豬多能性干細(xì)胞研究進(jìn)展與前瞻

薛冰華 劉忠華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

豬多能性干細(xì)胞研究進(jìn)展與前瞻

薛冰華 劉忠華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

多能干細(xì)胞具有能夠分化為多種特定細(xì)胞類型的能力，主要包括胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。豬因其在免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理結(jié)構(gòu)上與人有著諸多類似的特點(diǎn)，正逐漸成為人類異種移植、細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究的理想生物學(xué)模型。然而，目前對(duì)豬多能干細(xì)胞的來源、特征及機(jī)制認(rèn)識(shí)的不足直接阻礙了該研究領(lǐng)域的發(fā)展。因此，將對(duì)豬多能性干細(xì)胞的種類、鑒定標(biāo)準(zhǔn)、研究進(jìn)展、亟待解決的問題進(jìn)行詳細(xì)地闡述，并在此基礎(chǔ)上對(duì)豬多能性干細(xì)胞的研究進(jìn)行了展望，希望為該研究領(lǐng)域的科研人員提供參考。

豬；多能干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；胚胎生殖細(xì)胞

干細(xì)胞是一類能夠自我更新，功能還未特化的細(xì)胞群，在特定的條件下，該類細(xì)胞可以分化為執(zhí)行機(jī)體特殊功能的效應(yīng)細(xì)胞，它們廣泛存在于機(jī)體生長發(fā)育過程中的多數(shù)組織和器官中。這些特性使得干細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療中，它可以為細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞；其次，由于藥物篩選和安全檢驗(yàn)不能直接以人為試驗(yàn)對(duì)象，所以干細(xì)胞也是藥物研究的理想模型；最后，干細(xì)胞也在基礎(chǔ)研究、物種繁育等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用前景和優(yōu)越性。然而，由于倫理道德、免疫排斥和生物安全性等問題，人的干細(xì)胞無法直接應(yīng)用于臨床治療，這就要求科研工作者必需尋找合適的動(dòng)物來代替人進(jìn)行臨床前研究。

豬在免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理結(jié)構(gòu)上與人有著諸多類似的特點(diǎn)，飼養(yǎng)和繁殖也較為簡單，因此被作為動(dòng)物疾病模型廣泛地應(yīng)用于人類疾病的臨床研究中。同時(shí)，豬作為大型家畜在畜牧業(yè)生產(chǎn)上有著舉足輕重的地位，這都使得豬的干細(xì)胞、特別是多能干細(xì)胞的建立尤為重要。然而，由于諸多因素的限制，豬多能性干細(xì)胞的建立雖然取得了較大的進(jìn)展，但仍然面臨著建系難度大、成功率較低、多能性較差和分化能力弱等諸多問題，很多技術(shù)和理論問題也仍需要進(jìn)一步探索，如豬多能性干細(xì)胞最適的培養(yǎng)體系、維持多能性的調(diào)控機(jī)制以及影響其獲得核移植和嵌合體動(dòng)物的機(jī)理等。因此，本文將對(duì)豬多能性干細(xì)胞的分類、鑒定標(biāo)準(zhǔn)、研究進(jìn)展、目前存在的問題及可能的解決辦法進(jìn)行詳細(xì)論述。

1 多能性干細(xì)胞的定義和分類

來源于不同發(fā)育階段和不同組織器官的干細(xì)胞在基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳狀態(tài)、體外增殖和分化潛能等方面都存在較大的差異。根據(jù)干細(xì)胞增殖能力和分化潛能的不同，可以把干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。全能干細(xì)胞是指除了能夠發(fā)育出構(gòu)成機(jī)體的3個(gè)胚層的各類細(xì)胞外，還能發(fā)育出支持胎兒在母體存在所必需的胎盤組織和臍帶，最原始的全能干細(xì)胞就是哺乳動(dòng)物精子和卵子結(jié)合后形成的受精卵，它在前幾個(gè)分裂過程中產(chǎn)生的卵裂球均為全能干細(xì)胞，提取這些卵裂球中的任意一個(gè)移植到子宮，均可發(fā)育出一個(gè)完整的生命體。多能干細(xì)胞是指能夠無限增殖且具有分化潛能的一類干細(xì)胞，它能夠產(chǎn)生內(nèi)胚層、中胚層和外胚層來源的各種類型細(xì)胞，多能干細(xì)胞主要包括來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎干細(xì)胞、來源于原始生殖細(xì)胞的胚胎生殖細(xì)胞、來源于畸胎癌的胚胎腫瘤細(xì)胞和體外重編程得到的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。專能干細(xì)胞是指只能分化為一種或密切相關(guān)的幾種類型的細(xì)胞的干細(xì)胞，主要包括造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞在內(nèi)的各類成體干細(xì)胞［1］。

胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞這三種干細(xì)胞在生物學(xué)特性、免疫學(xué)、多能性和發(fā)育潛能等方面擁有相似的特征，均具有形成生殖系嵌合體的能力，這使得多能性干細(xì)胞在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域（包括基因功能研究、細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育機(jī)制的研究等）、臨床治療（包括藥物研發(fā)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究等）和動(dòng)物生產(chǎn)方面（包括核移植、嵌合體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)與研究等）具有獨(dú)特的應(yīng)用前景和優(yōu)越性。因此，后文將重點(diǎn)論述這三種多能性干細(xì)胞在豬中的研究現(xiàn)狀。

胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）最早是在1981年由Evans［2］和Martin［3］兩家實(shí)驗(yàn)室首次從植入前的小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離培養(yǎng)獲得，其后對(duì)其它物種相繼建立了ESCs。Thomson等［4，5］在1995年和1998年分別建立了第一株非人靈長類的ESCs和人的ESCs，所獲得的ESCs可在免疫缺陷鼠體內(nèi)形成畸胎瘤。Li等［6-8］三家實(shí)驗(yàn)室在2008年同時(shí)宣布他們通過使用大鼠源的Lif（Leukemia inhibitory factor）、添加小分子抑制GSK3和MEK途徑以及使用一種來源于成年大鼠皮下連接組織的L細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層可高效而穩(wěn)定的得到大鼠ESCs。在各物種ESCs建立的同時(shí)，胚胎生殖細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞也隨著ESCs培養(yǎng)條件的成熟逐漸被建立起來。胚胎生殖細(xì)胞（Embryonic germ cells，EGCs）最早是在1992年由Resnick等［9］和Matsui等［10］通過體外培養(yǎng)小鼠的原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs）分離得到的，該細(xì)胞系有著與小鼠胚胎干細(xì)胞類似的生物學(xué)特性，其多能性及生殖系嵌合能力后被Stewart等［11］證實(shí)。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）最早是在2006年由Takahashi 和Yamanaka［12］首次將4個(gè)與多能性相關(guān)的基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到小鼠成纖維細(xì)胞中，通過篩選Fbx15（多能性標(biāo)志分子）陽性的細(xì)胞最終獲得的具有小鼠胚胎干細(xì)胞某些特性的多能性干細(xì)胞系，Yamanaka將其命名為“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”（圖1）。iPSCs技術(shù)的誕生深化了人們對(duì)細(xì)胞多能性和基因組重編程的認(rèn)知，并且為解決臨床治療引起的免疫排斥問題和人胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)研究所面臨的倫理學(xué)困境帶來了曙光，因此該技術(shù)自誕生就引發(fā)了iPSCs研究的熱潮，各實(shí)驗(yàn)組迅速圍繞iPSCs建系過程中的篩選標(biāo)記、載體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子、源頭細(xì)胞類型和促進(jìn)效率提高的化合物篩選等方面展開廣泛的研究。

2 豬類胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展

豬ESCs建系的研究始于1990年，建系過程主要依賴于小鼠等物種ESCs建系的經(jīng)驗(yàn)，所獲得的干細(xì)胞系均無法與小鼠ESCs媲美，主要表現(xiàn)是體內(nèi)形成畸胎瘤的能力、體外自發(fā)或誘導(dǎo)向三胚層分化的能力以及生殖系嵌合的能力均較弱。因此，豬ESCs多被命名為“豬類胚胎干細(xì)胞”（豬類ESCs）。本文將從豬類ESCs的來源、培養(yǎng)體系和其它影響建系的因素三方面對(duì)豬類ESCs研究進(jìn)展進(jìn)行闡述（表1）。

圖1 多能干細(xì)胞的起源（以小鼠為例）

首先，細(xì)胞來源方面主要包括以下三部分內(nèi)容。第一，關(guān)于豬類ESCs建系所使用的源頭細(xì)胞的種類：豬類ESCs主要來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，雖然Li等［13］和Chen等［14］分別用4-8細(xì)胞階段的胚胎和桑葚胚作為材料進(jìn)行建系，但由于胚胎貼壁率低、原代克隆無法形成等原因均未獲得穩(wěn)定傳代的豬類ESCs。所以，迄今為止的豬類ESCs均來源于囊胚。第二，關(guān)于豬類ESCs建系所使用的囊胚的種類：2000年以前的研究主要使用體內(nèi)囊胚作為實(shí)驗(yàn)材料，在這之后開始使用體外受精囊胚、孤雌囊胚和核移植囊胚作為實(shí)驗(yàn)材料［15-17］。Miyoshi等［18］用體外受精囊胚分離得到上皮樣的豬類ESCs，該細(xì)胞系用做核移植供體細(xì)胞后，能支持重構(gòu)胚發(fā)育到囊胚階段。Telugu等［19］和Haraguchi等［20］利用iPSCs技術(shù)和小分子體系成功地從體外受精囊胚中分離得到能夠穩(wěn)定傳代的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)樣的豬類ESCs。Kim等［21］、Park等［22］和Jung等［23］用孤雌囊胚得到了類ESCs。Tan等［24］用不同天數(shù)的核移植胚胎獲得了類ESCs，但所獲得細(xì)胞系多能性狀態(tài)較差。第三，關(guān)于豬類ESCs建系所使用的囊胚的時(shí)期：從豬囊胚中分離ESCs的最佳時(shí)期并不確定，前期研究主要集中在5.5-9 d，各時(shí)期的囊胚均能夠分離得到類ESCs。Chen等［14］對(duì)比了不同發(fā)育階段胚胎的建系效率，結(jié)果表明早期孵化囊胚更適合建系，建系效率達(dá)21%，這與筆者實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果相符（結(jié)果暫未發(fā)表）。對(duì)此，筆者認(rèn)為將胚胎按照天數(shù)劃分不能夠充分反應(yīng)胚胎的發(fā)育狀況，各實(shí)驗(yàn)室對(duì)胚胎天數(shù)的計(jì)算也存在差異。這種最佳時(shí)間的不確定性是真正制約豬ESCs分離的原因之一，只有對(duì)豬胚胎早期發(fā)育時(shí)程進(jìn)行系統(tǒng)地研究和劃分，找到最適于多能性干細(xì)胞分離的時(shí)期才有可能分離得到真正的豬ESCs。

