秦皇島海域“褐潮”海水對鹵蟲、輪蟲存活和攝食的影響研究

公 晗 , 孔凡洲 王云峰 顏 天 周名江

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島266071; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

褐潮通常是指由于海金藻綱(Pelagophyceae)微藻抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)或Aureoumbra lagunensis暴發(fā)性增殖而形成的藻華現(xiàn)象[1], 藻華發(fā)生期間, 水體呈現(xiàn)黃褐色。抑食金球藻呈金黃色, 球形, 直徑約為 2 μm[2]。A.lagunensis與抑食金球藻的形態(tài)相似, 直徑為4~5 μm[3]。

自1985年起, 美國東海岸抑食金球藻頻頻暴發(fā),暴發(fā)密度高于1.0 ×106個(gè)/mL[4], 給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失; 1990年~1996年, 德克薩斯州A.lagunensis暴發(fā)時(shí), 細(xì)胞密度最高達(dá)到1.0×107個(gè)/mL[5], 給海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大危害。自2009年起, 中國渤海秦皇島沿岸海域連續(xù) 5年暴發(fā)了褐潮, 導(dǎo)致當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖貝類大量滯長甚至死亡; 2010年, 河北省直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2億元[6]。褐潮的一個(gè)優(yōu)勢種為抑食金球藻, 其細(xì)胞密度最高達(dá)1.0×106個(gè)/mL[7]。

褐潮藻的不同株系毒性有差異[8], 中國褐潮毒性的研究還未見被報(bào)道, 相關(guān)研究亟待開展。浮游動(dòng)物是微藻的初級消費(fèi)者, 與藻華的發(fā)生及生態(tài)效應(yīng)有密切關(guān)系。國外已有研究表明, 褐潮會(huì)影響中、小型浮游動(dòng)物的生長、發(fā)育、攝食及繁殖等[9]。作者選取了海洋生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的模式生物——鹵蟲(Artemia salina)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis, 以下稱輪蟲)為對象, 研究了秦皇島褐潮現(xiàn)場海水對其存活、攝食的影響; 同時(shí)以3株室內(nèi)培養(yǎng)的褐潮藻(抑食金球藻CCMP 1984、CCMP 1850,A.lagunensisCCMP 1507)為參照, 首次初步評價(jià)了秦皇島褐潮的毒性, 為今后有關(guān)中國褐潮毒理的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

褐潮海水于2013年7月2日(褐潮暴發(fā)高峰期)采自秦皇島, 采集站位坐標(biāo)為119°25’54’E, 39°46’37’N。從采集至用于實(shí)驗(yàn), 時(shí)間約為1 h。

3株褐潮藻購于美國海藻及微生物中心(NCMA,原 CCMP), 球等鞭金藻(Isochrysis galbana, 以下簡寫為ISO)、小球藻(Chlorellasp., 以下簡寫為CHL)由中國科學(xué)院海洋研究所藻種中心提供。藻培養(yǎng)溫度為18℃, 光暗比為14 h: 10 h。用于藻類培養(yǎng)的海水引自青島膠州灣外太平角無污染海水, 使用前經(jīng)沉淀沙濾、0.45 μm混合纖維濾膜過濾, 高溫煮沸消毒。選擇生長良好的指數(shù)期藻液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)用鹵蟲為鹵蟲卵經(jīng)23 ℃海水孵化得到的無節(jié)幼體 (instar II-Ⅲ)。輪蟲由中國科學(xué)院海洋研究所培養(yǎng)中心提供, 為實(shí)驗(yàn)室常年培養(yǎng)種。

1.1 褐潮海水中浮游植物色素及類群分析

褐潮海水經(jīng) 20 μm篩絹過濾后, 在血球計(jì)數(shù)板下進(jìn)行鏡檢。過濾50 mL于GF/F玻璃纖維濾膜(平均孔徑0.68 μm), 取6個(gè)平行樣用于色素分析。色素分析用內(nèi)標(biāo)(Internal Standard, IS)為 8′-阿樸-β, ψ-胡蘿卜醛(Apocarotenal, Apo)。所用材料與試劑、樣品的預(yù)處理、高效液相色譜(HPLC)分析及浮游植物類群的 CHEMTAX分析方法參照孔凡洲等[10]。根據(jù)Kong等[11]中給出的But含量與褐潮藻的細(xì)胞密度關(guān)系, 計(jì)算得到現(xiàn)場海水中褐潮藻的細(xì)胞密度。

