長牡蠣兩種engrailed同源基因的鑒定及其與貝殼發(fā)育相關性的研究

黃曉紅 , 郇 聘 劉保忠

(1.中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

貝殼是大多數(shù)軟體動物最顯著的特征, 為動物生存提供基本保護。鑒于其重要性, 貝殼發(fā)生機制的研究一直是人們關注的熱點。顯微觀察表明, 貝殼發(fā)生起始于胚胎發(fā)育的早期。早在原腸作用剛剛開始時, 胚胎的背部細胞就開始變形、內陷, 進而分泌貝殼物質, 并在擔輪幼蟲時期形成最早的貝殼。隨后貝殼逐漸擴大并鈣化, 至 D形幼蟲時期, 貝殼首次覆蓋完整幼蟲身體, 完成第一階段的發(fā)育[1], 此時期的貝殼稱作Ⅰ期胚殼(prodissoconch I)。

貝殼的發(fā)生過程依賴多個基因的協(xié)同作用。目前該方面是一個研究熱點, 受到重點研究的基因包括dpp,engrailed,hox-1等[2-4]。其中engrailed基因屬于同源異形基因家族成員[5], 具備該家族蛋白典型的同源異形結構域(homeodomain)。與同家族的HOX蛋白一樣, Engrailed通過其同源異形結構域結合特定DNA序列, 作為轉錄因子發(fā)揮調節(jié)基因表達的功能。此外, Engrailed還與多種其他蛋白相互作用(如Pbx蛋白), 并可發(fā)生翻譯后修飾調節(jié), 從而增加基因表達調控的多樣性水平[6-7]。作為典型的發(fā)育相關基因,engrailed被報道廣泛參與節(jié)肢動物[8-11]、棘皮動物[12]、脊索動物[10,13]等的分節(jié)、附肢發(fā)育和神經系統(tǒng)發(fā)育過程。目前, 多個軟體動物的engrailed基因已被報道參與貝殼發(fā)生[3,14-16]。軟體動物engrailed表達于正在發(fā)生的貝殼外緣, 可能調控了貝殼發(fā)生的邊界[3, 14-16]。

長牡蠣(Crassostrea gigas)是一種在世界范圍內廣泛分布的經濟貝類, 具備廣泛的研究基礎。同時,其全基因組數(shù)據(jù)在2012年發(fā)布, 使其成為軟體動物的一種潛在模式生物。目前長牡蠣貝殼發(fā)生相關基因尚未展開系統(tǒng)研究。本研究基于長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫, 鑒定了兩個engrailed同源基因序列, 分析了其系統(tǒng)演化關系, 并對其在貝殼形成關鍵時期的表達情況進行了研究和比較, 研究結果將有助于加深作者對貝殼形成過程分子調控機制的認識。

1 材料與方法

1.1 幼蟲培養(yǎng)及樣品固定

性成熟的長牡蠣購自山東省青島市南山水產市場。選取性腺飽滿的個體, 解剖獲取配子, 進行人工授精。受精卵在 25~26 ℃條件下進行培養(yǎng), 持續(xù)充氣, 在受精后14h收集長牡蠣早期D形幼蟲, 經4%多聚甲醛固定后梯度甲醇脫水, 保存于–20℃中備用。

1.2 engrailed同源基因的克隆

利用已報道的刺牡蠣Saccostrea kegaki的engrailed基因(GenBank No.BAG68617.1)序列比對長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(Blastp), 搜索得到兩條engrailed同源基因序列(OYG_10012208及OYG_10012209)。這兩個參考序列已包括基因的全長 ORF部分, 作者設計了全長ORF引物cgeng1_F (ATGGATGTTAAACAAAAT AACGCGGAGG)、cgeng1_R (TTATGACTCGCCTTCATC CGAAACTGT)和cgeng2_F (ATGTCGGACGTGAA AGT)、cgeng2_R(TCATTGCT CCATCCCATC)。以上述引物進行 PCR擴增并測序驗證, 成功獲得兩條長牡蠣engrailed同源基因的全長cDNA序列, 并分別命名為cgi-eng1和cgi-eng2。為了保證擴增反應的特異性, 本研究中所用到的所有 PCR擴增反應均使用了Touchdown PCR, 具體程序為: 95 ℃預變性4 min;之后為 18個逐步降低退火溫度的循環(huán): 95 ℃變性15 s, 68 ℃退火15 s(之后每個循環(huán)降低1 ℃), 72 ℃延伸1 min; 然后是25個常規(guī)PCR循環(huán): 95 ℃變性15 s, 50 ℃退火15 s, 72 ℃延伸1 min; 最后72 ℃延伸10 min。