其次，培養(yǎng)體系方面。早期研究中使用的培養(yǎng)體系大多源于小鼠ESCs的培養(yǎng)體系，主要成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM、谷氨酰胺、巰基乙醇、非必需氨基酸、抗生素和胎?；蛐律Ｑ澹?5-29］。Moore等［30，31］在培養(yǎng)體系中添加了Lif，但其最終研究結(jié)果表明人源Lif無法維持豬類ESCs的多能性狀態(tài)。近期研究中，各實(shí)驗(yàn)組不約而同地將bFGF添加到豬ESCs培養(yǎng)體系中，Hall等［32］的研究也表明bFGF更利于豬類ESCs的分離培養(yǎng)。值得注意的是，Telugu等［19］和Haraguchi等［20］利用iPSCs技術(shù)和小分子體系分別建立了豬類ESCs，所獲得的細(xì)

胞系可以在體外長期培養(yǎng)并有一定的分化能力，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)體系中添加的細(xì)胞因子分別是Lif和bFGF，這表明所獲得的細(xì)胞系完全依賴著兩條不同的細(xì)胞信號(hào)通路，即LIF-STAT3和FGF-MEK。

表1 豬類胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展

最后，影響建系因素方面。影響豬類ESCs建系的主要因素包括飼養(yǎng)層細(xì)胞的類型、胚胎接種方式和傳代方法。第一，飼養(yǎng)層細(xì)胞的選擇，目前被廣泛使用的是小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF）和STO（永生化的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系）細(xì)胞系，此外，很多實(shí)驗(yàn)室也使用豬胎兒成纖維細(xì)胞（Porcine embryonic fibroblasts，PEF）和豬子宮上皮細(xì)胞（Porcine uterus epithelial，PUE）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。第二，胚胎接種方式，ESCs建系過程中胚胎的接種形式包括內(nèi)細(xì)胞接種和全胚接種［18，21，33］兩種方法，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離方法主要有免疫外科手術(shù)法［16，34］、三步法［35］和酶消化法［36，37］。第三，傳代方法，各實(shí)驗(yàn)組主要使用的是胰酶消化或機(jī)械切割的方法進(jìn)行傳代，但由于已建成的豬類ESCs在形態(tài)上更接近人ESCs，胰酶并不適合此類細(xì)胞的消化，因此在人ESCs傳代過程中使用的膠原酶和Dispase被逐漸應(yīng)用在豬ESCs的分離和傳代上，同時(shí)筆者前期研究結(jié)果顯示將機(jī)械切割法和膠原酶消化法結(jié)合起來更適于豬類ESCs的分離和培養(yǎng)（結(jié)果暫未發(fā)表）。

筆者認(rèn)為，目前的研究結(jié)果顯示豬的多能性調(diào)控基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與小鼠、大鼠以及人可能是不同的，簡單地照搬其它物種的ESCs建系經(jīng)驗(yàn)是不可行的。在諸多影響豬ESCs建系的因素中，能夠維持豬ESCs多能性狀態(tài)的培養(yǎng)液和細(xì)胞信號(hào)通路是兩個(gè)主要因素，這就要求我們必需解析豬早期胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式及相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便發(fā)現(xiàn)豬多潛能調(diào)控與小鼠等物種的區(qū)別，從而促進(jìn)真正的豬多能性干細(xì)胞的建立。

3 豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展

豬胚胎干細(xì)胞建系進(jìn)展緩慢，因此，豬iPSCs的誕生和發(fā)展迅速地推動(dòng)了豬在藥物研發(fā)、疾病臨床研究以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，本文對(duì)豬iPSCs的起源、轉(zhuǎn)錄因子、提高效率的化合物、載體系統(tǒng)和源頭細(xì)胞的研究進(jìn)展做詳細(xì)論述（表2）。

