從作物的源流庫理論展望新型育種技術(shù)

韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

從作物的源流庫理論展望新型育種技術(shù)

韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

綜述了源流庫理論的進(jìn)展，著重描述了維管束作為流的通道不僅能夠運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)而且轉(zhuǎn)運(yùn)不同種類的生物信號(hào)。結(jié)合最新的研究進(jìn)展，針對(duì)反向育種中染色體非重組和染色體消除兩個(gè)重要步驟，展望了利用維管束轉(zhuǎn)運(yùn)基因沉默信號(hào)實(shí)現(xiàn)花器官染色體操作的技術(shù)，為反向育種技術(shù)提供新的思路。

源流庫；維管束；篩管；反向育種；長距離運(yùn)輸

作物生產(chǎn)的基礎(chǔ)是利用光合作用合成養(yǎng)分并運(yùn)輸?shù)教囟ǖ慕M織器官進(jìn)行消耗或者儲(chǔ)藏。圍繞這三個(gè)階段，源流庫理論將供給源、運(yùn)輸流和儲(chǔ)存庫的生理特性進(jìn)行了歸納總結(jié)，以此來分析作物產(chǎn)量的限制因素。對(duì)源流庫理論的深入研究為作物育種和栽培技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。隨著植物科學(xué)基礎(chǔ)研究的不斷深入，源流庫理論中光合同化物的運(yùn)輸被認(rèn)為不僅是供給養(yǎng)分，還是生物信號(hào)長距離運(yùn)輸?shù)闹匾?qū)動(dòng)力之一。植物激素、轉(zhuǎn)錄因子、siRNA和miRNA在篩管中隨著蔗糖運(yùn)輸，從源到庫調(diào)控植物的生長發(fā)育和生理反應(yīng)。源流庫中的“流”不僅是養(yǎng)分的流動(dòng)，還是生物信號(hào)高速通道中的信息交流。從篩管中搭載的生物信號(hào)的多樣性和重要性，可以窺見源流庫理論在植物科學(xué)中的關(guān)鍵地位。然而長期以來，源流庫理論并未對(duì)育種技術(shù)本身產(chǎn)生任何影響。近年來，反向育種技術(shù)被提出并投入到實(shí)踐中，成為與無融合生殖技術(shù)一樣固定雜交優(yōu)勢(shì)的新型育種技術(shù)。該技術(shù)需要改造多個(gè)基因，在作物花器官中阻止染色體的重組和實(shí)現(xiàn)染色體的選擇性消除。結(jié)合源流庫技術(shù)，將關(guān)注點(diǎn)從光合同化物轉(zhuǎn)移到生物信號(hào)的長距離運(yùn)輸上，最新的研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)染色體重組酶DMC1等基因設(shè)計(jì)的siRNA信號(hào)可以利用篩管“流”輸送到“庫”，也就是花器官，進(jìn)而通過沉默DMC1等基因來實(shí)現(xiàn)染色體操作，為反向育種技術(shù)提供了新的思路。

1 源流庫理論

源流庫理論描述了作物生產(chǎn)的過程，提出光合同化物從營養(yǎng)器官合成后，經(jīng)過運(yùn)輸，分配到種子、塊莖和果實(shí)等消耗或貯藏同化產(chǎn)物的組織器官。依據(jù)光合同化物的不同狀態(tài)場所，整個(gè)作物生產(chǎn)過程在源流庫理論中被明確劃分為供給源、運(yùn)輸流和儲(chǔ)存庫三個(gè)階段。不同階段的特征及其協(xié)調(diào)性是提高作物產(chǎn)量最直接的限制因素。20世紀(jì)20年代末，Mason和Maskell根據(jù)棉花體內(nèi)光合同化物的分配方式最早提出了該理論。長期以來，研究者對(duì)源流庫不同階段對(duì)作物產(chǎn)量的影響進(jìn)行了深入的探索。

