正交設(shè)計(jì)法篩選“腸病方”最佳刺激參數(shù)組合的研究*

閆麗萍， 冀來(lái)喜，祁 超，雙 源，燕 平

(山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

正交設(shè)計(jì)法篩選“腸病方”最佳刺激參數(shù)組合的研究*

閆麗萍， 冀來(lái)喜△，祁 超，雙 源，燕 平

(山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

目的:采用正交設(shè)計(jì)方法篩選電針治療腸黏膜損傷的最佳刺激參數(shù)組合。方法:制備大鼠腸黏膜損傷模型，以三因素三水平組合電針腧穴“腸病方”，觀察腸黏膜損傷指數(shù)及組織學(xué)變化。結(jié)果:各刺激參數(shù)治療作用的顯著性排列為電針頻率＞留針時(shí)間＞治療頻次，治療頻次影響不顯著。各因素中不同水平影響排序?yàn)?100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20 min=10 min;每日2次、2 d 1次、每日1次均可。結(jié)論:電針腧穴“腸病方”治療腸黏膜損傷的最佳刺激參數(shù)組合為:100 Hz，30 min，每日2次。

“腸病方”;電針;正交設(shè)計(jì);腸黏膜損傷

臨床研究表明，針灸對(duì)腸系疾病有較好的治療作用［1-2］。2009年在國(guó)家自然科學(xué)基金的資助下，冀來(lái)喜教授［3］等篩選出治療結(jié)腸黏膜損傷的最佳組方，即天樞、中脘、上巨虛三穴，并將其冠名為“腸病方”。然而針刺療效的影響因素除了不同的腧穴組方外，刺激量及時(shí)間等因素也非常重要。因此，在腧穴“腸病方”的基礎(chǔ)上，以正交設(shè)計(jì)方法進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)結(jié)腸黏膜損傷的電針頻率(2 Hz、30 Hz、100 Hz)、留針時(shí)間(10 min、20 min、30 min)、針刺間隔時(shí)間(每日1次、每日2次、2 d 1次)的最佳電針刺激參數(shù)組合，為臨床制定科學(xué)完善的針刺治療方案提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠110只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物及飼料均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(合格證編號(hào)SCXK (京)2012-0001)。

1.2 主要儀器

華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);BM-VⅡ生物組織包埋機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);BM-VⅡ冷凍臺(tái)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);CS-VⅠ攤片烤片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);QP-V生物組織切片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);OLYMPUS-BX53正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 主要試劑

冰乙酸(天津市北辰方正試劑廠);甲醛(天津市第三化學(xué)試劑廠);二甲苯(天津市第三化學(xué)試劑廠)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與造模

110只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(n= 10)、模型組(n=10)、針刺干預(yù)Ⅰ～Ⅸ組(均n= 10)。以上各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水。造模時(shí)，將直徑為2 mm的聚氯乙烯管插入大鼠肛門內(nèi)8 cm。模型組、針刺干預(yù)組取6%的冰醋酸1 ml灌腸，15 s后再灌入生理鹽水5 ml，建立急性結(jié)腸黏膜損傷大鼠模型［4］?？瞻捉M取生理鹽水1 ml灌腸，15 s后灌入生理鹽水5 ml。

2.2 處理方法

表1顯示，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［5］，針刺三因素三水平。表2顯示，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)。造模后即刻按表2的實(shí)驗(yàn)安排對(duì)每組大鼠施以相應(yīng)組合的針刺治療，正常組和模型組大鼠除與針刺干預(yù)組做同樣的抓取固定外，不做任何處理。針刺治療組每組針刺治療3次，末次治療24 h后麻醉取材。

表1 電針刺激參數(shù)

表2 針刺干預(yù)組9個(gè)亞組實(shí)驗(yàn)安排表

取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］穴位標(biāo)準(zhǔn)定位。中脘:臍上20 mm;天樞(雙側(cè)):臍中［7］旁開(kāi)5 mm;上巨虛(雙側(cè)):大鼠后肢足三里向下約5 mm。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù) 各組大鼠以20%烏拉坦(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉固定，沿腹白線剪開(kāi)大鼠腹腔，剪下距肛門12cm結(jié)腸，生理鹽水沖洗，觀察結(jié)腸黏膜損傷情況，計(jì)算結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)［8］。

2.3.2 組織學(xué)觀察 將大鼠距肛門8 cm處表面積約1 cm×1 cm左右的結(jié)腸(腸壁全層)剪下，置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色，普通光鏡下觀察腸黏膜的損傷程度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用秩和檢驗(yàn)(M±QR)，正交分析采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

各組大鼠 2項(xiàng)評(píng)分經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，均 P＜0.001，表明數(shù)據(jù)均不滿足正態(tài)性，故采用秩和檢驗(yàn)。經(jīng)兩兩秩和檢驗(yàn)比較均P＜0.05，說(shuō)明針刺干預(yù)組和空白組、模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

表3 各組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分秩和檢驗(yàn)

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4～6顯示，因素 A、B影響顯著(均 P＜0.05)，因素C影響不顯著(P＞0.05)。由F值可得出三因素影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C(電針頻率＞留針時(shí)間＞治療頻次)，因素A和B對(duì)本項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果有顯著性影響(均P＜0.05)，其中A3、B3最為適合;因素C對(duì)結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)的影響不顯著(P＞0.05)，3個(gè)水平均可。但本模型是急性損傷，結(jié)合針灸臨床經(jīng)驗(yàn)以及急性病癥治療效果考慮每日2次為宜，故電針“腸病方”逆轉(zhuǎn)大鼠急性結(jié)腸黏膜損傷的最佳刺激參數(shù)組合為A3B3C2，即100 Hz、30 min、每日2次。