3.1 關(guān)于豬iPSCs的起源

豬iPSCs最早建于2009年，Wu等［38］以豬耳緣成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞作為源頭細(xì)胞，應(yīng)用可誘導(dǎo)（Tet-on/off系統(tǒng)）慢病毒表達(dá)系統(tǒng)向源頭細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入人源六因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28）成功地將豬體細(xì)胞重編程為iPSCs。同年，Esteban等［39］和Ezashi等［40］分別使用經(jīng)典四因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)體系和慢病毒誘導(dǎo)體系成功地建立豬iPSCs。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組所獲得的iPSCs細(xì)胞系呈堿性磷酸酶陽性、表達(dá)多能性基因、核型正常、能夠形成擬胚體和畸胎瘤，但成瘤時(shí)間存在較大差異。值得注意的是，所獲得的細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)存在較大差異，表達(dá)不同的細(xì)胞表面標(biāo)記物，Wu等［38］的iPSCs表達(dá)SSEA-3和SSEA-4，Ezashi等［40］的iPSCs表達(dá)SSEA-1，這可能是由不同的轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系導(dǎo)致的。

3.2 豬iPSCs轉(zhuǎn)錄因子的篩選

2012年，Liu等［41-43］三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別利用豬源兩因子（Oct4和Klf4）和鼠源經(jīng)典四因子在添加Lif的條件下誘導(dǎo)獲得了豬iPSCs，所獲得的細(xì)胞系形態(tài)和多能性都更傾向于小鼠ESCs，能夠向三胚層分化，這暗示了Na?ve狀態(tài)的豬iPSCs細(xì)胞系依賴的信號(hào)通路可能與小鼠胚胎干細(xì)胞依賴的信號(hào)通路一樣，即均依賴LIF-STAT信號(hào)通路。同年，Montserrat等［44］報(bào)道了在無飼養(yǎng)層的條件下利用三因子（Sox2、Klf4和c-Myc）將豬成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs。另外，筆者實(shí)驗(yàn)室［45］發(fā)現(xiàn)，在我們現(xiàn)有的培養(yǎng)體系下［46］，Tbx3和Nr5a2在豬iPSCs誘導(dǎo)的過程中起到了重要作用，這兩因子不僅能提高重編程的效率，甚至單獨(dú)過表達(dá)Nr5a2因子就能使豬胎兒成纖維細(xì)胞重編成為豬iPSCs，這提示我們必需重新審視各轉(zhuǎn)錄因子在豬體細(xì)胞重編程及胚胎發(fā)育過程中是否起到至關(guān)重要的作用。

3.3 在豬iPSCs提高效率的化合物篩選方面

Liu等［41］獲得的兩因子豬iPSCs需要添加組蛋白去乙?；种苿⊿odium Butyrate）、TGF-β信號(hào)通路抑制劑（SB431542）、ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑（PD0325901）、GSK3-β抑制劑（CHIR99021）和cAMP信號(hào)通路促進(jìn)劑（Forskolin）這5個(gè)小分子化合物才能維持多能性狀態(tài)，但此時(shí)，iPSCs外源基因仍然不沉默，同時(shí)我們可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)因子減少時(shí)則需要更多的外部條件來維持豬iPSCs的多能性。Telugu等［19］和Zhang等［47］分別用內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和脂肪干細(xì)胞作為源頭細(xì)胞，在持續(xù)表達(dá)外源基因的同時(shí)添加小分子（Kenpaullone，KP和CHIR99021）才能維持豬iPSCs的多能性。Gu等［46］通過改善基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配方，在添加小分子的基礎(chǔ)上獲得了能夠長期傳代的形態(tài)類似于小鼠ESCs的豬iPSCs，轉(zhuǎn)換后的豬iPSCs兩條X染色體處于激活狀態(tài)，能夠獲得畸胎瘤。以上團(tuán)隊(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明添加小分子化合物可以促進(jìn)豬iPSCs的獲得，但2014年P(guān)etkov等［48］發(fā)現(xiàn)在豬iPSCs建立過程中添加2i（PD0325901，PD和CHIR99021，CH）會(huì)降低豬iPSCs的建系效率和多能性，這與Rodriguez等［49］在豬植入前胚胎的研究結(jié)果相近，說明曾在鼠類建系過程中起到重要作用的小分子抑制劑（PD和CH）是否真的適用于豬iPSCs的建立還有待進(jìn)一步考證。

表2 豬誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞研究進(jìn)展

3.4 豬iPSCs載體系統(tǒng)和源頭細(xì)胞優(yōu)化

Kues等［50］對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)載體進(jìn)行探索，他們使用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共表達(dá)鼠源經(jīng)典四因子，將豬的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為豬iPSCs，該誘導(dǎo)載體進(jìn)入細(xì)胞后，游離在宿主細(xì)胞基因組外，這極大地降低了病毒感染過程中病毒重激活的頻率，為豬iPSCs后期臨床應(yīng)用和畜牧生產(chǎn)的安全性帶來了新的希望。筆者實(shí)驗(yàn)室［51］研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)豬iPSCs誘導(dǎo)效率和其源頭細(xì)胞的核移植囊胚率呈正相關(guān)，不同來源的豬iPSCs細(xì)胞系具有相似的、較低的核移植囊胚率，這與之前報(bào)道的豬iPSCs核移植效率低并且不能獲得核移植后代的結(jié)果相符。