早期在玉米產(chǎn)量和種植密度的研究中，人們發(fā)現(xiàn)葉片作為光合源直接影響了玉米的產(chǎn)量。進(jìn)一步對(duì)玉米葉片形態(tài)的研究，揭示了減少葉片夾角在密植情況下可以提高產(chǎn)量［1］。隨著植物學(xué)研究的發(fā)展和植物生長調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)，研究者們能夠利用植物生長調(diào)節(jié)劑減緩葉片的衰老和提高葉片葉綠體的含量［2，3］。這個(gè)手段在增產(chǎn)上取得了一定的效果，更加證實(shí)了葉片作為光合源在作物生產(chǎn)中的重要角色。在研究光合供給源的同時(shí)，對(duì)谷物種子儲(chǔ)存庫的認(rèn)識(shí)也不斷深入。例如，在玉米禿尖和敗育的研究中，發(fā)現(xiàn)不同穗部位間的籽粒在營養(yǎng)物質(zhì)分配上存在著競爭關(guān)系［4-6］。頂部籽粒的敗育就是因?yàn)樵诟偁幹刑幱诹觿?shì)而缺乏養(yǎng)分。由此可見儲(chǔ)存庫在作物生產(chǎn)中的重要性。研究者們針對(duì)籽粒庫展開了更廣泛的工作，發(fā)現(xiàn)籽粒的大小、多少和代謝活性是決定庫容強(qiáng)度的關(guān)鍵因素，也是提高作物產(chǎn)量的關(guān)鍵點(diǎn)。在源流庫理論中，運(yùn)輸流連接供給源和儲(chǔ)存庫，其重要的功能主要通過植物維管束的篩管來實(shí)現(xiàn)。大量的解剖結(jié)構(gòu)觀察揭示了維管束的數(shù)目、大小和連接方式是植物調(diào)節(jié)運(yùn)輸流和產(chǎn)量的重要手段［7］。源流庫理論不僅對(duì)作物生產(chǎn)過程進(jìn)行分段式研究，同樣重視三者之間的制約和協(xié)調(diào)，為作物生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

在作物栽培實(shí)踐中，源流庫理論的指導(dǎo)也取得了許多積極的成果。依據(jù)源流庫理論，對(duì)作物的生長階段也劃分了營養(yǎng)生長、生殖生長和灌漿成熟3個(gè)時(shí)期，通過合理的施肥灌溉等栽培技術(shù)，可以合理的調(diào)節(jié)光合同化物的分配和協(xié)調(diào)源流庫的關(guān)系，從而提高產(chǎn)量。例如20世紀(jì)后半葉，荷蘭的冬小麥增產(chǎn)主要就是因?yàn)槌晒Φ靥岣吡肆６挶壤?。水稻的高產(chǎn)栽培技術(shù)體系，也逐漸形成了精播培育壯苗、提高分孽成穗率以及注重穗大、粒多和粒重的觀點(diǎn)。玉米的合理密植已經(jīng)在各個(gè)地方大面積推廣，并且育種中也充分考慮高光效的株型選擇和利用?；谠戳鲙炖碚?，粒葉比、比葉重、最適葉面積指數(shù)等衡量標(biāo)準(zhǔn)也被應(yīng)用到水稻超高產(chǎn)的品種選育中。

2 維管束在“流”的作用

在植物中，維管束組織在“源、庫、流”中作為“流”的高速通道，承擔(dān)了光合同化物的長距離運(yùn)輸。維管束組織的有無往往是高等植物與低等植物劃分的界限，在所有的農(nóng)業(yè)作物中都具有該組織。在高等植物的莖、葉（維管束在葉片中通常稱為葉脈）和根等器官中均具有維管束組織，它們相互連接，使得植物各器官組織在各自具有功能分工的同時(shí)卻形成有機(jī)連通的整體。根部吸收水分和無機(jī)鹽后，通過維管束轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片；葉片光合作用產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)，同樣通過維管束轉(zhuǎn)運(yùn)到根部和生殖器官，供給生理活動(dòng)的能量。

維管束的韌皮部和木質(zhì)部分別行使光合同化物運(yùn)輸和水分運(yùn)輸?shù)墓δ堋Ｈ~片和莖稈維管束的這兩種組織都來源于植物頂端分生組織的分化，首先產(chǎn)生原形成層細(xì)胞，然后細(xì)胞向內(nèi)分化為木質(zhì)部，向外分化為韌皮部。木質(zhì)部細(xì)胞由管狀細(xì)胞、薄壁組織和纖維組織構(gòu)成；韌皮部則含有篩管細(xì)胞、伴胞、薄壁組織和厚壁組織。導(dǎo)管細(xì)胞木質(zhì)化后形成死細(xì)胞，兩端的細(xì)胞壁降解，細(xì)胞膜具有穿孔，從而形成了連續(xù)的通道，是水分和無機(jī)鹽的長距離運(yùn)輸通道。篩管細(xì)胞沒有木質(zhì)化過程，同樣由兩端大量的篩孔連通，使得光合產(chǎn)物能夠進(jìn)行長距離運(yùn)輸。

