拔天女木蘭莖葉綠原酸、皂苷、黃酮和鞣質(zhì)的含量進(jìn)行了測定分析，旨在為合理開發(fā)和利用天女木蘭資源提供基礎(chǔ)資料。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

老嶺自然保護(hù)區(qū)位于河北省秦皇島市青龍縣境內(nèi)，地理坐標(biāo)為東經(jīng)119°20′～119°30′，北緯40°05′～40°11′。規(guī)劃區(qū)東西長25 km，南北寬18 km，經(jīng)營面積6 400 km2。老嶺是燕山東段一座獨(dú)立山體，1 000 m以上的山峰有20多座，主峰天女峰海拔1 424 m。該保護(hù)區(qū)屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，水分條件好，年降水量為715.6 mm，集中在6～8月份，年平均溫度8.9 ℃，夏季最高溫度29.3 ℃，冬季最低溫度為-15.5 ℃，早霜期10月上旬，晚霜期4月下旬，年日照時數(shù)2 853 h，植物生長期130～190 d。土壤主要為棕色森林土，陽坡土層薄，為多礫石粗骨土，陰坡土層厚，為壤土或沙壤土，腐殖質(zhì)多。

1.2 試驗(yàn)材料

2013年6月，在老嶺自然保護(hù)區(qū)不同海拔高度上選擇5個天女木蘭自然林樣地，采用手持GPS儀測定海拔高度，用經(jīng)緯儀測定林地坡度，各樣地的基本情況見表1。在各個樣地選擇3株成熟天女木蘭個體，從每株的東、南、西、北等4個不同方向的樹冠中部各采集5條新生枝和5片成熟葉，用濕布包裹，后裝入塑封帶立即帶回實(shí)驗(yàn)室，把同一株4個方向同一海拔相同器官的材料混合后洗凈，用烘箱在105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干24 h，粉碎后經(jīng)過金屬網(wǎng)篩(篩孔尺寸0.25 mm)，將烘干樣品放入磨口廣口瓶中，置于干燥器中保存用于測定[15]，每個海拔及每個樣品各為3個重復(fù)。綠原酸，人參皂苷Rb，蘆丁，沒食子酸等購自中國藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)于2013年7月進(jìn)行。

表1 天女木蘭生長地的基本情況

1.3 次生代謝產(chǎn)物含量的測定

1.3.1 綠原酸的提取與測定 稱取天女木蘭粗粉樣品0.1 g，放入到試管中，加入10倍量的水煎煮，期間不斷攪拌，2 h后過濾，濾渣再用8倍的水重復(fù)煎煮2 h，再次過濾，合并提取液，加熱濃縮至m(剩余水)∶m(天女木蘭粗粉)=1∶1時，加乙醇至其體積分?jǐn)?shù)達(dá)0.75，使難溶乙醇的成分從溶液中沉淀析出，使綠原酸分離出來。靜置30 min后過濾，減壓濃縮抽干。將提取物在324 nm波長處測定吸收度，以中國生物制品檢定所提供的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，并計(jì)算含量[16]。

1.3.2 總皂苷的提取與測定 稱取天女木蘭粗粉樣品0.1 g，加入體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇8 mL，置于具塞試管，80 ℃水浴提取3 h，待溫度降至室溫后，3 000 r/min下離心15 min，取上清液，沸水浴蒸干后加4 mL水使其溶解，再加入4 mL乙醚進(jìn)行萃取，取水層，再蒸干后，用10 mL甲醇溶解，取0.5 mL于試管，加熱促使甲醇揮發(fā)，再加入0.2 mL的質(zhì)量濃度為50 g/L香草醛溶液、0.8 mL高氯酸， 70 ℃反應(yīng)20 min，冷卻后，加入5 mL冰醋酸，混勻，722型可見光分光光度計(jì)560 nm測定吸光度，試劑空白對照[17]。

1.3.3 黃酮的提取與測定 稱取天女木蘭粗粉樣品0.1 g，加入5 mL甲醇，90 ℃水浴回流2 h，3 000 r/min離心15 min取上清液，定容至25 mL，搖勻，吸取1 mL置潔凈試管中，然后加入4 mL 0.1 mol·L-1AlCl3-甲醇溶液，搖勻，以試劑空白作對照，在420 nm處測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，其回歸方程為y=8.036 2x-0.001 6,R2=0.997 5[18]。

1.3.4 鞣質(zhì)的提取與測定 稱取天女木蘭粗粉樣品0.1 g，置50 mL棕色量瓶中，加水25 mL放置過夜，超聲處理10 min, 冷卻后搖勻，靜置30 min，使固體物沉淀，過濾至干燥容量瓶中，加水定容至25 mL，作為供試品溶液備用。吸取1 mL提取液至潔凈的小燒杯中，然后加入24 mL蒸餾水，再加入2滴質(zhì)量濃度為50 g/L的靛藍(lán)溶液，用0.1 mol·L-1KMnO4溶液滴定，溶液從藍(lán)色變?yōu)榫G色再變?yōu)辄S色為終點(diǎn)。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，其回歸方程為y=0.013 6x+0.000 3,R2=0.999 9[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)處理以及數(shù)據(jù)測定均3次重復(fù)，將所得數(shù)據(jù)輸入DPS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同海拔之間以及莖葉之間次生代謝物的含量并進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔天女木蘭莖葉中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