現(xiàn)今，小鼠、大鼠、人、獼猴、豬、牛、羊和兔子等物種均成功建立iPSCs。雖然iPSCs已朝著誘導(dǎo)效率高和生物安全性高的方向快速發(fā)展，但目前iPSCs產(chǎn)生的具體分子機(jī)制仍然未知，其臨床應(yīng)用的安全性也依然有待評(píng)估。同樣，豬iPSCs面臨著外源基因不沉默、內(nèi)源基因激活不足、自我更新需要外源基因持續(xù)表達(dá)、無法得到發(fā)育到期的核移植胎兒等問題，這都說明我們所獲得的豬iPSCs多能性存在缺陷。針對(duì)上述問題，豬iPSCs的后續(xù)工作應(yīng)主要集中在非病毒載體和減少因子誘導(dǎo)豬iPSCs、改變豬iPSCs的多能性狀態(tài)和獲得豬iPSCs的嵌合體后代三個(gè)方向。

4 豬類胚胎生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展

胚胎生殖細(xì)胞（EGCs）是胎兒原始生殖細(xì)胞（PGCs）在體外建系培養(yǎng)得到的。哺乳動(dòng)物中，PGCs最早于原條尾部形成，后隨原條細(xì)胞內(nèi)卷而到達(dá)尿囊附近的卵黃囊背側(cè)內(nèi)胚層，接著PGCs以阿米巴運(yùn)動(dòng)，沿胚胎后腸和腸系膜遷移到中腎腹側(cè)的生殖嵴內(nèi)，在此PGCs經(jīng)歷表觀遺傳重編程并最終形成配子。將從胎兒生殖嵴分離的PGCs培養(yǎng)在含有血清和某些特定生長因子的條件下就會(huì)阻斷其向生殖細(xì)胞的特化，最終被重編程為EGCs，由于EGC與小鼠ESCs具有相似的生物學(xué)特性，PGCs也就為多能性干細(xì)胞的分離提供了一個(gè)新的來源。在對(duì)豬的研究中，與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)相比，PGCs具有易獲得、數(shù)量大、發(fā)育時(shí)辰長和種間差異小等優(yōu)點(diǎn)，更適于豬多能性干細(xì)胞系的建立。

豬的EGC最早建系于1997年，Shim等［56］以24-25日齡豬的生殖嵴為原材料建立了豬EGCs，該細(xì)胞系可以產(chǎn)生嵌合體豬；Piedrahita等［57］成功地對(duì)EGCs進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，獲得了轉(zhuǎn)基因嵌合體豬。目前已有包括筆者實(shí)驗(yàn)室［58］在內(nèi)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)組報(bào)道了他們對(duì)豬EGCs的研究工作，但所獲得的豬EGCs只是部分符合ESCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，真正具有生殖系嵌合能力的豬EGCs還未被建立，這些所獲得的豬EGCs也只能被稱為“豬類胚胎生殖細(xì)胞”（豬類EGCs）。

雖然已有研究者對(duì)豬EGCs培養(yǎng)體系進(jìn)行了探索，例如，基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清的選擇［59］、飼養(yǎng)層細(xì)胞的比較［60］、豬EGCs建系最適胚胎日齡的選擇［58］以及細(xì)胞因子和小分子的使用等［61］，但是這都無法從根本上解決豬EGCs建系難的問題。筆者認(rèn)為，只有立足于豬PGCs本身生物學(xué)特性、深入了解PGCs多能性維持的機(jī)制和積極探索生殖系標(biāo)志基因表達(dá)模式才能夠有效地促進(jìn)豬EGCs的最終建立。

5 豬多能性干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)

多能性干細(xì)胞的鑒定主要包括以下幾個(gè)內(nèi)容：堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）的活性檢測，細(xì)胞表面標(biāo)記物及多能性因子的檢測，體外定向分化或自發(fā)分化潛能的檢測，畸胎瘤和嵌合體的檢測、生殖系嵌合能力以及四倍體補(bǔ)償能力的檢測。另外，核型檢測、啟動(dòng)子甲基化分析、X染色體狀態(tài)分析、端粒酶活性分析和基因圖譜分析等均可作為多能性鑒定的輔助指標(biāo)。在所有鑒定指標(biāo)中，最嚴(yán)格的檢測標(biāo)準(zhǔn)是生殖系嵌合能力和四倍體補(bǔ)償能力的檢測，這也是多能干細(xì)胞鑒定的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

豬類ESCs和豬類EGCs早期的鑒定指標(biāo)主要是形態(tài)學(xué)觀察和擬胚體（Embryonic body，EB）分化實(shí)驗(yàn)。豬類ESCs根據(jù)形態(tài)可被分為兩類，分別是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)樣的克隆和上皮樣的克隆，這兩類克隆均能在體外長期培養(yǎng)并形成EB，說明細(xì)胞形態(tài)和分化潛能并無直接關(guān)聯(lián)，這促進(jìn)了分子檢測和細(xì)胞水平上篩選純化的發(fā)展。分子檢測始于1993年，主要是堿性磷酸酶和階段特異性胚胎抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1，SSEA-1）的表達(dá)被作為多能性的標(biāo)記［35，52］。近年來的研究中已將核型分析、干細(xì)胞的定向分化、轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析、X染色體激活狀態(tài)分析、端粒酶活性分析和畸胎瘤分化分析應(yīng)用到豬類ESCs的建系過程中［17，22，23，62］，生殖系嵌合能力雖然已被作為檢查指標(biāo)，但一直沒有細(xì)胞系能夠獲得具有生殖系嵌合能力的嵌合體動(dòng)物。所以總的來看，已建成的豬類ESCs都只能在某一方面達(dá)到真正ESCs的要求。豬類EGCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)以及發(fā)展進(jìn)程與此相似，此處不做贅述。