維管束承擔(dān)著“源、庫、流”中作為“流”的環(huán)節(jié)，對(duì)作物產(chǎn)量的影響很大。大量研究已證明，水稻穗頸節(jié)間大維管束的數(shù)目、大小是影響產(chǎn)量的重要因素之一。C4植物維管束作為花環(huán)狀結(jié)構(gòu)的組織中心，縮短了葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞的平均距離，有利于代謝物的運(yùn)輸，是C4植物高光效的主要結(jié)構(gòu)特征之一。

3 維管束篩管長距離運(yùn)輸?shù)慕M分

整個(gè)源流庫理論所關(guān)注的主要是作物產(chǎn)量，因此“流”的概念聚焦了光合同化物或有機(jī)養(yǎng)分的運(yùn)輸。對(duì)維管束中篩管的認(rèn)識(shí)在源流庫理論的框架下也就被局限在了光合同化物或者說糖分的長距離運(yùn)輸。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，特別是各種組學(xué)手段在植物研究領(lǐng)域的不斷深入應(yīng)用，人們對(duì)維管束中篩管的功能闡述有了質(zhì)的飛躍。近20年來，大量的研究工作揭示了篩管的重要功能除了轉(zhuǎn)運(yùn)光合同化物，還有就是長距離傳遞生物信號(hào)。在篩管中傳遞的生物信號(hào)相當(dāng)廣泛，從各種植物激素、多肽信號(hào)到轉(zhuǎn)錄因子蛋白，甚至miRNA和siRNA都是篩管中重要的生物信號(hào)載體。不同的生物信號(hào)參與控制了植物復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的分化、器官發(fā)生和植物發(fā)育，還涉及了多種環(huán)境刺激響應(yīng)。因此，源流庫理論中的篩管通道不僅僅是植物供給能量養(yǎng)分的主動(dòng)脈，還是植物生命程序的中樞神經(jīng)。

在諸多植物激素中，生長素在篩管中的運(yùn)輸已經(jīng)有了較為清晰的理論模型來解釋。在模式植物擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，剪葉處理的植株根部缺乏足夠的生長素來促發(fā)側(cè)根的形成。用同位素標(biāo)記的生長素示蹤，證實(shí)了生長素的確從葉片“源”長距離運(yùn)輸?shù)搅烁康摹皫臁?。在植物中，生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過兩種不同的途徑。一方面，大量的生長素能夠搭載篩管中糖分的流動(dòng)，迅速實(shí)現(xiàn)從源到庫的長距離運(yùn)輸。另一方面，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，生長素在細(xì)胞之間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，相較前者而言是一個(gè)緩慢的過程。兩個(gè)途徑是整合在一起的，生長素導(dǎo)入篩管和從篩管中導(dǎo)出就需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白這個(gè)途徑。生長素被認(rèn)為是器官發(fā)生的扳機(jī)，承載了側(cè)根、次生葉脈等器官分化發(fā)育的觸發(fā)生物信號(hào)。篩管中篩孔的大小，是調(diào)節(jié)生長素長距離運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵點(diǎn)之一。不僅是生長素，細(xì)胞分裂素通過維管束的韌皮部運(yùn)輸?shù)街参锔鞴伲瑳Q定了主根的生長。另外，被病菌浸染后葉片產(chǎn)生的水楊酸通過篩管從受激葉片運(yùn)輸?shù)狡渌课?，可以造成植物的系統(tǒng)性免疫。在水稻的篩管運(yùn)輸液中還分離到了赤霉素、脫落酸等植物激素。基于各種激素的重要作用，篩管是植物生長發(fā)育中信號(hào)傳遞的決定性場所。

