海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清指標的影響

李文武, 殷光文, 林 希, 黃志堅, 林建斌, 江和基, 朱慶國

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 福建省動物藥物工程實驗室, 福建 福州 350002; 2.福建省淡水水產(chǎn)研究所, 福建 福州 350002 )

魚類血清指標分析能反映魚類品種的特性及生理狀態(tài), 是研究魚類血清非特異性免疫和血清生化特性的重要內(nèi)容[1]。魚機體出現(xiàn)病變時, 其血清指標會發(fā)生變化, 通過檢測血清相關(guān)指標的變化, 可以對魚的病理情況做出診斷[2]。已有研究表明, 魚類血清指標的變化范圍較大, 與品種、年齡及生長環(huán)境等因素有關(guān)[3]。

海帶粗多糖是從海帶中提純的多糖成分, 包括褐藻膠、褐藻糖膠和海帶淀粉[4-5], 具有廣泛的生物活性。目前國內(nèi)外研究已表明海帶粗多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗動脈粥樣硬化、消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。近年來, 也有研究表明海帶粗多糖對肥胖和糖尿病有緩解和治療作用[6]。對于多糖對魚類血清指標影響的研究, 國內(nèi)外已有相關(guān)研究和報道[7-11], 但對斜帶石斑魚血清研究較少,僅張海發(fā)等[12]對斜帶石斑魚血清性狀及生化指標的研究較為全面, 對海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清指標影響的研究也尚未見報道。本試驗通過在基礎(chǔ)魚飼料中添加不同比例的海帶粗多糖, 研究海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化和非特異性免疫指標的影響, 旨在摸索出海帶粗多糖作為魚飼料添加劑的最佳添加比例, 豐富藻類多糖促進水產(chǎn)病害綠色防治的基礎(chǔ)研究[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗魚飼養(yǎng)管理

試驗魚為福建廈門小嶝水產(chǎn)養(yǎng)殖場人工培育的斜帶石斑魚幼魚, 平均體質(zhì)量為90 g±2.6 g, 平均體長為15 cm±2.25 cm。石斑魚魚苗運到福建省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖試驗場地, 放入暫養(yǎng)水桶中馴養(yǎng)兩周,用10 mg/L的土霉素溶液消毒, 選取體格健壯、大小規(guī)格基本一致的個體, 隨機放入8個150 L的水族箱中, 每組2缸, 每缸15尾, 每缸配備一臺小型循環(huán)過濾器來凈化水體, 稱量初始體質(zhì)量后開始試驗。每天8: 00~8: 30和17: 00~17: 30定時投喂, 每次達到表觀飽食后停止投喂(投喂量約為體質(zhì)量的 3%)。每天檢測水質(zhì)情況, 每天清洗循環(huán)過濾器, 每周清洗水缸,并用土霉素消毒。試驗用水為一級過濾海水, 避光飼養(yǎng), 用增氧機晝夜持續(xù)增氧, 每次投喂1 h后吸出糞便, 每天傍晚換水約1/3~1/2, 以保持水質(zhì)清新。試驗期間, 水溫 24~30℃, pH 值為 8.0±0.3, 溶氧質(zhì)量濃度>7.0 mg/L, 氨氮質(zhì)量濃度<0.2 mg/L。試驗期為48 d。

1.2 試驗期日糧的配制

海帶粗多糖購自愛迪森(北京)生物科技有限公司, 主要成分為褐藻膠、褐藻糖膠和海帶淀粉, 總糖含量 38.9%。在粉狀飼料(購自福建天馬科技集團股份有限公司)中分別添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%飼料營養(yǎng)成分(表1), 對應(yīng)分別為對照組、0.5%組、1.0%組、1.5%組。各組飼料原料混勻后制成4 mm粒徑的軟顆粒料, 之后分裝入自封袋, 置于 4℃冰箱冷藏備用, 軟顆粒料每3 d制作1批, 棄去3 d剩下的飼料,用新料投喂。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分表Tab.1 Nutrition of the basal diet

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后, 禁食 24 h, 每缸魚整體稱質(zhì)量后,隨機取10尾魚, 用毛巾包裹并蒙住眼睛, 2.5 mL采血針心臟采集血清, 4℃冰箱靜置過夜, 吸取上清液,–40℃保存待檢。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 血清細胞因子測定

細胞因子 IL-2、IL-6和 IFN-α的測定均采用ELISA法測定。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供, 操作按說明書進行。