1.2 浮游動(dòng)物存活實(shí)驗(yàn)

1.2.1 鹵蟲存活實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用24孔培養(yǎng)板, 每孔加入1 mL測試藻液。在解剖鏡下用滴管將鹵蟲轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板各孔中,每孔分別放10只鹵蟲。

秦皇島褐潮海水及 3株美國褐潮藻分別用于實(shí)驗(yàn)中, 現(xiàn)場海水中褐潮藻、CCMP1984、CCMP 1850、CCMP 1507密度分別為8.0 × 105(HPLC計(jì)算結(jié)果)、1.5 × 107、1.5 × 107、1.0× 106個(gè)/mL。以球等鞭金藻(1.0 × 105個(gè)/mL)為對照組, 另設(shè)滅菌海水為饑餓組,每組3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行48 h, 24 h 時(shí)更換新鮮實(shí)驗(yàn)液, 分別于24、48 h記錄鹵蟲存活數(shù)。

CCMP 1507(1.0 × 106個(gè)/mL)經(jīng) 0.45 μm 混合纖維濾膜過濾濃縮后(過濾負(fù)壓不超過 5 kPa), 將藻細(xì)胞重新懸浮于與原藻液等體積的新鮮海水中; 取部分藻細(xì)胞重懸液, 用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎; 藻細(xì)胞重懸液、藻細(xì)胞破碎液和去藻過濾液分別用于實(shí)驗(yàn)中。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行60 h, 24 h 時(shí)更換新鮮實(shí)驗(yàn)液, 分別于12、24、36、48、60 h 記錄鹵蟲存活數(shù)。

1.2.2 輪蟲存活實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)容器、實(shí)驗(yàn)體積、實(shí)驗(yàn)對象數(shù)目及實(shí)驗(yàn)用藻密度設(shè)置同 1.2.1。實(shí)驗(yàn)前, 挑選掛卵輪蟲置于滅菌海水中培養(yǎng)24 h, 吸取剛出生4 h以內(nèi)的幼體用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以小球藻(1.0 × 106個(gè)/mL)為對照組, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24 h, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄輪蟲存活數(shù)。

1.3 浮游動(dòng)物攝食實(shí)驗(yàn)

1.3.1 鹵蟲攝食實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在黑暗條件下進(jìn)行, 實(shí)驗(yàn)溫度為 20 ℃, 實(shí)驗(yàn)時(shí)間為8 h, 實(shí)驗(yàn)容器為500 mL燒杯, 實(shí)驗(yàn)體積為300 mL, 每個(gè)燒杯分別加入鹵蟲 600~700只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 以篩絹濾出鹵蟲, 用滅菌海水反復(fù)沖洗后,取100只濾于GF/F 玻璃纖維濾膜上。將濾膜放入棕色瓶中, 加入5 mL 90%的丙酮溶液, 冰浴超聲破碎,放入 4 ℃冰箱中避光萃取 24 h, 采用特納(Turner Designs) 熒光計(jì)測出熒光值求出鹵蟲體內(nèi)色素含量。按照王榮[12]所做改進(jìn), 以葉綠素 a 與脫鎂葉綠酸 a 的絕對含量(ng/個(gè))來定量鹵蟲體內(nèi)色素。將攝食量定義為:

式中,F為實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)每只鹵蟲的攝食量;c(Chla)和c(Pha.A) 分別為實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)每只鹵蟲體內(nèi)葉綠素 a和脫鎂葉綠酸a 含量。

實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分: (1)單獨(dú)投喂褐潮海水或美國褐潮藻; (2)投喂褐潮海水或美國褐潮藻與球等鞭金藻混合餌料。現(xiàn)場海水中褐潮藻、CCMP 1984、CCMP 1850、CCMP 1507 密度分別為 8.0 × 105、5.0 ×105、5.0 × 105、5.0 × 104個(gè)/mL。所有實(shí)驗(yàn)都設(shè)置等生物量的球等鞭金藻(5.0 × 104個(gè)/mL)為對照組、滅菌海水為饑餓組, 每組3個(gè)平行。