蛋白質(zhì)相對(duì)于植物激素的分子量具有生物大分子的特征。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)也能夠通過篩管進(jìn)行運(yùn)輸，特別是轉(zhuǎn)錄因子承載了植物生長發(fā)育的信號(hào)。例如開花因子FT就是通過篩管運(yùn)輸?shù)介_花分生組織，從而決定了花期這個(gè)重要的農(nóng)藝性狀［8］。轉(zhuǎn)錄因子SHR從根的中柱細(xì)胞移動(dòng)到外層與轉(zhuǎn)錄因子SCR結(jié)合決定了內(nèi)皮層細(xì)胞的分化，影響了整個(gè)根系的發(fā)育［9］。在葉片花環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成的研究中，也推測了SHR-SCR從維管束中傳遞到周圍細(xì)胞，誘導(dǎo)了鞘細(xì)胞和葉肉細(xì)胞的特異性分化［10，11］。這一發(fā)現(xiàn)有助于解析C4高光效的花環(huán)狀發(fā)育機(jī)理，對(duì)改良水稻等作物光合作用效率有重大意義。高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了篩管運(yùn)輸液中包含的大量蛋白質(zhì)。白屈菜的篩管乳汁經(jīng)過二維凝膠電泳，檢測到21種蛋白質(zhì)。對(duì)羽扇豆的篩管分泌液進(jìn)行二維蛋白凝膠電泳，最終鑒定出86種蛋白質(zhì)。從毛果楊（Populus trichocarpa）和美洲黑楊（Populus deltoides）的雜交種中提取篩管分泌液，通過蛋白質(zhì)譜的檢測發(fā)現(xiàn)其中含有100種蛋白質(zhì)［12，13］。這些蛋白質(zhì)按功能分類涉及了植物的代謝、環(huán)境抗逆響應(yīng)和信號(hào)傳遞。直接對(duì)楊樹的維管束組織進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，則檢測出了超過2 000種蛋白質(zhì)［13］。在花曲柳的篩管液也發(fā)現(xiàn)了2 400多種蛋白質(zhì)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)境條件的刺激下，其中大約400種蛋白質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生改變［14］。在萵苣的篩管乳汁中，有大約300種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)功能同樣涉及了廣泛的植物生物學(xué)過程，包括代謝、響應(yīng)、發(fā)育、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［15］。在水稻的篩管液中發(fā)現(xiàn)了100種蛋白質(zhì)，特別值得關(guān)注的是發(fā)現(xiàn)其中包括了FT-like蛋白質(zhì)，其在調(diào)控水稻花期中的作用有待更進(jìn)一步深入研究［16］。在葫蘆科植物的篩管液篩管中也同樣發(fā)現(xiàn)了FT蛋白的存在，證實(shí)了FT調(diào)控花期和從源到庫的轉(zhuǎn)運(yùn)需要篩管的運(yùn)輸［17］。對(duì)南瓜的篩管液蛋白質(zhì)組分檢測研究較為深入，檢測出1 209種蛋白質(zhì)。特別是其中含有RNA結(jié)合蛋白、mRNA翻譯亞基和蛋白質(zhì)泛素降解復(fù)合體亞基，革新了對(duì)篩管中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的認(rèn)識(shí)［18，19］。

在植物的篩管液中，不僅發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)生物大分子，還檢測到了許多mRNA或者小RNA［20］。水稻的篩管液就含有thioredoxin h、oryzacystatin-I和actin的mRNA［21］。黃瓜CmNACP蛋白的mRNA也在篩管液中存在。通過miRNA芯片的檢測，發(fā)現(xiàn)了植物中miRNA通過篩管長距離運(yùn)輸來調(diào)節(jié)營養(yǎng)環(huán)境的反應(yīng)。無疑，篩管中的運(yùn)輸不僅包括了植物激素這樣的小分子化合物，還囊括了大量蛋白質(zhì)和RNA這樣的生物大分子。這個(gè)運(yùn)輸過程不是簡單的位置轉(zhuǎn)換，其中還牽涉到了許多復(fù)雜的生物學(xué)變化過程。

4 反向育種技術(shù)