1.4.2 血清生化測定

血清生化測定采用IDEXX VetTest?獸醫(yī)全自動干式生化分析儀(購自北京安普生化科技有限公司),按顯示屏指示下的簡單操作步驟, 自動滴注血清樣品, 快速給出并打印檢測報告。

1.4.3 血清免疫指標測定

SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法; C3、C4和LZM活性測定采用比濁法;AKLP活性測定采用對硝基苯磷酸鹽法。所用試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所, 操作按各說明書進行。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗數(shù)據(jù)用EXCEL和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件中方差分析(ANOVE)進行單因素數(shù)理統(tǒng)計, 并對均數(shù)做LSD多重比較, 結(jié)果均以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清細胞因子水平的影響

如表2所示, 與對照組相比, 各實驗組血清中IL-2、IL-6與IFN-α水平均有一定程度的提高。其中0.5%組各因子水平均極顯著高于對照組(P<0.01);1.0%組 IL-2與 IL-6水平均極顯著高于對照組(P<0.01), IFN-α水平顯著高于對照組(P<0.05); 1.5%組IL-2、IL-6與IFN-α水平均高于對照組, 但未達到顯著水平(P>0.05)。

表2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清中細胞因子水平的影響Tab.2 Effect of laminarin on serum cytokines in Epinephelus coioides

2.2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清非特異性免疫的影響

由表3可見, 與對照組相比, 各實驗組 LZM、CAT、SOD的活力均有所提高, C3、C4含量均有一定程度的降低。其中, 隨添加量的增加, CAT和SOD活性逐漸下降, LZM先降后升, C3、C4含量逐漸升高, 但均低于對照組; 0.5%組LZM活性顯著高于對照組(P<0.05), CAT和 SOD活性極顯著高于對照組(P<0.01), C3含量顯著低于對照組(P<0.05), C4含量極顯著低于對照組(P<0.01); 1.0%組CAT活力顯著高于對照組(P<0.05), C4含量顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清非特異性免疫指標的影響Tab.3 Effect of laminarin on non-specific immune response in Epinephelus coioides

2.3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化指標的影響

由表4可見, 經(jīng)過48 d的喂養(yǎng)試驗, 與對照組相比, 各試驗組均能顯著提高血清TP含量, 其中0.5%組和1.0%組與對照組差異極顯著(P<0.01), 1.5%組與對照組差異顯著(P<0.05); 降低血清中 UREA水平,0.5%組與對照組相比差異顯著(P<0.05), 但 1.0%組和1.5%組差異不顯著(P>0.05); 降低CREA水平, 且隨添加量增加, CREA水平依次降低, 1.5%組與對照組相比差異顯著(P<0.05), 0.5%組和1.0%組差異不顯著(P>0.05); 雖0.5%組和1.5%組ALP值比對照組低,1.0%組比對照組高, 但差異均不顯著(P>0.05); 添加量為 0.5%時能顯著提高 AST酶活力(P<0.05), 添加量為1.0%與1.5%時其AST活力先降后升, 但差異均不顯著(P>0.05); 對于ALT, 各試驗組與對照組相比,其ALT的酶活力變化不大, 差異不顯著(P>0.05)。

表4 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化指標的影響Tab. 4 Effect of laminarin on plasma biochemical parameters in Epinephelus coioides

3 討論

3.1 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清細胞因子水平的影響

細胞因子是由活化的免疫細胞和非免疫細胞合成分泌的一類生物活性小分子多肽, 具有調(diào)節(jié)細胞生理、參與組織修復(fù)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用。細胞因子IL-2、IL-6與IFN-α, 按來源分屬淋巴因子, 即由活化的淋巴細胞產(chǎn)生, 是機體免疫系統(tǒng)中重要的信息物質(zhì)。脾臟是粒細胞發(fā)生的初始場所, Ryu等[14]研究發(fā)現(xiàn)海帶粗多糖能誘發(fā)小鼠脾細胞增生, 明顯增強細胞毒性 T細胞 (CTLs)和自然殺傷細胞(LAKs)的活性, 提高IL-2的表達量。Smith等[15]發(fā)現(xiàn)日糧添加300 mg/L LJPS能顯著提高LPS應(yīng)激的斷奶仔豬回腸和結(jié)腸 IL-6(P=0.0289)和 IL-8(P=0.0245)的表達量, 結(jié)果都佐證了海帶粗多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。本試驗組中, 細胞因子IL-2、IL-6與IFN-α的水平均高于對照組, 表明海帶粗多糖能促進斜帶石斑魚機體對3種細胞因子的分泌, 提高機體的免疫水平。其隨海帶粗多糖添加量的增加各因子的分泌水平呈現(xiàn)負相關(guān)性, 這可能與海帶粗多糖濃度有關(guān)。結(jié)果表明,海帶粗多糖具有促進斜帶石斑魚血清 IL-2、IL-6與IFN-α的分泌和提高機體免疫調(diào)節(jié)能力, 對促進石斑魚健康生長具有重要意義[16-17], 但在實際使用海帶粗多糖時要控制好所添加的含量。