豬iPSCs的鑒定指標(biāo)較為完善，主要是依循小鼠ESCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，除了小鼠ESCs的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”外，其余各鑒定指標(biāo)豬iPSCs均可滿足。值得注意的是，West等［53，54］和Fujishiro等［55］報(bào)道他們誘導(dǎo)培養(yǎng)得到了能夠生產(chǎn)嵌合體豬的iPSCs細(xì)胞系，所獲得的胎豬或仔豬中并沒有明顯腫瘤的形成，在West等的研究結(jié)果中，共有4頭妊娠個(gè)體發(fā)育到期，出生仔豬數(shù)為36頭（34活，2死），成活個(gè)體中29頭為嵌合體（85.3%），但作為嵌合體的判斷依據(jù)僅有外源基因的RT-PCR結(jié)果，所以此結(jié)果的準(zhǔn)確性有待商榷。

豬多能性干細(xì)胞的研究領(lǐng)域仍然存在許多問題有待解決，例如，如何高效地獲得各類豬多能性干細(xì)胞，如何維持其自我更新和分化的能力，如何得到發(fā)育到期的核移植和嵌合體胎兒，如何提高其在科研應(yīng)用中的安全性，如何定向誘導(dǎo)豬多能性干細(xì)胞向某一特定類型的細(xì)胞分化并將其作為醫(yī)學(xué)治療的臨床前研究工具等，這些問題的解決有待于從根本上闡明體細(xì)胞重編程、豬多能性干細(xì)胞自我更新和定向分化的分子調(diào)控機(jī)制。豬基因組圖譜的公布使得人們更易于找到維持豬多能性干細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞信號(hào)通路，通過篩選相應(yīng)的細(xì)胞因子和小分子超激活或抑制該信號(hào)通路，剔除可能誘使豬多能性干細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的因素，使得建立真正的豬多能性干細(xì)胞系成為可能。

［1］Stewart Sell. Stem cells handbook［M］. Totowa：Humana Press, 2004.

［2］Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］. Nature, 1981, 292（5819）：154-156.

［3］Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78（12）：7634-7638.

［4］Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92（17）：7844-7848.

［5］Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts［J］. Science, 1998, 282（5391）：1145-1147.

［6］Buehr M, Meek S, Blair K, et al. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts［J］. Cell, 2008, 135（7）：1287-1298.

［7］Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, et al. Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts［J］. Cell, 2008, 135（7）：1299-1310.

［8］Ueda S, Kawamata M, Teratani T, et al. Establishment of rat embryonic stem cells and making of chimera rats［J］. PLoS One, 2008, 3（7）：e2800.

［9］Resnick JL, Bixler LS, Cheng L, et al. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture［J］. Nature, 1992, 359（6395）：550-551.

［10］Matsui Y, Zsebo K, Hogan BL. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture［J］. Cell, 1992, 70（5）：841-847.

［11］Stewart CL, Gadi I, Bhatt H. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line［J］. Dev Biol, 1994, 161（2）：626-628.

［12］Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］. Cell, 2006, 126（4）：663-676.

［13］Li M, Li YH, Hou Y, et al. Isolation and culture of pluripotent cells from in vitro produced porcine embryos［J］. Zygote, 2004, 12（1）：43-48.

［14］ Chen LR, Shiue YL, Bertolini L, et al. Establishment of pluripotent cell lines from porcine preimplantation embryos［J］. Theriogenology, 1999, 52（2）：195-212.

［15］ Brevini TA, Tosetti V, Crestan M, et al. Derivation and characterization of pluripotent cell lines from pig embryos of different origins［J］. Theriogenology, 2007, 67（1）：54-63.

［16］ Son HY, Kim JE, Lee SG, et al. Efficient derivation and long term maintenance of pluripotent porcine embryonic stem-like cells［J］. Asian-Aust J Anim Sci, 2009, 22（1）：26-34.

［17］ Brevini TA, Pennarossa G, Attanasio L, et al. Culture conditions and signalling networks promoting the establishment of cell lines from parthenogenetic and biparental pig embryos［J］. Stem Cell Rev, 2010, 6（3）：484-495.

［18］Miyoshi K, Taguchi Y, Sendai Y, et al. Establishment of a porcine cell line from in vitro-produced blastocysts and transfer of the cells into enucleated oocytes［J］. Biol Reprod, 2000, 62（6）：1640-1646.

［19］Telugu BP, Ezashi T, Sinha S, et al. Leukemia Inhibitory Factor（LIF）-dependent, pluripotent stem cells established from inner cell mass of porcine embryos［J］. J Biol Chem, 2011, 286（33）：28948-28953.