1.3.2 輪蟲攝食實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料與方法類似于 1.3.1, 不同之處為: 實(shí)驗(yàn)前, 將輪蟲置于滅菌海水中饑餓處理 24 h; 每個(gè)燒杯分別加入輪蟲1 000~1 200只; 實(shí)驗(yàn)采用小球藻(3.0 × 105個(gè)/mL)為對照組。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 采用 LSD和 Duncans比較各處理組的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐潮現(xiàn)場海水分析結(jié)果

2.1.1 鏡檢結(jié)果

過濾后的樣品在顯微鏡下觀察, 樣品中主要為2~4 μm金黃色球形藻, 在血球計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)得到細(xì)胞密度約為1.0× 106個(gè)/mL。

2.1.2 色素組成

如圖1所示, 在微型和微微型浮游植物樣品中,主要色素組分是 19’-丁酰氧基巖藻黃素(19’-butanoyloxyfucoxanthin, But)、巖藻黃素(Fucoxanthin,Fuco)、硅甲藻黃素(Diadinoxanthin, Diad)和葉綠素a(Chlorophylla, Chla), 此外還有微量的多甲藻素(Peridinin, Peri)、19’-己酰氧基巖藻黃素(19’-hexanoyloxyFucoxanthin, Hex)、別黃素(Alloxanthin, Allo)、玉米黃素(Zeaxanthin, Zea)、葉黃素(Lutein, Lut)。結(jié)合鏡檢結(jié)果, 表明現(xiàn)場海水中有海金藻、硅藻、定鞭藻、隱藻、綠藻、藍(lán)藻、甲藻, 且主要為海金藻。

圖1 微型及微微型浮游植物樣品的色素分析色譜(檢測波長440 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of nano-sized and pico-sized phytoplankton samples (Detection wave length at 440 nm)

2.1.3 不同浮游植物類群對Chla含量的貢獻(xiàn)

應(yīng)用 CHEMTAX軟件, 構(gòu)建海金藻、硅藻、定鞭藻、隱藻、綠藻、藍(lán)藻、甲藻 7類微藻的色素比率初始矩陣如表1初始色素, 對該矩陣進(jìn)行優(yōu)化后得到最終矩陣如表1最終色素所示。應(yīng)用這一矩陣,計(jì)算了不同浮游植物類群的 Chla含量, 得到各類群Chla含量占總Chla含量比例, 做圖2。可以看出, 浮游植物樣品中主要為海金藻, 比例高達(dá)72.6%。

圖2 基于CHEMTAX分析的各微藻類群比例Fig.2 Ratios of different phytoplankton groups based on the results of CHEMTAX

表1 CHEMTAX分析中不同微藻類群的初始和最終色素比率矩陣Tab.1 Input and output ratios of marker pigments to Chla for the selected phytoplankton groups

2.2 褐潮對浮游動(dòng)物存活的影響

2.2.1 褐潮對鹵蟲存活的影響

鹵蟲無節(jié)幼體在各處理組中24、48 h的存活率如圖3所示。在褐潮海水中, 鹵蟲48 h存活率下降至 77%, 與對照組有顯著差異, 與饑餓組無顯著差異。在CCMP 1507中, 鹵蟲24 h存活率僅為60%, 48 h存活率僅為 30%, 與對照組有顯著差異。在 CCMP 1984、CCMP 1850實(shí)驗(yàn)組中, 鹵蟲48 h存活率與對照組無顯著差異, 存活率在90%以上。

圖3 投喂單一餌料時(shí)鹵蟲的存活率Fig.3 Survival of Artemia salina exposed to a unialgal diet

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 探究CCMP 1507不同組分對鹵蟲存活的影響。實(shí)驗(yàn)表明(圖4), 鹵蟲在藻細(xì)胞重懸液、藻細(xì)胞破碎液中的存活率急劇下降, 60 h 內(nèi)全部死亡, 存活率顯著低于對照組及饑餓組; 鹵蟲在藻濾液中的存活率下降趨勢與饑餓組無顯著差異。即藻細(xì)胞重懸液、藻細(xì)胞破碎液顯著降低鹵蟲存活率, 藻濾液對鹵蟲的存活無顯著影響。表明該藻的毒性主要來自藻細(xì)胞。

圖4 鹵蟲在CCMP 1507不同組分中的存活率Fig.4 Survival of Artemia salina exposed to different components of CCMP 1507