不同海拔高度天女木蘭莖、葉中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有相同的變化趨勢(表2)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小的排列順序?yàn)椋? 100 m處、1 300 m處、800 m處、1 000 m處、500 m處。用t檢驗(yàn)，成對雙樣本均值分析進(jìn)行單尾檢驗(yàn)得出，t=16.10，當(dāng)df=4時，t0.05=2.13

2.2 不同海拔天女木蘭莖葉中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

表3顯示了不同海拔天女木蘭莖葉總皂苷含量的測定結(jié)果?？梢钥闯?，不同海拔高度天女木蘭的葉與莖中皂苷含量具有相似的變化趨勢，以海拔1 100 m處的最多，海拔500 m處與1 000 m處的最少，海拔800 m的與1 300 m處的居中，這與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢基本相同。

用t檢驗(yàn)，成對雙樣本均值分析進(jìn)行雙尾檢驗(yàn)對葉與莖中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析：求出t=0.408，當(dāng)df=4時，t0.05=2.776>t，因此同一海拔高度天女木蘭的葉與莖中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有差別。經(jīng)方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，除800 m處與1 100 m處之間的莖葉皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著外，其余相互之間差異極顯著。

表2 不同海拔高度天女木蘭莖葉中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

注：表中小寫英文字母表示在5%水平上差異顯著； 大寫英文字母表示在1%水平上差異顯著，以下同。

表3 不同海拔高度天女木蘭莖葉中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

表4 不同海拔高度天女木蘭營養(yǎng)器官中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較(LSR法)

2.3 不同海拔天女木蘭莖葉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

在不同海拔高度的天女木蘭同一營養(yǎng)器官中，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異(表4)。葉片中，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小的順序?yàn)椋汉０?00 m處、1 100 m處、1 000 m處、1 300 m處、500 m處；嫩枝中，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小的順序?yàn)椋汉０? 300 m處、1 100 m處、500 m處、800 m處、1 000 m處的。方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，在葉中，除海拔800 m處與1 100 m處天女木蘭葉黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著外，其他海拔高度之間差異顯著或極顯著；在嫩枝中，各海拔高度之間黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異均顯著或極顯著。在同一海拔高度的天女木蘭不同營養(yǎng)器官中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，但有共同的規(guī)律，即葉中的高于嫩枝中的。

2.4 不同海拔天女木蘭莖葉中鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

不同海拔高度的天女木蘭同一營養(yǎng)器官中鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異(表5)。葉片中，鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小的順序?yàn)椋汉０? 100 m處、1 300 m處、1 000 m處、800 m處、500 m處；嫩枝中，鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小的順序?yàn)椋汉０? 100 m處、800 m處、1 000 m處、1 300 m處、500 m處。方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，在葉中，除海拔800 m處、1 000 m處與1 300 m處天女木蘭葉中的鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相互之間差異不顯著外，其它各海拔高度之間差異顯著或極顯著；在嫩枝中，只有海拔1 100 m處的天女木蘭嫩枝中的鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他海拔高度處的差異極顯著，而其他各海拔高度之間差異不顯著。鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在同一海拔高度的天女木蘭不同營養(yǎng)器官中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有著相似的變化規(guī)律，即嫩枝中的均高于葉中的。

表5 天女木蘭中鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較(LSR法)

2.5 不同海拔高度天女木蘭莖葉中幾種次生代謝產(chǎn)物的的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

各海拔下天女木蘭莖葉中總綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都要高于總皂苷、總黃酮和總鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖1)，而皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于其他3種次生代謝產(chǎn)物。隨著海拔高度的升高，總綠原酸、總皂苷、總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出升高—下降—升高—下降的變化趨勢，而總鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在海拔800 m處和1 000 m處接近。這4種次生代謝產(chǎn)物在海拔1 100 m處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，總綠原酸、總黃酮和總鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在海拔500 m處最低,總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在海拔1 000 m處的最低。

圖1 不同海拔高度的天女木蘭莖葉中幾種次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

3 討 論

次生代謝是植物的重要特征，被認(rèn)為是植物在長期進(jìn)化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，它在處理植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)著重要的角色[20]。許多植物在受到病原微生物的侵染后，產(chǎn)生并大量積累次生代謝產(chǎn)物，以增強(qiáng)自身的免疫力和抵抗力。在不同海拔高度的天女木蘭莖葉中，總綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都要高于其他3種次生代謝產(chǎn)物，而皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于其他3種次生代謝產(chǎn)物，但綠原酸和皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有相似的變化規(guī)律，即均在海拔1 100 m地段的最高，海拔1 000 m處、500 m處的較低，而海拔800 m處、1 300 m處的居中。說明海拔高度對綠原酸和皂苷的合成有影響，是多種環(huán)境因素作用的結(jié)果；同一海拔高度的莖葉中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比較，葉中的都高于莖中的，可能葉是主要合成和積累綠原酸的部位；同一海拔高度的莖葉中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有差別，預(yù)示著天女木蘭莖葉中可能不存在皂苷的單獨(dú)合成途徑，葉與莖之間也可能沒有相互運(yùn)輸皂苷通道。

