基于胰腺胰島素及其受體變化探討黃芪葛根配伍調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖的交互作用*

郝明芬，范 穎△，李 新，李艷敏，劉 燁，劉 麗

(1．遼寧中醫(yī)藥大學方劑學科，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，沈陽 110847;3．遼寧中醫(yī)藥大學數(shù)學教研室，沈陽 110847)

基于胰腺胰島素及其受體變化探討黃芪葛根配伍調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖的交互作用*

郝明芬1，2，范 穎1，2△，李 新3，李艷敏1，2，劉 燁1，2，劉 麗1，2

(1．遼寧中醫(yī)藥大學方劑學科，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，沈陽 110847;3．遼寧中醫(yī)藥大學數(shù)學教研室，沈陽 110847)

目的:探討黃芪與葛根配伍對糖尿病大鼠糖代謝的影響及其交互作用。方法:66只SD雄性大鼠按隨機血糖分為正常組、模型組、中藥對照組、黃芪組、葛根組、黃芪葛根湯組，采用STZ腹腔注射誘導糖尿病大鼠模型檢測血糖水平及胰腺組織胰島素(insulin，INS)、胰島素受體(insulin receptor，InsR)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter 4，GLUT4)濃度。結(jié)果:模型組大鼠血糖升高，胰腺組織INS、InsR、GULT4濃度顯著下降;黃芪與葛根均具有降糖之效，但未呈現(xiàn)交互作用;黃芪可提高胰腺INS、InsR、GULT4濃度，葛根僅提高胰腺GULT4濃度且二者無交互作用。結(jié)論:黃芪與葛根配伍降血糖未呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，推測可能與其各自通過不同環(huán)節(jié)改善胰腺INS、InsR、GULT4水平有關(guān)。

黃芪葛根配伍;糖尿病模型;胰島素;胰島素受體;葡萄糖轉(zhuǎn)運體4;交互作用

葛根、黃芪是我國古今醫(yī)者治療消渴(糖尿病)的常用中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中指出葛根“主消渴”，《日華子本草》指出黃芪治“消渴”，其后《證治匯補》載錄黃芪、葛根按2∶1比例組成黃芪葛根湯?，F(xiàn)代研究表明，黃芪、葛根及黃芪葛根湯均具有降低糖尿病血糖、改善胰島素抵抗等作用。［1-5］218本文旨在探討黃芪與葛根配伍對糖尿病大鼠胰腺組織胰島素(insulin，INS)、胰島素受體(insulin receptor，InsR)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter 4，GLUT4)的影響及其交互作用，初步闡釋方藥之間的關(guān)系，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

66只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(240±20)g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司(合格證編號SCXK2010-0001)。大鼠給予普通飼料(遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供)，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗室。

1.2 藥物

蒙古黃芪 Astragalus membranaceus(Fisch．) Bge．var．mongholicus(Bge．)Hsiao的干燥根，產(chǎn)地內(nèi)蒙;野葛Pueraria lobata(Willd．)Ohwi的干燥根，產(chǎn)地廣西，一次性購于遼寧貴今生物醫(yī)藥有限公司，由遼寧中醫(yī)藥大學鑒定教研室李峰教授鑒定為正品。金芪降糖片(0.42 g/片，天津中新藥業(yè)集團股份有限公司隆順榕制藥廠(國藥準字Z10920027，生產(chǎn)批號1112724)為本實驗的陽性對照藥，鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司，批號04M1357)為本實驗的造模藥。

1.3 試劑

血糖試紙(穩(wěn)豪型，強生(中國)醫(yī)療器材有限公司提供，批號 3293141);水合氯醛 (批號T20080926)購自國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉注射液(0.9%)購自吉林科倫康乃爾制藥有限公司;胰島素、胰島素受體、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(AMEKO公司提供，批號201211)。

1.4 主要儀器

Lifescan血糖檢測儀(強生(中國)醫(yī)療器材有限公司)，550型微孔酶標儀(美國Blo-Rad公司)，BL610型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，TDL-5-4型離心機(上海安亭科學儀器廠)，WS2-261-79型電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)，DY89-2型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，TBA-40FR型生化分析儀(東芝醫(yī)療系統(tǒng)(中國)有限公司)。