在雜交育種中優(yōu)勢(shì)基因在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生遺傳重組，因此傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)需要通過幾代自交系的雜交獲得具有特定農(nóng)藝性狀優(yōu)勢(shì)的純合種子。幾代自交系的雜交耗時(shí)很長，使得育種成為一個(gè)長期的工作。為此，研究者們開發(fā)出了無融合生殖、雙單倍體育種和反向育種的技術(shù)。

無融合生殖是希望直接從二倍體體細(xì)胞（例如大孢子母細(xì)胞）獲得種子。在被子植物中沒有受精的卵或者在胚珠內(nèi)一些細(xì)胞能夠直接發(fā)育成胚。這種無性種子保持了體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，能夠固定雜種優(yōu)勢(shì)。在雜交水稻中能夠省去年年雜交制種的工作，并可多代使用種子，對(duì)作物生產(chǎn)具有重大的意義。但是該技術(shù)尚處于設(shè)計(jì)研發(fā)階段，距離生產(chǎn)應(yīng)用還有相當(dāng)長的時(shí)間［22］。雙單倍體育種往往是利用作物花藥減數(shù)分裂產(chǎn)生的單倍體配子培育為植株，再通過化學(xué)處理造成染色體加倍。形成的雙單倍體植株具有基因純合特性，整個(gè)周期相較雜交時(shí)程較短，因此在育種上具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值［23］。雖然花藥、小孢子或者胚珠離體培養(yǎng)再生單倍體的方法被廣泛采用，但離體培養(yǎng)的規(guī)?；?、種質(zhì)依賴性、白化苗和體細(xì)胞變異等問題制約了推廣，該技術(shù)仍然具有很大的局限性。反向育種是和雙單倍體整合形成的新型育種技術(shù)，是一個(gè)雜種重建過程［24-27］。首先選育染色體不交叉重組的半不育親本，然后通過染色體消除技術(shù)誘導(dǎo)形成單倍體，選擇基因型互補(bǔ)的單倍體直接雜交，即可重建原始的優(yōu)勢(shì)雜交種。該技術(shù)雖然避開了減數(shù)分裂的遺傳重組，但是整個(gè)染色體數(shù)目仍然能夠造成大量的基因型存在。因此對(duì)不同作物，構(gòu)建親本單倍體系的工作量隨著作物染色體數(shù)目而增加。然而，相較于繁重的傳統(tǒng)雜交育種中幾代雜交工作，反向育種技術(shù)仍然節(jié)省了好幾代作物雜交的時(shí)間。

反向育種技術(shù)的關(guān)鍵就是利用內(nèi)在和外在的因素避免染色體的交換和重組，然后通過染色體選擇性消除技術(shù)獲得單倍體或者雙單倍體。在植物細(xì)胞減數(shù)分裂中控制染色體交換重組的關(guān)鍵性基因DMC1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)證明缺失或者沉默DMC1能夠阻止染色體重組［28］。接下來，通過屬間雜交或者特殊基因型直接雜交的方式選擇性消除染色體獲得單倍體或者雙單倍體是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。20世紀(jì)70年代，Kao和Kasha創(chuàng)建了球莖大麥技術(shù)。該技術(shù)利用球莖大麥花粉對(duì)栽培大麥進(jìn)行授粉，球莖大麥的染色體在F1代中選擇性消除，從而獲得了栽培大麥的雙單倍體或者單倍體。對(duì)單倍體可以再利用秋水仙堿處理進(jìn)行染色體加倍。該技術(shù)啟發(fā)了作物屬間雜交甚至種間雜交誘導(dǎo)染色體消除和制備單倍體的技術(shù)，例如，普通小麥與球莖大麥、燕麥與玉米、小麥與玉米等。深入對(duì)球莖大麥與栽培大麥雜交過程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)球莖大麥染色體消除是由于缺乏著絲粒組蛋白H3（CENH3）［29］。當(dāng)球莖大麥給栽培大麥?zhǔn)诜酆?，HvCENH3（來自栽培大麥）和HbCENH3（來自球莖大麥）均被轉(zhuǎn)錄；HvCENH3可以順利地結(jié)合到栽培大麥的著絲粒，但不能結(jié)合球莖大麥著絲粒；HbCENH3也無法結(jié)合球莖大麥的著絲粒，其是否翻譯形成蛋白質(zhì)還有待研究；球莖大麥染色體由于著絲粒沒有組蛋白而鈍化，形成微核而最終降解。2010年，Ravi和Chan發(fā)現(xiàn)在擬南芥cenh3缺失突變體中轉(zhuǎn)入人工改造的CENH3-tailswap基因，可以在擬南芥中構(gòu)建和球莖大麥一樣的染色體消除技術(shù)［24］。用野生型花粉對(duì)改造CENH3-tailswap的轉(zhuǎn)基因植株授粉，后代中產(chǎn)生大量的父本單倍體。而且單倍體植株不需要通過化學(xué)處理，自交結(jié)實(shí)后就能進(jìn)行染色體加倍。由于每種作物都有同源的CENH3基因，通過人工改造CENH3構(gòu)建單倍體極具應(yīng)用價(jià)值。Ravi和Chan已經(jīng)計(jì)劃通過轉(zhuǎn)基因改造多種作物的CENH3基因，并獲得了積極的進(jìn)展。由于成功開發(fā)了人工改造著絲粒組蛋白構(gòu)建單倍體的技術(shù)，使得反向育種技術(shù)成為現(xiàn)階段最熱門的育種研究，高效的雜種優(yōu)勢(shì)固定或者雜種優(yōu)勢(shì)重建在不久的將來就能實(shí)現(xiàn)。