在不同海拔高度的天女木蘭營養(yǎng)器官中，黃酮和鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均存在著一定的差異，表明黃酮和鞣質(zhì)在天女木蘭莖葉中的合成、運(yùn)輸、積累和消耗均具有相對的獨(dú)立性[21,22]。同一營養(yǎng)器官在不同海拔高度，黃酮和鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也不同，預(yù)示著環(huán)境因素在次生代謝過程中起著非常重要的作用。不同營養(yǎng)器官在同一海拔高度黃酮和鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異很大，葉中的黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于嫩枝中的，由此推斷，天女木蘭中的黃酮可能主要由葉合成，可通過嫩枝運(yùn)輸?shù)狡渌鞴?，但主要仍貯存在葉中。鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則以嫩枝中較高，而葉中較低，表明嫩枝和葉都可能是合成鞣質(zhì)的場所，并且合成后的鞣質(zhì)在嫩枝、葉中均能積累?？傮w來說，葉中黃酮和鞣質(zhì)的總的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，這是因?yàn)槿~光合作用的后期轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是黃酮和鞣質(zhì)的底物，葉光合作用最旺盛，產(chǎn)生底物多，所以合成的黃酮和鞣質(zhì)也多，因而葉可能是黃酮和鞣質(zhì)的主要產(chǎn)生器官[23]。

有文獻(xiàn)報道[24～28]，一直被用作提取醫(yī)用黃酮原材料的銀杏，其葉片中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為27.4 g·kg-1，而在一般植物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g·kg-1；在七子花中鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為9.33 g·kg-1，而在一般植物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 g·kg-1。在天女木蘭的營養(yǎng)器官中，海拔800 m處的葉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為15.95 g·kg-1，海拔1 100 m處的嫩枝中鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為12.31 g·kg-1。比較而言，天女木蘭的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，而鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高，具有一定的開發(fā)前景。而皂苷在一些中藥如人參、三七、黃芪、柴胡等含量較高。據(jù)文獻(xiàn)報道，綠原酸在金銀花中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10～59 g·kg-1，在杜仲(皮、葉)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是 20～50 g·kg-1[15]。河北地區(qū)黃芪中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為1.53 g·kg-1[29]，柴胡中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.40 g·kg-1[30]。老嶺自然保護(hù)區(qū)海拔1 100 m地段的天女木蘭葉中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為19.42 g·kg-1，達(dá)到了《中國藥典》及補(bǔ)充檢驗(yàn)方法限度規(guī)定藥物中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于15.0 g·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)[31]，而在莖中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，沒有達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)；天女木蘭莖葉中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)1.79 g·kg-1，與黃芪中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)，且在莖與葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有差異。因此，天女木蘭具有較高的藥用價值。針對天女木蘭葉油已被開發(fā)利用的現(xiàn)狀，葉中含有的綠原酸、皂苷等活性物質(zhì)可作為副產(chǎn)物加以利用。

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Stem and Leaf Secondary Metabolites Content Analysis ofMagnoliasieboldiiin Laoling Natural Preservation Area

WEI Xian-xing1,CHANG Xu1,CHEN Jian2, XU Yan-mei2,LONG Ru1,GUO Xue-ming1,XU Xing-you1
(1 Institute of Wild Plant Resources Application, Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei, 066600;2 Hebei Qinglong Manchu Autonomous County Agriculture and Pasture Bureau;China )

Stem and leaf secondary metabolites content ofMagnoliaSieboldiiin different altitude gradients in Laoling Natural Preservation Area , Hebei Province were determined and analyzed. The results show that in different elevations of the same vegetative organs, leaves and shoots of chlorogenic acid, saponins and tannin content are the highest at an altitude of 1 100 m，while the content of flavonoid is the highest in the leaf at an altitude of 800 m and in the shoot at an altitude of 1 300 m. In the same altitude of different organs，chlorogenic acid and flavonoid content in the leaf are higher than that in the shoot, while that of Tannin is on the contrary. Saponins content has no obvious difference in the leaf and shoot. In different elevations, the total chlorogenic acid contents in the vegetative organs are higher than other three kinds of secondary metabolites, and total saponins are far below the other three kinds of secondary metabolites. These four secondary metabolite contents are the highest at an altitude of 1 100 m, the lowest content total chlorogenic acid, total flavonoid and total tannins are at an altitude of 500 m, the total saponins are the lowest at an altitude of 1 000 m .

MagnoliaSieboldii; flavonoids; tannins; chlorogenic acid; saponins; content analysis

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號:C2010001538)。

2015-08-15

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.005

S685.99

A

1672-7983(2015)03-0021-06

魏賢星(1988-)，男，碩士研究生。主要研究方向：野生植物資源的保護(hù)與利用。

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

*通訊作者，男，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：野生植物資源的保護(hù)與利用。E-mail:xuxingyouzlj@126.com。