2.2.2 褐潮對輪蟲存活的影響

各實(shí)驗(yàn)組輪蟲24 h存活率均為100%(圖5), 褐潮海水及美國3株褐潮藻對輪蟲都沒有急性致死效應(yīng)。

圖5 投喂單一餌料時(shí)輪蟲的存活率Fig.5 Survival of Brachionus plicatilis exposed to a unialgal diet

2.3 褐潮對浮游動(dòng)物攝食的影響

2.3.1 褐潮對鹵蟲攝食的影響

圖6表示分別單獨(dú)投喂褐潮海水、CCMP 1984、CCMP 1850、CCMP 1507時(shí), 鹵蟲8 h的攝食量?？梢婝u蟲在褐潮海水中的攝食量與饑餓組無顯著差異,表明鹵蟲不攝食褐潮海水中微藻。鹵蟲在 3株美國褐潮藻中的攝食量顯著低于對照組。

圖6 投喂單一餌料時(shí)鹵蟲的攝食量Fig.6 Ingestion of Artemia salina on a unialgal diet

圖7表示分別投喂褐潮海水、CCMP 1984、CCMP 1850、CCMP 1507與金藻混合餌料時(shí), 鹵蟲8 h的攝食量。結(jié)果表明, 在褐潮海水與金藻混合餌料中, 鹵蟲可以攝食, 但攝食量顯著低于對照組, 8 h內(nèi)攝食量由(5.5±0.4)ng/個(gè)降至(2.4±0.4)ng/個(gè)。表明褐潮海水對鹵蟲的攝食有抑制作用。CCMP 1507具有相同的效應(yīng)。在CCMP 1984與金藻的混合餌料中, 鹵蟲的攝食量高于對照組; 在CCMP 1850與金藻的混合餌料中, 鹵蟲的攝食量與對照組無顯著差異, 表明這兩株藻對鹵蟲的攝食沒有抑制作用。

圖7 投喂混合餌料時(shí)鹵蟲的攝食量Fig.7 Ingestion of Artemia salina on a mix diet

2.3.2 褐潮對輪蟲攝食的影響

圖8表示分別單獨(dú)投喂褐潮海水、CCMP 1984、CCMP 1850、CCMP 1507時(shí), 輪蟲8 h的攝食量。可見輪蟲在褐潮海水中攝食量顯著低于對照組, 與饑餓組無顯著差異, 表明輪蟲不攝食現(xiàn)場海水中微藻。輪蟲對CCMP 1507的攝食量顯著低于對照組。輪蟲對CCMP 1984、CCMP 1850的攝食量與對照組無顯著差異。

圖8 投喂單一餌料時(shí)輪蟲的攝食量Fig.8 Ingestion of Brachionus plicatilis on a unialgal diet

圖9表示分別投喂褐潮海水、CCMP 1507與小球藻混合餌料時(shí), 輪蟲8 h的攝食量。結(jié)果表明, 輪蟲在混合餌料中, 8 h內(nèi)攝食量由(1.5±0.2)ng/個(gè)分別下降至(0.9±0.1)ng/個(gè)、(0.5±0.3)ng/個(gè)。表明褐潮海水及CCMP 1507對鹵蟲的攝食有抑制作用。

圖9 投喂混合餌料時(shí)輪蟲的攝食量Fig.9 Ingestion of Brachionus plicatilis on a mix diet

3 討論

3.1 秦皇島褐潮對浮游動(dòng)物的潛在危害

本研究首次初步評價(jià)了秦皇島褐潮對兩種浮游動(dòng)物——鹵蟲及輪蟲存活、攝食的毒性。結(jié)果表明, 秦皇島褐潮會(huì)影響鹵蟲的存活, 抑制鹵蟲、輪蟲的攝食。

暴露于褐潮海水中, 鹵蟲24 h存活率未受到影響, 而 48 h存活率與饑餓組無顯著差異, 表明鹵蟲48 h存活率的下降可能是饑餓導(dǎo)致的, 這一點(diǎn)也得到了鹵蟲攝食實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。結(jié)合現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)與室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明, 與以往赤潮藻毒性特點(diǎn)不同, 褐潮藻的急性致死效應(yīng)不明顯, 其危害主要表現(xiàn)為對海洋生物攝食的影響。