5 在反向育種中利用作物維管束長距離運(yùn)輸

源流庫理論長期以來在作物育種中指導(dǎo)了優(yōu)勢(shì)株型的選育，但是并未在育種技術(shù)的發(fā)展中產(chǎn)生影響。近年來，一些前瞻性的研究改變了對(duì)源流庫理論的認(rèn)知，期冀利用源流庫理論開發(fā)反向育種技術(shù)并獲得了一些初步結(jié)果。在前述的反向育種技術(shù)中，需要對(duì)作物進(jìn)行復(fù)雜的基因改造以達(dá)到阻止染色體重組和單倍體生成兩個(gè)目的。制備具有這些特性的轉(zhuǎn)基因材料需要花費(fèi)一定的時(shí)間，同時(shí)在不同作物甚至品種中進(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)基因改造，在反向育種中需要復(fù)雜嚴(yán)格的設(shè)計(jì)步驟。值得關(guān)注的是，這些改造的基因，都是在花器官中發(fā)揮功能從而應(yīng)用于育種技術(shù)的?；ㄆ鞴僭谠戳鲙炖碚撝惺堑湫偷膸斓牟糠?，利用源和流，將基因改造的組分（特別是基因沉默信號(hào)）充分的輸送到花器官，在理論上是一種可靠的捷徑。在植物基因沉默研究中已經(jīng)有類似的技術(shù)被廣泛應(yīng)用，例如，植物病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)就可以通過病毒的擴(kuò)散將基因沉默在植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散。其實(shí)，植物病毒介導(dǎo)的基因沉默在某種程度上也可以通過源流庫中的流進(jìn)行擴(kuò)散的。在病毒擴(kuò)散的過程中，其攜帶的基因沉默信息通過篩管在植物體內(nèi)進(jìn)行長距離運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)，將siRNA限制在擬南芥葉片篩管的伴胞細(xì)胞表達(dá)，卻能在臨近的葉肉細(xì)胞或者表皮細(xì)胞中達(dá)到沉默的效果，這個(gè)結(jié)果證實(shí)了siRNA在植物體細(xì)胞間運(yùn)輸。由于植物病毒介導(dǎo)的基因沉默對(duì)病毒的感染力存在依賴，再加上對(duì)siRNA能否在花器官進(jìn)行擴(kuò)散存在疑慮，所以將其在花器官發(fā)揮基因改造的功能并沒有得到推廣，更沒有成功結(jié)合到反向育種技術(shù)的開發(fā)中。最新的研究利用嫁接或者在葉片中瞬時(shí)表達(dá)的技術(shù)，證明了在葉片或者砧木中表達(dá)的21-24堿基的siRNA能夠長距離的運(yùn)輸［30］。針對(duì)DMC1和GFP設(shè)計(jì)的siRNA可以被成功轉(zhuǎn)運(yùn)到減數(shù)分裂活躍的組織。將野生煙草作為接木與具有DMC1 siRNA的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行嫁接，砧木中表達(dá)的DMC1 siRNA能夠大量轉(zhuǎn)運(yùn)到“庫”器官，其中特別是花器官，并有效地降低花器官中DMC1的基因表達(dá)，干擾減數(shù)分裂過程，進(jìn)而阻止染色體重組的發(fā)生。另外，在煙草葉片中通過農(nóng)桿菌注射瞬時(shí)表達(dá)siRNA，也能成功地轉(zhuǎn)運(yùn)到花器官發(fā)揮基因沉默的功能。在擬南芥胚軸嫁接實(shí)驗(yàn)中，接木的花器官中DMC1基因也能被砧木中表達(dá)的siRNA沉默表達(dá)，但是其效率有待提高。除了對(duì)控制染色體重組的基因DMC1進(jìn)行干擾，控制染色體分離的OSD1基因也可能通過同樣的方式實(shí)現(xiàn)沉默。這些實(shí)驗(yàn)都充分說明了利用源流庫中的流能夠高效的將siRNA信號(hào)從源轉(zhuǎn)運(yùn)到庫中發(fā)揮基因沉默的功能。特別是對(duì)DMC1這樣和染色體重組相關(guān)的重要基因設(shè)計(jì)siRNA，能夠用“流”對(duì)siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到花器官對(duì)染色體進(jìn)行操作，該技術(shù)在反向育種后續(xù)的染色體消除的步驟中能否發(fā)揮作用還有待驗(yàn)證，但是能夠阻止染色體重組已經(jīng)使得該技術(shù)在不久的將來極有可能成為反向育種中重要的技術(shù)手段［31］。

