高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者體外紅細(xì)胞的影響

董金濤+++++陳麗++++梁麗紅

[摘要] 目的 研究高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者體外紅細(xì)胞的影響。 方法 選取G6PD活性正常、缺乏的檢驗(yàn)者各50例，采集外周血并與槲皮素孵育，測(cè)定紅細(xì)胞的GSH、MetHb，并對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀(guān)察，考察槲皮素對(duì)G6PD活性缺乏者紅細(xì)胞影響。 結(jié)果 槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞具有明顯的氧化作用，GSH呈下降趨勢(shì)，而MetHb則顯著上升（P<0.05），高濃度組MetHb為（5.70±2.03）%顯著高于中、低濃度組（3.51±1.67）%、（1.31±0.68）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺失組與正常組受到α-萘酚的影響存在明顯差異，且兩種孵育體系中的表現(xiàn)存在不同。 結(jié)論 槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞有一定的氧化作用，因此在涉及含有氧化性黃酮類(lèi)化合物病制劑使用時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

[關(guān)鍵詞] 高濃度槲皮素；G6PD缺乏；紅細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）02-0017-03

G6PD缺乏者指酶活性因X染色體中G6PD基因改變而出現(xiàn)不同程度的遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為溶血性貧血與新生兒黃疸，氧化性藥物等眾多因素均可能為其誘因[1]，黃酮類(lèi)化合物通常有抗氧化活性，可放置活性自由基對(duì)機(jī)體造成損傷，但使用不當(dāng)仍可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的活性自由基損害及細(xì)胞凋亡[2]。本次研究針對(duì)高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞的影響進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究入選的100例受檢者均為男性，在2010年10月～2014年3月在我院接受招募，年齡18～60歲，平均（30.54±7.46）歲，根據(jù)G6PD活性分為G6PD活性正常組與G6PD缺乏組，兩組均為50例，正常組活性≥6.70/gHb，缺乏組<6.70/gHb，兩組年齡等基線(xiàn)資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①男性；②血常規(guī)、肝腎功能及體格檢查正常；③無(wú)抽煙、嗜酒等不良嗜好；④4個(gè)月內(nèi)未發(fā)生感染性疾病或溶血疾病；⑤兩周內(nèi)未服用藥物；⑥無(wú)其他血液系統(tǒng)疾病；⑦對(duì)試驗(yàn)知情并自愿配合完成試驗(yàn)。所有患者行血常規(guī)、肝腎功能檢查，抽取外周靜脈血20 mL，同時(shí)測(cè)定G6PD活性與體外活性孵育試驗(yàn)，上述檢查及試驗(yàn)均在采取后12 h內(nèi)完成。研究方案報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.3 儀器及藥物

儀器包括全自動(dòng)生化分析儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、水浴恒溫振蕩器、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。藥物于中檢所采購(gòu)槲皮素與α-萘酚，使用二甲基亞砜將槲皮素配置為1、5、100 mol·L-1濃度的儲(chǔ)備液，α-萘酚使用二甲基亞砜配置為0.4 mg·mL-1儲(chǔ)備液。使用5 mmol·L-1PBS（5 mmol·L-1葡萄糖，140 mmol·L-1氯化鈉，pH7.4稀釋?zhuān)?duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋處理，濃度為50%。

1.4 方法

1.4.1 G6PD活性測(cè)定 利用7170A全自動(dòng)生化分析儀對(duì)G6PD活性進(jìn)行測(cè)定（連續(xù)監(jiān)測(cè)速率法）。通過(guò)離心機(jī)將EDTA-K2抗凝血5 min離心處理，離心參數(shù)為4 000 r/min，避免血漿層干擾吸取20 μL壓積紅細(xì)胞，并將其放入1mL溶解液中溶解，待1～2 min紅細(xì)胞完全溶解后進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)定：1、2試劑分別為220 μL、25 μL；試驗(yàn)溫度37°C；主波長(zhǎng)及副波長(zhǎng)分別為340 nm、660 nm；反應(yīng)時(shí)間10min；設(shè)置209084為計(jì)算因數(shù)。以U/L表示結(jié)果，后以全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)Hb進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量200 μL取EDTA-K2抗凝血2 mL，最后G6PD活性=G6PD（U/L）/Hb（g/L），并以U/gHb表示結(jié)果。

1.4.2 紅細(xì)胞孵育 離心全血后分離血漿與白細(xì)胞層，壓積紅用4℃等滲PBS洗滌，洗滌三次后再次將40%體積懸浮于PBS中，制備40%紅細(xì)胞懸液，加入懈皮素，濃度控制在50、250、500 μmol·L-1三個(gè)梯度。分別對(duì)應(yīng)低、中、高組，另外設(shè)立α-萘酚組（0.02 mg·mL-1）、DMSO組（5%）和PBS組，在37℃水浴中放置孵育管，并振蕩孵育2 h。剩下的全血和藥物進(jìn)行孵育，相關(guān)設(shè)置同上。