表4 不同針刺干預(yù)方法對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)及組織學(xué)評(píng)分的影響

4 討論

電針治療疾病的療效，與腧穴配伍、電針頻率、留針時(shí)間、治療頻次等因素密切相關(guān)。

頻率是電針刺激的重要參數(shù)之一，不同頻率電針可通過(guò)不同的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制，由不同的中樞通路整合而產(chǎn)生的效應(yīng)不同［9-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針頻率對(duì)改善大鼠結(jié)腸黏膜損傷具有顯著影響，100 Hz電針頻率療效優(yōu)于2 Hz、30 Hz，即100 Hz電針頻率可以較好地改善腸黏膜的損傷。

在刺激強(qiáng)度相同情況下，刺激時(shí)間在一定范圍內(nèi)與有效刺激量正相關(guān)［11］。雖然目前關(guān)于留針時(shí)間與電針治療腸病療效方面的文獻(xiàn)較少，但留針時(shí)間與電針的療效有密切聯(lián)系［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，留針時(shí)間對(duì)結(jié)腸黏膜損傷的影響顯著。在本實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平中，留針時(shí)間越長(zhǎng)，受損的結(jié)腸黏膜恢復(fù)情況越好，30 min的留針時(shí)間明顯優(yōu)于10 min、20 min。這可以說(shuō)明，電針留針時(shí)間偏短則治療結(jié)腸黏膜損傷效果不佳，只有達(dá)到一定的留針時(shí)間才會(huì)產(chǎn)生明顯療效。

表5 不同針刺干預(yù)方法對(duì)2項(xiàng)評(píng)分指標(biāo)影響的正交試驗(yàn)直觀分析

表6 不同因素對(duì)2項(xiàng)指標(biāo)影響的方差分析

不同的針灸治療頻次可以反映針灸刺激量的積累。一般來(lái)說(shuō)，急性病癥來(lái)勢(shì)急驟且兇猛，病情嚴(yán)重，機(jī)體受到損傷嚴(yán)重，這就需要相對(duì)應(yīng)較高頻次的針灸治療。慢性病變機(jī)體受致病因素的作用時(shí)間長(zhǎng)，這就需要較長(zhǎng)的治療過(guò)程來(lái)積累針灸治療的效果，逐步消除損害。但并非所有疾病都能這樣一概而論，這就需要我們具體到某種疾病詳細(xì)研究對(duì)其的針灸治療頻次。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，治療頻次在改善2項(xiàng)指標(biāo)方面均無(wú)顯著影響。古代針灸醫(yī)籍中有“氣至而有效”、“氣速至而速效”的說(shuō)法，對(duì)于發(fā)病急、病情重的疾病，需要在短時(shí)間內(nèi)累積足夠的針灸效應(yīng)。因此，基于本研究模型為急性損傷造成，結(jié)合針灸臨床經(jīng)驗(yàn)以及急性病癥治療效果考慮，認(rèn)為在改善結(jié)腸黏膜損傷方面，治療頻次選擇每日2次比較符合需要。

在本實(shí)驗(yàn)中，電針頻率與留針時(shí)間是影響“腸病方”治療急性腸黏膜損傷療效的顯著因素，治療頻次是不顯著因素。電針“腸病方”的最佳刺激參數(shù)組合為，電針頻率100 Hz，留針時(shí)間30 min，治療頻次每日2次，而其作用機(jī)制則有待進(jìn)一步深入研究。

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Study on Optimum Acupuncture Parameter for“Changbingfang”by Orthogonal Design

YAN Li-ping，JI Lai-xi△，QI Chao，SHUANG Yuan，YAN Ping
(Shanxi University of Traditional Chinese Mendine，Taiyuan 030024，China)

Objective:Combination of parameters of the using the orthogonal design method to screening the best stimulus electro-acupuncture treatment of intestinal mucosa injury.Methods:Rat intestinal mucosal injury model，Index of intestinal mucosal injury and ordinary optical microscope observation from the cellular level damage to the intestinal mucosa，as observed indicators，factors and three levels orthogonal design method electro-acupuncture acupoints best to enteropathy side screened electrical stimulation parameters.Results:The importance of the stimulation parameters in descending arranged of“Changbingfang”is frequency of electric acupuncture＞retaining time of acupuncture needles＞interval of acupuncture，but the treatment frequency effect was not significant.The sequence of each level in 3 element is: 100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20min=10 min;1 time/d，2 times/d and 1 time/2 d have the same effects.Conclusion: The best combination of stimulation parameters for treat bowel disease about acupoints“Changbingfang”is:100 Hz，30 min，2 times/d.

“Changbingfang”;Electro-acupuncture;Orthogonal experimental design;Intestinal mucosa injury

R245.9+7

B

1006-3250(2015)01-0080-03

2014-09-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目-基于針刺信號(hào)傳導(dǎo)途徑與整合機(jī)制的腧穴“腸病方”配伍研究(30973799)

閆麗萍(1967-)，女，山西左云人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事腧穴組方的研究。

△通訊作者:冀來(lái)喜(1964-)，男，山西保德人，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事腧穴組方的研究，E-mail:Tyjilaixi@126.com。