川芎嗪對(duì)乏氧人肺癌細(xì)胞β1-整合素及鈣依賴黏附素表達(dá)的影響*

任為民，張培彤，張明輝

(1．河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

川芎嗪對(duì)乏氧人肺癌細(xì)胞β1-整合素及鈣依賴黏附素表達(dá)的影響*

任為民1，2，張培彤2△，張明輝2

(1．河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

目的:探討川芎嗪對(duì)乏氧人巨細(xì)胞肺癌(PG)細(xì)胞表達(dá)β1-整合素和鈣依賴黏附素的影響。方法:PG細(xì)胞復(fù)蘇，分為川芎嗪高、中、低劑量組及順鉑組、陰性對(duì)照組，置常氧和低氧環(huán)境培養(yǎng)，檢測(cè)E-cadherin(CD324)、β1-整合素(CD29)的表達(dá)。結(jié)果: PG細(xì)胞CD324常氧組表達(dá)大于低氧組;在常氧和低氧環(huán)境中，各實(shí)驗(yàn)組CD324表達(dá)均大于對(duì)照組;常氧組CD29表達(dá)低于低氧組。結(jié)論:在乏氧環(huán)境下PG細(xì)胞有更高的轉(zhuǎn)移能力，川芎嗪能夠抑制PG細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞;川芎嗪;β1-整合素;鈣依賴黏附素

細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的異常與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。整合素β-catenin表達(dá)的上調(diào)有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。鈣相關(guān)黏附素E-cadherin失活變異則促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［2］。組織微環(huán)境缺氧通過上調(diào)β-catenin、下調(diào)E-cadherin增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［3］。本實(shí)驗(yàn)利用川芎嗪(TMP)干預(yù)常氧、低氧微環(huán)境下生長(zhǎng)的人高轉(zhuǎn)移性巨細(xì)胞肺癌(PG)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PG細(xì)胞表面 E-cadherin (CD324)及β1-整合素(CD29)表達(dá)的變化來研究川芎嗪對(duì)PG細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

PG細(xì)胞由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基:GIBCO;胎牛血清(FBS):中國(guó)杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶(Trypsin):Amresco產(chǎn)品;鹽酸川芎嗪:中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào) 110817-200305;順鉑(DDP):云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)090911; PE anti-human CD324(E-Cadherin):美國(guó)Biolegend; PE Mouse IgG1，κIsotype Ctrl(FC):美國(guó)Biolegend; PE MouseAnti-Human CD29:美國(guó) BD;PE Mouse IgG2a，κIsotype Control:美國(guó)Milipore。CO2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱:日本Sanyo公司;低氧工作站INVIVO2200:英國(guó)RUSKINN公司;超凈工作臺(tái):北京長(zhǎng)城空氣凈化工程公司;電子天平:Saitorius BS400S，北京賽多利斯天平有限公司;可調(diào)式微量加樣器:德國(guó)Eppendorff公司;TE200-U熒光倒置顯微鏡:日本Nikon。

1．3 方法

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇PG細(xì)胞，用含有10%FBS、10萬u/L青霉素、10萬u/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，分別置于常氧環(huán)境(CO2培養(yǎng)箱: 5%CO2、95%空氣)、低氧環(huán)境(低氧工作站:5% O2、5%CO2、90%N2)傳代培養(yǎng)。

1．3．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PG細(xì)胞CD324、CD29表達(dá) 取常氧和乏氧培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PG細(xì)胞，胰酶消化，以1×105/ml的密度懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后分別加入以 10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液配制的鹽酸川芎嗪(TMP)，使其終濃度分別為 240 μg/ml(TMPH)、120 μg/ml (TMPM)、10 μ g/ml(TMPL)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(Control，只加細(xì)胞和培養(yǎng)液)、順鉑組(DDP，2 μg/ ml)作為陽性對(duì)照，分別置常氧和低氧培養(yǎng)48 h，各組PG細(xì)胞用胰酶消化，以PBS液(pH 7.4)吹打收集細(xì)胞，再以PBS洗2遍，復(fù)懸于PBS溶液中(1× 106cells/100 μL)。加入流式上樣管，每管100 μL，每組分設(shè)實(shí)驗(yàn)管和同型對(duì)照管，實(shí)驗(yàn)管分別加入CD29 PE(20 μL)、CD324 PE(20 μL)，同型對(duì)照分別加入PE Mouse IgG2a、κ Isotype Control(20 μL)、PE Mouse IgG1、κ Isotype Ctrl(20 μL)，37℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，過200目尼龍篩網(wǎng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣品收集104個(gè)細(xì)胞。測(cè)定采用美國(guó)BD公司出品的FACS Calibur分析型流式細(xì)胞儀。機(jī)器測(cè)試條件為FSC電壓E-1，增益6.14，線性;SSC電壓320mv，增益1.00，線性;FL1電壓400 mv，對(duì)數(shù);FL2電壓340 mv，對(duì)數(shù);激光功率15 mv，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm。校正機(jī)器后，先以前向角和側(cè)向角散射光形成的細(xì)胞散點(diǎn)圖設(shè)定收集門，以固定條件收集樣本。每個(gè)樣品管收集104個(gè)腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行分析，采用Macintosh Quadra 650計(jì)算機(jī)和Cell Quest軟件收集處理樣品數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并得出結(jié)論。

1．3．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常氧和低氧培養(yǎng)PG細(xì)胞CD324表達(dá)情況

表1圖1顯示，在常氧和低氧環(huán)境中，各試驗(yàn)組PG細(xì)胞 CD324表達(dá)陽性率均大于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 PG細(xì)胞CD324的表達(dá)(±s)