［20］Haraguchi S, Kikuchi K, Nakai M, et al. Establishment of selfrenewing porcine embryonic stem cell-like cells by signal inhibition［J］. J Reprod Dev, 2012, 58（6）：707-716.

［21］Kim HS, Son HY, Kim S, et al. Isolation and initial culture of porcine inner cell masses derived from in vitro-produced blastocysts［J］. Zygote, 2007, 15（1）：55-63.

［22］Park JK, Kim HS, Uh KJ, et al. Primed pluripotent cell lines derived from various embryonic origins and somatic cells in pig［J］. PLoS One, 2013, 8（1）：e52481.

［23］Jung SK, Kim HJ, Kim CL, et al. Enhancing effects of serumrich and cytokine-supplemented culture conditions on developing blastocysts and deriving porcine parthenogenetic embryonic stem cells［J］. J Vet Sci, 2014, 15（4）：519-528.

［24］Tan G, Ren L, Huang Y, et al. Isolation and culture of embryonic stem-like cells from pig nuclear transfer blastocysts of different days［J］. Zygote, 2012, 20（4）：347-352.

［25］ Evans M, Notaranni E, Laurie S, Moor RM. Derivation and preliminary characterization of pluripotent cell lines from porcine and bovine blastocysts［J］. Theriogenology, 1990, 33（1）：125-128.

［26］ Piedrahita JA, Anderson GB, Bondurant RH. Influence of feeder layer type on the efficiency of isolation of porcine embryo-derived cell lines［J］. Theriogenology, 1990, 34（5）：865-877.

［27］ Strojek RM, Reed MA, Hoover JL, et al. A method for cultivating morphologically undifferentiated embryonic stem cells from porcine blastocysts［J］. Theriogenology, 1990, 33（4）：901-913.

［28］Piedrahita JA, Anderson GB, Bondurant RH. On the isolation of embryonic stem cells：Comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos［J］. Theriogenology, 1990, 34（5）：879-901.

［29］Anderson GB, Choi SJ, Bondurant RH. Survival of porcine inner cell masses in culture and after injection into blastocysts［J］. Theriogenology, 1994, 42（1）：204-212.

［30］Moore K, Piedrahita JA. Effects of heterologous hematopoietic cytokines on in vitro differentiation of cultured porcine inner cell masses［J］. Mol Reprod Dev, 1996, 45（2）：139-144.

［31］Moore K, Piedrahita JA. The effects of human leukemia inhibitory factor（hLIF）and culture medium on in vitro differentiation of cultured porcine inner cell mass（pICM）［J］. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1997, 33（1）：62-71.

［32］Hall VJ, Christensen J, Gao Y, et al. Porcine pluripotency cell signaling develops from the inner cell mass to the epiblast during early development［J］. Dev Dyn, 2009, 238（8）：2014-2024.

［33］Hochereau-de Reviers MT, Perreau C. In vitro culture of embryonic disc cells from porcine blastocysts［J］. Reprod Nutr Dev, 1993, 33（5）：475-483.

［34］Yang JR, Shiue YL, Liao CH, et al. Establishment and characterization of novel porcine embryonic stem cell lines expressing hrGFP［J］. Cloning Stem Cells, 2009, 11（2）：235-244.

［35］Talbot NC, Rexroad CE, Pursel VG, et al. Culturing the epiblast cells of the pig blastocyst［J］. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1993, 29A（7）：543-554.

［36］Li M, Zhang D, Hou Y, et al. Isolation and culture of embryonic stem cells from porcine blastocysts［J］. Mol Reprod Dev, 2003, 65（4）：429-434.

［37］Li M, Ma W, Hou Y, et al. Improved isolation and culture of embryonic stem cells from Chinese miniature pig［J］. J Reprod Dev, 2004, 50（2）：237-244.

［38］Wu Z, Chen J, Ren J, et al. Generation of pig induced pluripotent stem cells with a drug-inducible system［J］. J Mol Cell Biol, 2009, 1（1）：46-54.

［39］Esteban MA, Xu J, Yang J, et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig［J］. J Biol Chem, 2009, 284（26）：17634-17640.

［40］Ezashi T, Telugu BP, Alexenko AP, et al. Derivation of induced pluripotent stem cells from pig somatic cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106（27）：10993-10998.

［41］Liu K, Ji G, Mao J, et al. Generation of porcine-induced pluripotent stem cells by using OCT4 and KLF4 porcine factors［J］. Cell Reprogram, 2012, 14（6）：505-513.

［42］Thomson AJ, Pierart H, Meek S, et al. Reprogramming pig fetal fibroblasts reveals a functional LIF signaling pathway［J］. CellReprogram, 2012, 14（2）：112-122.

［43］Cheng D, Guo Y, Li Z, et al. Porcine induced pluripotent stem cells require LIF and maintain their developmental potential in early stage of embryos［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e51778.

［44］Montserrat N, de Onate L, Garreta E, et al. Generation of feederfree pig induced pluripotent stem cells without Pou5f1［J］. Cell Transplant, 2012, 21（5）：815-825.

［45］Wang J, Gu Q, Hao J, et al. Tbx3 and Nr5alpha2 play important roles in pig pluripotent stem cells［J］. Stem Cell Rev, 2013, 9（5）：700-708.