1.4.3 GSH測(cè)定 還原性谷胱甘肽用比色法測(cè)定，將孵育完成后的血樣離心處理（10 min，2000 r），將30 μL紅細(xì)胞放置在720 μL蒸餾水中制備溶血液。將300 μL溶血液與1.2 mL GSH試劑混勻后高速離心，后抽取上清液1 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)，與420 nm處對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，另外對(duì)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度和空白管吸光度進(jìn)行測(cè)定，最后計(jì)算處GSH含量，公式為GSH=測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×20×307×125/104。

1.4.4 MetHb檢測(cè) MetHb即高鐵血紅蛋白，其含量結(jié)合630 nm處吸光度的差值，觀(guān)察其和Hb轉(zhuǎn)化為MetHb的比值，用蒸餾水將上述制備溶血液300 μL用閉稀釋為2.55 mL并混勻，將蒸餾水作為空白，在630 nm處測(cè)定吸光度A1；加入50 μL氰化鉀溶液，于上述相同波長(zhǎng)條件下測(cè)定A2。后抽取100 μL溶血液蒸餾水稀釋至2.5 mL，將50 mL高鐵氰化鈉加入，同在630 nm處測(cè)定吸光度A3，另加入50 μL測(cè)定吸光度A4。利用（A1-A2）/（A3-A4）×100%公式將（MetHb）%計(jì)算出來(lái)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組受試者間的比較采用Students t-test。兩組受試者各藥物組與相應(yīng)對(duì)照組的比較分別采用隨機(jī)區(qū)組的方差分析，并進(jìn)行兩兩之間的LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 40%紅細(xì)胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測(cè)定

槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞具有明顯的氧化作用，GSH呈下降趨勢(shì)，而MetHb則顯著上升（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 40%紅細(xì)胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測(cè)定（x±s）

注：與低濃度比較，t1=4.925，t2=12.201，t3=4.925，t4=16.660，*P<0.05；與中濃度比較t1=8.331，#P<0.05

2.2 α-萘酚與DMSO對(duì)GSH及MetHb的影響分析

缺失組與正常組受到的α-萘酚影響存在明顯差異，兩組孵育體系表現(xiàn)差異顯著，見(jiàn)表2。

3 討論

G6PD缺乏者由于紅細(xì)胞中還原性谷胱甘肽對(duì)氧化性物質(zhì)有對(duì)抗作用，使得血紅蛋白、膜脂質(zhì)受到影響，氧化后變?yōu)楦哞F血紅蛋白，促使交聯(lián)細(xì)胞及Heinz形成，使形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，最終可能導(dǎo)致紅細(xì)胞破溶，另可能導(dǎo)致經(jīng)內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除[3]。D6PD缺乏者紅細(xì)胞氧化性損害可不斷累積，因此必須防止降低紅細(xì)胞GSH提高氧化性壓力的干擾[4]。

紅細(xì)胞損傷程度受氧化物質(zhì)損傷的影響受到紅細(xì)胞壓積的影響，當(dāng)紅細(xì)胞壓積較小時(shí)，氧化損傷程度則越高。一般情況下成年男性的紅細(xì)胞壓積值約為40%～50%，因此選擇40%紅細(xì)胞懸液孵育體系對(duì)藥物影響紅細(xì)胞氧化作用的考察更為有利[5]?？寡趸镔|(zhì)、脂質(zhì)、蛋白等物質(zhì)均處于血漿中，全血中紅細(xì)胞氧化程度輕微，其檢測(cè)客觀(guān)性較高，可準(zhǔn)確反映出生理狀態(tài)[6]。

α-萘酚可能引發(fā)患者發(fā)生溶血性貧血，使GSH水平降低，另可提高M(jìn)etHb水平上升。槲皮素氧化作用較強(qiáng)，在中濃度下即導(dǎo)致可造成較大的氧化性損傷，同時(shí)其能夠使全血中G6PD缺乏者紅細(xì)胞Hb發(fā)生氧化的物質(zhì)[7]。

有研究顯示，包含槲皮素在內(nèi)的眾多黃酮類(lèi)化合物對(duì)正常者紅細(xì)胞及干細(xì)胞均有一定的氧化作用[8，9]，除懈皮素外的黃酮類(lèi)化合物大多需和過(guò)氧化物酶/H202發(fā)生反應(yīng)以參與這一過(guò)程，與黃酮類(lèi)化合物催化氧化機(jī)制符合，但同時(shí)無(wú)法對(duì)其非催化氧化作用做出解釋[10]。有研究顯示[11，12]，懈皮素脂性大，可直接氧化Hb，蘆丁具有較高的親水性，較難透過(guò)細(xì)胞膜直接氧化Hb，所以不會(huì)對(duì)G6PD缺乏者、正常者的MetHb和紅細(xì)胞GSH產(chǎn)生明顯影響。

本次研究對(duì)不同濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞的氧化作用進(jìn)行研究，而其氧化機(jī)制還需深入研究，可以確定的是槲皮素會(huì)提高缺乏者的氧化性壓力，從而產(chǎn)生氧化性損傷。因此G6PD患者應(yīng)謹(jǐn)慎使用，防止長(zhǎng)期使用高濃度的槲皮素，尤其是新生兒、兒童及感染或遺傳性溶血性疾病等患者應(yīng)避免使用。

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（收稿日期：2014-09-23）