1.3 engrailed同源基因序列特征和聚類分析

利用生物信息學工具, 對cgi-eng1和cgi-eng2序列和對應的氨基酸序列進行特征分析, 包括通過ExPASy網站的在線工具(http://web.expasy.org/computepi/)分析分子量及等電點; SignalP網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的工具預測信號肽序列; 利用 SMART在線工具(http://smart.emblheidelberg.de/)并結合相關文獻報道對 Cgi-Eng1和Cgi-Eng2中的結構域進行預測。利用Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)對不同物種結構域之間的保守性進行比較, 并利用 Neighbor-Joining方法進行聚類分析。

1.4 整裝原位雜交

分別利用基因特異性引物 cgeng1_wF (CGGA GGCTGCACACGAAC)、cgeng1_wR(GGCGA AGTG GCTACTGGACTAC)和 cgeng2_F、cgeng2_R, 通過touchdown PCR擴增其cDNA序列。將PCR產物連接入 pGEM-T載體(Promega), 轉化入大腸桿菌中增殖, 提取質粒。將質粒酶切線性化之后作為模板, 使用DIG RNA Labeling Mixture試劑盒(Roche)合成地高辛標記的 RNA探針。整裝原位雜交流程按照Maures & Duan報道的方法進行[17], 用Nikon 80i顯微鏡觀察, 拍照。以正義RNA探針作為陰性對照組。

2 結果

2.1 長牡蠣engrailed同源基因及序列特征

長牡蠣cgi-eng1基因(GenBank No.EKC23208.1)的ORF全長690bp, 編碼一個長229個氨基酸多肽(圖1), 其理論分子質量為 25.7ku, 等電點為 9.62。長牡蠣cgi-eng2基因(GenBank No.EKC23209.1)的ORF全長 642bp, 編碼一個長 213個氨基酸的多肽(圖1), 其理論分子質量為 24.3ku, 等電點為 9.43。經過SignalP預測, Cgi-Eng1和Cgi-Eng2均沒有信號肽序列。結構域預測表明二者均具備典型的同源異形結構域, 在Cgi-Eng1中位于第141和203個氨基酸之間, 在Cgi-Eng2中位于第126和188個氨基酸之間。根據(jù)相關的報道[18-20], 在 Cgi-Eng1和Cgi-Eng2中鑒定到Engrailed蛋白全部的5個典型結構域(EH1-5)(圖2), 其中EH4即同源異形結構域。多序列比較分析發(fā)現(xiàn), EH2在物種間的保守性最高,EH4次之, 而其他結構域較低(圖2)。

2.2 聚類分析

作者對來自包括脊椎動物、節(jié)肢動物和軟體動物的engrailed同源基因進行了演化分析。結果如圖3所示, 3個類群的基因各自聚為一支, 與其演化關系有很好的對應。在軟體動物分支內部, 雙殼類和腹足類也各自聚為一支。在雙殼貝類的3種engrailed同源基因間,cgi-eng1先與刺牡蠣S.kegaki的engrailed基因聚成一支, 之后和cgi-eng2聚在一起。這提示cgi-eng1和刺牡蠣已報到的engrailed基因可能是直系同源基因。

2.3 原位雜交

作者在貝殼發(fā)生的關鍵時期——早期 D形幼蟲中, 利用整裝原位雜交技術研究了這兩個engrailed同源基因的表達情況。結果顯示,cgi-eng1和cgi-eng2基因mRNA均在長牡蠣幼蟲貝殼外緣高表達(圖4)。同時作者發(fā)現(xiàn),cgi-eng1和cgi-eng2的表達模式存在一定差異:cgi-eng1特異性表達于貝殼外緣, 在其他部位檢測不到表達; 而cgi-eng2雖然在貝殼外緣高表達, 但在其他部位亦有廣泛的表達。作者在陰性對照組(使用正義鏈探針)沒有檢測到信號, 證實了雜交結果的特異性。

圖1 長牡蠣cgi-eng1和cgi-eng2 cDNA序列和對應的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of cgi-eng1 and cgi-eng2

圖2 長牡蠣engrailed同源基因EH1-5結構域的多物種比較分析Fig.2 Multiple alignment of the five conserved domains of cgi-eng1 and cgi-eng2