［46］Gu Q, Hao J, Hai T, et al. Efficient generation of mouse ESCs-like pig induced pluripotent stem cells［J］. Protein Cell, 2014, 5（5）：338-342.

［47］Zhang Y, Wei C, Zhang P, et al. Efficient reprogramming of naivelike induced pluripotent stem cells from porcine adipose-derived stem cells with a feeder-independent and serum-free system［J］. PLoS One, 2014, 9（1）：e85089.

［48］Petkov S, Hyttel P, Niemann H. The small molecule inhibitors PD0325091 and CHIR99021 reduce expression of pluripotencyrelated genes in putative porcine induced pluripotent stem cells［J］. Cell Reprogram, 2014, 16（4）：235-240.

［49］Rodriguez A, Allegrucci C, Alberio R. Modulation of pluripotency in the porcine embryo and iPS cells［J］. PLoS One, 2012, 7（11）：e49079.

［50］Kues WA, Herrmann D, Barg-Kues B, et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells［J］. Stem Cells Dev, 2013, 22（1）：124-135.

［51］Xie B, Wang J, Liu S, et al. Positive correlation between the efficiency of induced pluripotent stem cells and the development rate of nuclear transfer embryos when the same porcine embryonic fibroblast lines are used as donor cells［J］. Cell Reprogram, 2014, 16（3）：206-214.

［52］Wianny F, Perreau C, Hochereau de Reviers MT. Proliferation and differentiation of porcine inner cell mass and epiblast in vitro［J］. Biol Reprod, 1997, 57（4）：756-764.

［53］West FD, Terlouw SL, Kwon DJ, et al. Porcine induced pluripotent stem cells produce chimeric offspring［J］. Stem Cells Dev, 2010, 19（8）：1211-1220.

［54］ West FD, Uhl EW, Liu Y, et al. Chimeric Pigs produced from induced pluripotent stem cells demonstrate germline transmission and no evidence of tumor formation in young pigs［J］. Stem Cells, 2011, 29（10）：1640-1643.

［55］Fujishiro SH, Nakano K, Mizukami Y, et al. Generation of naivelike porcine-induced pluripotent stem cells capable of contributing to embryonic and fetal development［J］. Stem Cells Dev, 2013, 22（3）：473-482.

［56］Shim H, Gutierrez-Adan A, Chen LR, et al. Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells［J］. Biol Reprod, 1997, 57（5）：1089-1095.

［57］Piedrahita JA, Moore K, Oetama B, et al. Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies［J］. Biol Reprod, 1998, 58（5）：1321-1329.

［58］ Cong Y, Ma J, Sun R, et al. Derivation of putative porcine embryonic germ cells and analysis of their multi-lineage differentiation potential［J］. J Genet Genomics, 2013, 40（9）：453-464.

［59］ Petkov SG, Anderson GB. Culture of porcine embryonic germ cells in serum-supplemented and serum-free conditions：the effects of serum and growth factors on primary and long-term culture［J］. Cloning Stem Cells, 2008, 10（2）：263-276.

［60］ Lee CK, Piedrahita JA. Effects of growth factors and feeder cells on porcine primordial germ cells in vitro［J］. Cloning, 2000, 2（4）：197-205.

［61］Wen J, Liu J, Song G, et al. Effects of 6-bromoindirubin-3’-oxime on the maintenance of pluripotency of porcine embryonic germ cells in combination with stem cell factor, leukemia inhibitory factor and fibroblast growth factor［J］. Reproduction, 2010, 139（6）：1039-1046.

［62］Choi KH, Park JK, Kim HS, et al. Epigenetic changes of lentiviral transgenes in porcine stem cells derived from embryonic origin［J］. PLoS One, 2013, 8（8）：e72184.

Porcine Pluripotent Stem Cells：Facts，Challenges and Hopes

Xue Binghua Liu Zhonghua
（Lab of Embryo Biotechnology，Northeast Agriculture University，Harbin 150030）

Pluripotent stem cells, including embryonic stem cells, embryonic germ cells and induced pluripotent stem cells, have the ability to differentiate into a variety of specific cell lines. Swine is considered as a kind of ideal model for pre-clinical development of human xenotransplantation, therapeutic approaches and regenerative medicine due to its morphological and functional affinity with man. However, a number of open questions need to be addressed since we know little about the sorting, derivation, characterization and mechanisms of porcine pluripotent stem cells. In this review, we elaborated the latest progresses on the derivation of porcine pluripotent stem cells, the evaluation criteria of stemness, scientific and technique questions encountere, and we also provide our perspectives on the future study ofporcine pluripotentstem cells research, in the hope of sharing experimence of exploring this field with other researchers.

swine；pluripotent stem cells；embryonic stem cells；induced pluripotent stem cells；embryonic germ cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.009

2015-02-11

“973”重大科學(xué)問題導(dǎo)向項(xiàng)目（2011CBA01006），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371457）

薛冰華，女，博士研究生，研究方向：多能性干細(xì)胞；E-mail：xuebinghua123@126.com

劉忠華，男，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學(xué)；E-mail：liu86@126.com