2 方法

2.1 中藥制備

中藥飲片黃芪、葛根、黃芪葛根湯(將黃芪、葛根按2∶1配比)均浸泡40 min，分別加10、8、6倍水量煎煮3次，時間2.5 h、2.0 h、1.5 h，合并煎液濃縮至含生藥量黃芪0.27 g/mL、葛根0.135 g/mL，黃芪葛根湯0.405 g/mL，放冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型建立

按46 mg/kg體質(zhì)量劑量給SD大鼠一次性腹腔注射2%的STZ溶液(以0.1 mol/L，pH 4.2的檸檬酸鈉緩沖液配制)，造模第7天尾靜脈取血測定隨機血糖。血糖≥16.8 mmol/L確定模型成功，統(tǒng)計處理時剔除未成模樣本。

2.3 分組處理

以血糖作為分層因素，采用分層隨機法將66只大鼠分為正常組、模型組、中藥對照組(金芪降糖片)、黃芪組、葛根組、黃芪葛根湯組各11只。造模前各組間血糖水平比較差異無統(tǒng)計學意義。除正常組外，其他各組均以造模處理，造模后觀測30 d。

2.4 給藥劑量

造模同日給藥，按成人日服黃芪生藥量30 g、葛根15 g、黃芪葛根湯45 g(成人按70 kg體質(zhì)量)計算，根據(jù)體表面積換算大鼠的等效劑量為成人的6.3倍。正常組、模型組給予等量蒸餾水10 mL/kg，中藥對照組、黃芪組、葛根組、黃芪葛根湯組分別按1.47、2.7、1.35、4.05 g/kg·d體質(zhì)量劑量灌胃，各組連續(xù)灌胃30 d。

2.5 標本制備

于造模第30天以10%水合氯醛溶液4 mL/kg腹腔注射麻醉動物，摘取胰腺組織進行相關(guān)指標檢測。胰腺組織處理:稱取0.1 g的胰腺組織并剪碎，加9倍量0.9%氯化鈉溶液，制成10%的組織勻漿液，3000 r/min離心20 min留取上清液，于－80℃保存、備檢。

2.6 指標檢測

檢測血糖(強生血糖儀檢測)和胰腺組織INS、InsR、GLUT4(ELISA法檢測)。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，藥物組間比較采用單因素方差分析加兩兩比較(LSD法)，2種藥物間的交互效應(yīng)采用析因設(shè)計方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對糖尿病大鼠血糖的影響

表1顯示，造模前各組大鼠血糖水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);造模第30天與正常組比較，模型組大鼠血糖顯著升高(P＜0.05);黃芪、葛根均有降糖作用，葛根的作用效果較佳，二藥交互作用無統(tǒng)計學意義。

表1 對糖尿病大鼠血糖的影響(±s，mmol/L)

表1 對糖尿病大鼠血糖的影響(±s，mmol/L)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與模型組比較:▲P＜0.05;與中藥對照組比較:◆P＜0.05

組別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) 造模前血糖 治療30 d 血糖正 常 組11 —8.81±1.17 6.14±0.60 模 型 組 11 — 8.35±1.08 28.38±2.46*中 藥 對 照 組 11 1.47 8.40±1.13 26.49±4.29 黃 芪 組 11 2.7 8.46±1.01 21.84±4.63▲葛 根 組 11 1.35 8.28±1.16 16.97±7.04▲◆黃 芪葛根湯組 11 4.05 8.57±1.05 16.16±4.25▲◆黃芪×葛根(P)11 0.058

3.2 對糖尿病大鼠胰腺組織INS、InsR、GLUT4濃度的影響

表2表示，與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織INS、InsR、GLUT4濃度均明顯降低(P＜0.05)。黃芪對INS、InsR濃度有提升作用，葛根的作用不明顯，兩藥交互作用均無統(tǒng)計學意義;黃芪、葛根對GLUT4濃度均有提升作用，二藥作用效果無明顯不同，兩藥交互作用不明顯。

4 討論

胰腺的胰島細胞分泌INS與靶細胞表面的InsR特異性結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)節(jié)血糖、蛋白質(zhì)、脂肪等三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的生理功能［6-7］。GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運是機體糖代謝的關(guān)鍵限速步驟，INS與InsR結(jié)合后，通過磷酸化PI3K/Akt，引起GLUT4由細胞內(nèi)向質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，介導外周組織對葡萄糖的攝取和利用［8-9］。因此，胰腺功能受損、INS分泌不足及InsR蛋白表達減少或GLUT4基因表達減少與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)［10-11］。STZ誘導實驗動物糖尿病的主要機制，是造成胰島細胞損傷、引起INS分泌不足和InsR數(shù)目減少而使血糖持續(xù)升高的原因［12-13］。