秦皇島褐潮藻不僅影響兩種浮游動(dòng)物攝食, 而且抑制浮游動(dòng)物對其他餌料藻的攝食。長期暴露于褐潮發(fā)生海域, 浮游動(dòng)物的生長很可能受到抑制,進(jìn)而導(dǎo)致浮游動(dòng)物生物量的降低, 從而更有利于微藻的生長使得藻華得以長時(shí)間持續(xù)。由于浮游動(dòng)物對藻細(xì)胞大小具有攝食選擇性, 所以褐潮對與鹵蟲、輪蟲大小相近的其他浮游動(dòng)物或者貝類的階段性浮游幼蟲也可能會(huì)產(chǎn)生一定的危害效應(yīng), 進(jìn)而對整個(gè)浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響, 最終通過食物鏈影響整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)。因此秦皇島褐潮對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響值得密切關(guān)注。

就浮游動(dòng)物的毒性而言, 秦皇島褐潮的毒性效應(yīng)與CCMP 1507毒性效應(yīng)相似, CCMP 1984、CCMP 1850的毒性相對較弱。實(shí)驗(yàn)所用CCMP 1507密度遠(yuǎn)低于現(xiàn)場密度, 對鹵蟲的存活、攝食產(chǎn)生了顯著抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)所用CCMP 1984、CCMP 1850密度遠(yuǎn)高于現(xiàn)場密度, 對鹵蟲沒有產(chǎn)生致死效應(yīng), 并且在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)這兩株藻對鹵蟲、輪蟲攝食的抑制效應(yīng)。

在本研究中, 鹵蟲、輪蟲對 CCMP 1984、CCMP 1850的攝食表現(xiàn)出了不同的效應(yīng): 前者對兩株藻的攝食量較低, 而后者可以正常攝食。Smith等[13]曾報(bào)道湯氏紡錘水蚤(Acatia tonsa)無節(jié)幼蟲不攝食 CCMP 1850。這些不同效應(yīng)可能與浮游動(dòng)物的攝食選擇性有關(guān)。此外, Bricelj[9]曾報(bào)道CCMP 1784 (CCMP 1984的無菌株)降低猛水蚤(Coullana canadensis)無節(jié)幼蟲及紡錘水蚤橈足幼蟲的存活率, 但是本研究中作者并未觀察到CCMP 1984對鹵蟲、輪蟲的致死效應(yīng), 表明不同的浮游動(dòng)物對褐潮藻的敏感性可能不同。

3.2 褐潮藻的毒性來源

本研究結(jié)果表明, CCMP 1507的毒性主要來源于藻細(xì)胞。但是這種毒性物質(zhì)具體是何種物質(zhì), 目前相關(guān)的研究還很少。

有學(xué)者[14-15]認(rèn)為,A.lagunensis可能產(chǎn)生一種抑制浮游動(dòng)物攝食的物質(zhì)[3]。例如, 抑食金球藻和A.lagunensis都含有高濃度的二甲頸基丙酸內(nèi)鹽(DMSP)。但是目前有關(guān) DMSP對浮游動(dòng)物攝食的抑制作用并不清楚, 例如Chrysochromulina polylepis與Phaeocystis pouchetii都產(chǎn)生大量的 DMSP, 前者抑制挺挺蟲(Tintinnid)的生長及攝食, 后者卻可以被多種浮游動(dòng)物攝食[16-17]。

在本實(shí)驗(yàn)中, 作者只觀察到在 CCMP 1984、CCMP 1850中鹵蟲的攝食量低, 但并未發(fā)現(xiàn)這兩株藻抑制鹵蟲攝食其他藻, 因此無法推斷二者是否產(chǎn)生藻毒素。盡管有學(xué)者[18-19]認(rèn)為, 抑食金球藻對捕食者的抑制作用主要是細(xì)胞產(chǎn)生毒素引起的, 但是這一觀點(diǎn)主要是通過研究抑食金球藻對貝的危害效應(yīng)得出的推論。例如, 目前有很多學(xué)者認(rèn)同抑食金球藻產(chǎn)生的抑制物質(zhì)可能是存在于胞外多糖聚合物(EPS)層中類似多巴胺(DA)的一種物質(zhì)。但是, 目前并未檢測到該藻產(chǎn)生的毒素物質(zhì)[4,20], 因此有關(guān)抑食金球藻產(chǎn)毒的結(jié)論依舊存在爭議。鑒于中國還未分離到褐潮藻的純種藻株, 有關(guān)中國褐潮藻的分離、毒害效應(yīng)、影響機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步開展。

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