［1］ Winter SR, Ohlrogge AJ. Leaf angle, Leaf area, and Corn（Zea mays L.）yield［J］. Agron J, 1973, 65：395-397.

［2］ 劉振業(yè), 劉貞琦.光合作用的遺傳與育種［M］. 貴陽：過州人民出版社, 1984：160-249.

［3］ 楊建昌.水稻產(chǎn)量源庫關(guān)系的研究［J］.江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 14：47-53.

［4］ 王忠孝, 高學(xué)曾, 許金芳, 等.關(guān)于玉米籽粒敗育的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1986（6）：36-40.

［5］ 張秀梅, 任和平, 楊鐵釗.玉米果穗頂部籽粒敗育發(fā)生的時(shí)間與籽粒糖含量的關(guān)系［J］.河南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1984（3）：15-24.

［6］ 王余龍, 蔡建中.水稻籽粒受容活性及其控制途徑［J］.江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1991, 12（2）：17-23.

［7］ 鄭丕堯.玉米不同葉位葉解剖結(jié)構(gòu)的研究II.不同葉位葉片維管束系統(tǒng)的觀察［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1986（6）：41-47.

［8］ Jaeger KE, Wigge P. FT protein acts as a long-range signal in Arabidopsis［J］. Curr Biol, 2007, 17（12）：1050-1054.

［9］ Helariutta, Y, Fukaki H, Dikker J, et al. The SHORT-ROOT gene controls radial patterning of the Arabidopsis root through radial signaling［J］. Cell, 2000, 101（5）：555-567.

［10］ Cui H, Kong D, Liu X, Hao Y. SCARECROW, SCR-LIKE 23 and SHORT-ROOT control bundle sheath cell fate and function in Arabidopsis thaliana［J］. Plant J, 2014, 78（2）：319-327.

［11］ Slewinski TL, Anderson AA, Zhang C, Turgeon R. Scarecrow playsa role in establishing Kranz anatomy in maize leaves［J］. Plant Cell Physiol, 2012, 53：2030-2037.

［12］ Abraham P, Adams R, Giannone RJ, et al. Defining the boundaries and characterizing the landscape of functional genome expression in vascular tissues of Populus using shotgun proteomics［J］. J Proteome Res, 2012, 11（1）：449-460.

［13］ Dafoe NJ, Zamani A, Ekramoddoullah AKM, et al. Analysis of the poplar phloem proteome and its response to leaf wounding［J］. J Proteome Res 2009, 8：2341-50.

［14］ Whitehill JG, Popova-Butler A, Green K, et al. Interspecific proteomic comparisons reveal ash phloem genes potentially involved in constitutive resistance to the emerald ash borer［J］. PLoS One 2011, 6：e24863.