3.2 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清免疫指標的影響

LZM, 又稱細胞壁溶解酶, 廣泛存在于動物黏液、血清等中, 能專一地溶解微生物細胞壁, 已有研究表明, 淡水魚和海水魚的血清都有溶菌酶的存在,是魚體體液中重要的非特異性免疫物質(zhì)。CAT又稱為觸酶, 是一種酶類清除劑, 以鐵卟啉為輔基, 它可促使H2O2分解為分子O2和H2O, 清除體內(nèi)的H2O2,從而使細胞免于遭受 H2O2的毒害, 是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子, 可對抗因氧自由基對機體細胞造成的損傷, 并及時修復(fù)受損細胞, SOD的水平是機體健康與否的直觀指標。Kang等[18]通過臨床試驗證實, 海帶能提高SOD和CAT的水平。Moroney等[19]研究新鮮豬肉的保質(zhì)期時也發(fā)現(xiàn), 海帶粗多糖能延長新鮮豬肉的保質(zhì)期, 提高機體內(nèi)總抗氧化水平。C3、C4是補體系統(tǒng)的重要組成部分, 參與機體的特異性和非特異性免疫機制, 當機體補體系統(tǒng)過度激活, 會導(dǎo)致機體抗感染能力下降, 促使機體內(nèi)產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng)或造成組織損傷, 引起病理變化。

本試驗結(jié)果表明, 海帶粗多糖能提高斜帶石斑魚體內(nèi)LZM、CAT與SOD酶活力; 降低C3、C4水平, 且隨添加量增加呈現(xiàn)負相關(guān)性, 這可能與海帶粗多糖濃度有關(guān)。結(jié)果說明, 海帶粗多糖能提高石斑魚機體的抗氧化能力和非特異性免疫, 與枸杞多糖和靈芝多糖相似, 都能提高機體的非特異性免疫[20]。劉會娟[21]的研究表明, 100 mg/kg的海帶粗多糖能明顯提高大骨雞血清效價, 對免疫功能有明顯的促進作用, 與本試驗結(jié)果一致。董學(xué)興等[22]的研究表明,海帶對SOD、CAT無顯著影響, 與本研究結(jié)果不同,這可能與魚品種和海帶粗多糖效價等因素有關(guān); Zhu等[23]發(fā)現(xiàn)三七中鼠李半乳糖醛酸聚糖具有固化補體的作用, Olafsdottir等[24]從地衣中分離的β-葡聚糖也具有抗補體活性。這說明, 從天然多糖中尋找抗補體活性成分已成為可能。試驗也證明海帶粗多糖中具有抗補體活性成分。

3.3 海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清生化水平的影響

尿素氮和肌酐在一定程度上可反映腎小球濾過功能的損害程度。本試驗飼喂不同含量的海帶粗多糖后可見, 斜帶石斑魚機體內(nèi)的UREA和CREA含量均有不同程度的降低, 這說明海帶粗多糖不會對魚體腎臟造成損傷, 反而會提高腎臟機能; ALT與AST主要分布在肝臟的肝細胞內(nèi)。肝細胞壞死時ALT和AST就會升高。其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致, 與 ALP一起, 都是目前最常用的肝功能指標。本研究可見, 海帶粗多糖能降低 ALP活性, 對AST和ALT活性影響不大, 這說明海帶粗多糖不會對肝臟造成損傷。張海發(fā)等[12]研究斜帶石斑魚血清性狀及血清生化時發(fā)現(xiàn), 成熟親魚的 ALT、AST活性都較低(4

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明, 海帶粗多糖能提高斜帶石斑魚血清非特異性免疫能力, 提高血清總蛋白含量,降低對腎臟的損傷, 能明顯提高斜帶石斑魚機體的免疫功能, 且作用與海帶粗多糖濃度直接相關(guān), 因而使用海帶粗多糖時要控制好濃度, 本實驗中, 以0.5%添加量時效果最佳。

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