表2 對糖尿病大鼠胰腺INS、InsR、GLUT4的影響(±s)

表2 對糖尿病大鼠胰腺INS、InsR、GLUT4的影響(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與模型組比較:▲P＜0.05;與中藥對照組比較:◆P＜0.05

組別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) INS(mU/L) InsR(ng/mL) GLUT4(ng/mL)正常組 11 —7.25±0.280 12.83±1.990 8.04±0.660模型組 11 — 4.84±0.130*10.69±1.670*6.27±0.580*中 藥 對 照 組 11 1.47 4.90±0.110 10.78±1.710 6.35±0.590黃芪組 11 2.7 6.92±0.170▲◆12.55±2.040▲◆7.31±0.690▲◆葛根組 11 1.35 4.96±0.820 11.09±1.760 6.95±1.180▲◆黃 芪 葛 根 湯 組 11 4.05 7.08±0.120▲◆12.52±2.020▲◆7.26±0.690▲◆黃芪 ×葛根(P)11 0.641 0.710 0.146

本實驗研究結(jié)果顯示，黃芪、葛根均具有降糖作用，與文獻報道一致［1-4］，但二藥效應(yīng)強度不同，且兩者配伍并未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。結(jié)果還顯示，黃芪對胰腺INS、InsR有提高作用，葛根作用不明顯;二藥均可提高胰腺GLUT4濃度，但配伍后對上述指標均未呈現(xiàn)交互作用。由此推測，黃芪、葛根配伍降低糖尿病大鼠血糖的作用，可能與其促進胰腺胰島素分泌、增加胰島素受體數(shù)目、提高胰腺GLUT4濃度有關(guān)。同時亦提示，方藥效應(yīng)之間存在離合，方劑整體與部分藥物之間并非都是整體大于部分之和，也存在整體等于部分或小于部分之和。有關(guān)黃芪與葛根配伍如何協(xié)同調(diào)節(jié)糖代謝的作用靶點與環(huán)節(jié)，亟待今后進一步深入研究。

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Exploration of the Interaction of Compatibility of Radix Astragali and Radix Puerariae Based on the Change INS and InsR in Pancreas of Diabetic Rats

HAO Ming-fen1，2，F(xiàn)AN Ying1，2△，LI Xin3，LI Yan-min1，2，LIU Ye1，2，LIU Li1，2
(1．Prescription Disciplines，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine(TCM)，Shenyang 110847，China; 2．Key Laboratory of Ministry of TCM Theory and Applications of Ministry of Education，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China;3．Department of Mathematics，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:This study was designed to investigate the effect and interaction of compatibility of Radix Astragali and Radix Puerariae on glucose metabolism in diabetic rats．Methods:According to glucose，66 male SD rats were randomly divided into normal group，model group，positive control group，Radix Astragali group，Radix Puerariae group and Huangqi Gegen decoction group．Diabetes rats were induced by STZ(peritoneal injection)．The blood glucose levels was detected with a glucose meter．ELISA assay of insulin(INS)，insulin receptor(InsR)and glucose transporter 4(GLUT4) in pancreas were administrated．The effect of each drug and their interaction were analyzed with ANOVA and factorial design analysis of variance．Results:The blood glucose of diabetic rats ascended，and INS，InsR，GLUT4 in pancreas descended significantly;Radix Astragali and Radix Puerariae had the effect of decreasing glucose，but could not interact; Radix Astragali could increase pancreatic INS，InsR，GULT4 concentration．Radix Puerariae only increased GULT4 concentration，and there was no interaction between them．Conclusion:The effect of compatibility of Radix Astragali and Radix Puerariae on decreasing glucose did not show the synergistic，it may be related to their respective effects on improving INS，InsR，GLUT4 through different links．

Compatibility of Radix Astragali and Radix Puerariae;Diabetes Mellitus;INS;InsR;GLUT4;Interaction

R285.5

B

1006-3250(2015)10-1245-03

2015-02-16

國家自然科學基金資助項目(81273653)

郝明芬(1989-)，女，山東濰坊人，在讀碩士，從事中藥復(fù)方配伍規(guī)律及其效應(yīng)機制研究。

范 穎(1962-)，女，教授，博士研究生導師，從事方劑配伍規(guī)律研究，Tel:024-31207104，E-mail:lnzyfy@ 126．com。