3 討論

作者從長牡蠣幼蟲 cDNA中克隆到兩個engrailed同源基因cgi-eng1和cgi-eng2。其氨基酸序列預測結果顯示, Cgi-Eng1和Cgi-Eng2的結構高度保守, 包含5個結構域。其中EH4是同源異形結構域, 參與蛋白的相互作用。研究結果表明 Engrailed能與12種可溶性的核蛋白相互作用[21]。EH2和EH3能與Exd/Pbx蛋白相結合, 增加engrailed與DNA的結合能力; 而EH1和EH5參與轉錄抑制的激活[22]。多序列比對表明EH2保守性最高, 這與笠螺Patella vulgata的分析結果一致[3]。

由于其功能的重要性,engrailed基因一直發(fā)育生物學研究的熱點。已有研究結果表明,engrailed基因是一個古老的后生動物發(fā)育相關基因, 在演化過程中發(fā)生了多次獨立的復制、基因座的丟失及基因功能的分化等事件, 導致出現(xiàn)了大量的旁系同源基因[22]。目前, 在許多物種中都發(fā)現(xiàn)了多個engrailed基因。而現(xiàn)有軟體動物中的研究均只報道了一個engrailed同源基因[2,3]。作者推測, 軟體動物可能并非只存在一個engrailed同源基因, 而是由于基因組信息缺乏的原因導致部分成員尚未鑒定。在本研究中, 作者系統(tǒng)搜索了長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫, 得到兩條engrailed同源基因序列, 這驗證了作者的猜測。此外, 在聚類分析中, 雙殼貝類的engrailed同源基因并不與已報道的腹足類基因單獨聚在一起, 提示engrailed基因在腹足類和雙殼類可能經歷了單獨的演化過程, 這將是今后研究的一個重要問題。

圖3 長牡蠣engrailed同源基因氨基序列的聚類分析Fig.3 A phylogenetic tree of cgi-eng1 and cgi-eng2 constructed through the Neighbor-Joining method

圖4 長牡蠣cgi-eng1和cgi-eng2基因mRNA在長牡蠣早期D形幼蟲的分布情況Fig.4 Expression patterns of cgi-eng1 and cgi-eng2 in early D-veligers (14 hpf)

基于軟體動物engrailed基因參與貝殼發(fā)生過程的報道[3,14-16], 作者著重觀察了長牡蠣兩種engrailed同源基因與貝殼發(fā)生的相關性。作者選擇的早期D形幼蟲處于貝殼形成的關鍵時期, 此時貝殼由背部的一個小區(qū)域逐漸長大并最終覆蓋整個幼蟲。Nederbragt等[3]首次報道了engrailed在P.vulgata中表達于貝殼外緣, 并提出假說認為engrailed限定了貝殼發(fā)生的邊界; Kin等[2]在S.kegaki的早期D形幼蟲的研究結果也表明engrailed分布于貝殼外緣, 與腹足類的結果一致。作者在長牡蠣中的研究表明, 兩種engrailed同源基因均在貝殼外緣高表達, 與前人結果一致, 支持了engrailed可能參與貝殼發(fā)生的觀點。

除發(fā)現(xiàn)兩種engrailed同源基因均高表達于貝殼外緣外, 作者還發(fā)現(xiàn)兩種基因的表達模式存在差別。與cgi-eng1的特異性表達相比,cgi-eng2雖然也分布與貝殼外緣, 但在幼蟲其他部位亦有廣泛的表達,提示其不僅僅參與貝殼邊界的形成過程, 還可能發(fā)揮其他功能。這些功能是否局限于貝殼發(fā)生過程, 抑或還參于其他早期發(fā)育事件, 需要進一步的研究以加以佐證。

本研究基于長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫, 首次鑒定了長牡蠣的兩種engrailed同源基因, 展示了其與貝殼發(fā)生的相關性, 并提出二者可能存在功能差異。在下一步的工作中, 深入解析engrailed同源基因在貝殼發(fā)生中的具體功能, 及不同engrailed同源基因的功能差異將是研究的重點內容。此外, 本文中作者僅考察了一個關鍵發(fā)育時期的engrailed基因表達情況,而并未對engrailed在發(fā)育過程中的表達變化情況展開研究。在后續(xù)的工作中將有必要系統(tǒng)研究整個早期貝殼發(fā)育階段engrailed基因的表達情況, 比如從擔輪幼蟲(25~26 ℃時約11 hpf)到完全發(fā)育的D形幼蟲(約24 hpf)。這些研究一方面可以驗證作者的結論,另一方面還可能發(fā)現(xiàn)新的功能提示信息。

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