表1 PG細(xì)胞CD324的表達(dá)(±s)

注:與control比較:aP＜0.05，aaP＜0.01

藥物 藥物濃度(μg/ml)常氧熒光強(qiáng)度TMP 240 57.80±13.86aa11.52±2.74 32.82±15.49aa低氧表達(dá)陽性率(%) 熒光強(qiáng)度 表達(dá)陽性率(%) 16.58±6.96 TMP 120 49.66±16.55aa11.42±1.01 40.60±21.56aa14.74±6.19 TMP 10 41.70±19.02a11.62±2.16 25.11±14.39a14.39±7.10 DDP 2 44.31±14.81aa16.70±5.06 34.44±17.56aa20.00±7.28 Control — 20.79±11.05 11.52±2.74 9.16±8.16 16.01±9.13

圖1 PG細(xì)胞CD324表達(dá)情況(N常氧，H低氧)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常氧和低氧培養(yǎng)PG細(xì)胞CD29表達(dá)

表2圖2顯示，PG細(xì)胞CD29在常氧和低氧微環(huán)境中各組的表達(dá)陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但常氧對(duì)照組CD29表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度低于低氧對(duì)照組(P＜0.01)。

3 討論

β1整合素介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附反應(yīng)與肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［4］。鈣相關(guān)黏附素(CD324)表達(dá)缺失，與人類肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。肺癌患者存在血瘀證，晚期病人更為明顯［6］。血瘀證存在微循環(huán)障礙和組織缺氧的病理改變［7］，而組織微環(huán)境缺氧可通過調(diào)控癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因，進(jìn)而影響細(xì)胞E-cadherin和 β1-catenin分布，并促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附［8］。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞乏氧導(dǎo)致PG細(xì)胞CD324表達(dá)陽性率下調(diào)，同時(shí)CD29表達(dá)上調(diào)。據(jù)此我們推斷，在乏氧環(huán)境下PG細(xì)胞有更高的轉(zhuǎn)移能力，這與臨床上晚期肺癌病人血瘀證增加的觀察結(jié)果相符。

表2 PG細(xì)胞CD29的表達(dá)(±s)

表2 PG細(xì)胞CD29的表達(dá)(±s)

注:與常氧時(shí)比較:bbP＜0.01

藥物 藥物濃度(μg/ml)低氧表達(dá)陽性率(%) 熒光強(qiáng)度 表達(dá)陽性率(%)常氧熒光強(qiáng)度TMP 240 99.28±0.32 78.47±22.81 99.34±0.55 134.30±32.61 TMP 120 99.58±0.28 82.82±18.04 98.44±1.25 118.75±40.62 TMP 10 99.35±0.45 64.22±28.66 99.04±0.67 127.79±30.50 DDP 2 98.95±0.66 80.98±36.03 98.24±1.34 129.10±26.10 Control — 99.25±0.46 73.22±23.78 99.13±0.71 101.15±39.53bb

圖2 PG細(xì)胞CD29表達(dá)情況(N常氧，H低氧)

川芎嗪是活血藥川芎的主要成分。韓子敏等研究證明，黃芪、川芎嗪能夠抑制腎癌轉(zhuǎn)移［9］。陳少賢等發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠減輕肺癌患者高凝狀態(tài)，達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［10］。試驗(yàn)證明，TMP能抑制小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移［11］，還可明顯抑制人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞(PG)與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附［12］以及對(duì)Boyden小室的侵襲［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常氧和低氧環(huán)境中，川芎嗪能上調(diào) PG細(xì)胞 E-cadherin (CD324)的表達(dá)，表明川芎嗪能夠通過調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)黏附分子抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。

［1］ 張林，孟龍，王磊，等．非小細(xì)胞肺癌中VEGF、CD44v6的表達(dá)及其與肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系的研究［J］．中國(guó)肺癌雜志，2004，7(5):427-430．

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Effect of Tetramethylpyrazine on Expression of β1-integrin and E-cadherin on the Surface of Cell PG in Hypoxic Environment

REN Wei-min1，2ZHANG Pei-tong2△，ZHANG Ming-hui2
(1．Henan Province Chinese medicine research institute，Zhengzhou，Henan 450004，China; 2．Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective:To investigate the effect of Tetramethylpyrazine(TMP)on the expression of β1-integrin(CD29) and E-cadherin(CD324)on the surface of cell PG cultured during normoxia and hypoxia．Methods:The revival cell PG was divided into three dosages(high，medium and low)group of Tetramethylpyrazine，DDP group and negative control group．All of five groups were cultured separately in the normal and hypoxic environment．The expression of CD324 and CD29 on the surface of PG cell were detected by the flow cytometry 48 h later．Results:The positive rate of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is higher than hypoxic group(P＜0.01)．In normoxic and hypoxic microenvironment，the expression rate of all experimental group is higher than control group(P＜0.05)．The intensity of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is lower than hypoxic group(P＜0.01)．Conclusion:PG cells have a higher metastatic ability in the hypoxic microenvironment．In the normoxic and hypoxic microenvironment，tetramethylpyrazine can inhibit metastasis ability of PG cells through regulating the metastasis-associated adhesion molecules．

PG cell;Tetramethylpyrazine;β1-integrin;E-cadherin

R734．2

B

1006-3250(2015)03-0291-03

2014-12-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30873334)

任為民(1972-)，男，河南鄭州人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者:張培彤，男，安徽人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)研究，E-mail: zhangpeitong@sohu．com。