［15］ Cho WK, Chen XY, Rim Y, et al. Extended latex proteome analysis deciphers additional roles of the lettuce laticifer［J］. Plant Biotechnology Reports, 2010, 4（4）：311-319.

［16］ Aki T, Shigyo M, Nakano R, et al. Nano scale proteomics revealed the presence of regulatory proteins including three FT-Like proteins in phloem and xylem saps from rice［J］. Plant Cell Physiol, 2008, 49：767-790.

［17］ Yoo SC, Chen C, Rojas M, et al. Phloem long-distance delivery of FLOWERING LOCUS T（FT）to the apex［J］. Plant J, 2013, 75（3）：456-468.

［18］ Cho WK, Chen XY, Rim Y, et al. Proteome study of the phloem sap of pumpkin using multidimensional protein identification technology［J］. J Plant Physiol, 2010, 167（10）：771-778.

［19］ Lin MK, Lee YJ, Lough TJ, et al. Analysis of the pumpkin phloem proteome provides insights into angiosperm sieve tube function［J］. Mol Cell Proteomics, 2009, 8：343-356.

［20］ Li C, Gu M, Shi N, et al. Mobile FT mRNA contributes to the systemic florigen signalling in floral induction［J］. Sci Rep, 2011, 1（73）：1-7.

［21］ Sasaki T, Chino M, Hayashi H, Fujiwara T. Detection of several mRNA species in rice phloem sap［J］. Plant Cell Physiol, 1998, 39：895-897.

［22］ Hand ML, Koltunow AM. The genetic control of apomixis：asexual seed formation［J］. Genetics, 2014, 197（2）：441-450.

［23］ Forster BP, Heberle-Bors E, Kasha KJ, Touraev A. The resurgence of haploids in higher plants［J］. Trends Plant Sci, 2007, 12：368-375.

［24］ Wijnker E, van Dun K, de Snoo CB, et al. Reverse breeding in Arabidopsis thaliana generates homozygous parental lines from a heterozygous plant［J］. Nat Genet, 2012, 44（4）：467-470.

［25］ Dirks R, van Dun K, de Snoo CB, et al. Reverse breeding：a novel breeding approach based on engineered meiosis［J］. Plant Biotechnol J, 2009, 7（9）：837-845.

［26］ Anai T. Potential of a mutant-based reverse genetic approach for functional genomics and molecular breeding in soybean［J］. Breed Sci, 2012, 61：462-467.

［27］ Wijnker E, Deurhof L, van de Belt J, et al. Hybrid recreation by reverse breeding in Arabidopsis thaliana［J］. Nat Protoc, 2014, 9（4）：761-772.

［28］ Kurzbauer MT, Uanschou C, Chen D, Schlogelhofer P. The recombinases DMC1 and RAD51 are functionally and spatially separated during meiosis in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2012, 24（5）：2058-2070.

［29］ Sanei M, Pickering R, Kumke K, et al. Loss of centromeric histone H3（CENH3）from centromeres precedes uniparental chromosome elimination in interspecific barley hybrids［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（33）：E498-505.

［30］ Zhang WN, Kollwing G, Stecyk E, et al. Graft-transmissible movement of inverted-repeat-induced siRNA signals into flowers［J］. Plant Journal, 2014, 80（1）：106-121.

［31］ McGarry RC, Kragler F. Phloem-mobile signals affecting flowers：applications for crop breeding［J］. Trends Plant Sci, 2013, 18：198-206.

New Crop Breeding Technique from Source-path-sink Theory

Han Xiao
（Biotechnology Research Institute，CAAS，Beijing 100081）

Crop production is a process of photosynthates transportation from source to sink. The movement of photosynthates in plant vascular bundle could drive the movement of plant signaling molecules, such as hormone, transcription factor, peptides and RNAi. In reverse-breeding programs, two key steps including inhibition of chromosome recombination and selective elimination of chromosome could be manipulates by these signal. Recent advances in identifying these long-distance signals targeting flower tissues can be applied to reversebreeding technique.

source-path-sink； vascular bundle； phloem； reverse breeding； long distance movement

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.019

2015-04-10

韓霄，男，博士，研究員，研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：hanxiao@caas.cn