表面增強(qiáng)拉曼光譜在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

曹偉麗，汪崇文，肖瑞，王升啟1，

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

食源性致病菌污染引起的疾病已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年有7600萬(wàn)人身患食源性疾病，有5000致死病例；據(jù)2000年的報(bào)道，英國(guó)有130萬(wàn)人患食源性疾病，有480個(gè)致死病例[1]。2006～2010年，我國(guó)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)共收到食源性疾病暴發(fā)事件報(bào)告2023起，累計(jì)發(fā)病62920人，死亡967人，其中致病菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，分別占40.09%和61.92%[2]。它不但危及消費(fèi)者健康和生命，而且對(duì)個(gè)人、單位和社會(huì)造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失，包括醫(yī)療費(fèi)用、致殘而失業(yè)、勞動(dòng)能力下降等。最常規(guī)最經(jīng)典的檢測(cè)方法如鋪板培養(yǎng)法[3]、生化檢測(cè)[4]等，操作過(guò)程較為繁瑣，而且非常耗時(shí)，難以滿足食源性疾病預(yù)防控制的需要。如何快速靈敏地檢測(cè)出食源性致病菌的存在，已成為控制食品安全問(wèn)題的關(guān)鍵。

利用振動(dòng)光譜如紅外光譜、拉曼光譜等技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌早有研究。但紅外光譜對(duì)水非常敏感，不能充分發(fā)揮其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。拉曼光譜依賴于激發(fā)光的非彈性散射和分子間的振動(dòng)產(chǎn)生指紋圖譜，以此來(lái)鑒別特定的待檢分子，具有快速檢測(cè)多種化學(xué)、生物物質(zhì)的能力，是一種可實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法。而且水的拉曼效應(yīng)很弱，這使得拉曼光譜對(duì)水環(huán)境中的生物樣品檢測(cè)非常有效，另外拉曼特征峰比紅外特征峰要窄，拉曼光譜在較廣范圍的激光波長(zhǎng)下能夠提供比紅外光譜更加具體和更易解讀的生物和化學(xué)信息。拉曼光譜的這些優(yōu)點(diǎn)使其常被用于微生物的檢測(cè)和表征[5-9]。但普通拉曼光譜信號(hào)弱，檢測(cè)靈敏度低，限制了其在食源性致病菌檢測(cè)中的發(fā)展。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）以金屬納米結(jié)構(gòu)介導(dǎo)信號(hào)增強(qiáng)，相比普通拉曼光譜具有更高的分辨率和靈敏度，可實(shí)現(xiàn)高達(dá)1014倍的單分子拉曼信號(hào)增強(qiáng)，在低濃度分析物的檢測(cè)上更加有優(yōu)勢(shì)[10-11]。它是一種高靈敏的拉曼檢測(cè)技術(shù)，具體是指在特殊制備的一些貴金屬表面或溶膠中，由于樣品表面或近表面的電磁場(chǎng)的增強(qiáng)導(dǎo)致吸附分子的拉曼散射信號(hào)比普通拉曼散射信號(hào)大大增強(qiáng)（6～14個(gè)數(shù)量級(jí)）的現(xiàn)象。SERS能有效避免溶液相中相同物質(zhì)的信號(hào)干擾，具有極高的靈敏度和表面選擇性，能獲得高質(zhì)量的表面拉曼信號(hào)。SERS效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)后，很快在生物、醫(yī)學(xué)、材料、環(huán)境等方面得到廣泛應(yīng)用[12-14]。我們對(duì)目前國(guó)內(nèi)外食源性致病菌的SERS檢測(cè)方法進(jìn)行歸納和綜述，并對(duì)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行闡述和分析。

1 食源性致病菌菌體檢測(cè)

1.1 無(wú)標(biāo)記菌體檢測(cè)

無(wú)標(biāo)記的SERS菌體檢測(cè)方法由于不需要特殊的檢測(cè)標(biāo)記物如染料分子或化學(xué)發(fā)光分子等，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單快速。

1.1.1 納米金屬膠體菌體檢測(cè) 研究者大多通過(guò)不同大小的AuNP、AgNP等納米顆?；蛴蔁o(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)的納米顆粒團(tuán)聚體作為SERS增強(qiáng)基底，簡(jiǎn)單地與食源性致病菌混合而獲得其拉曼光譜。呂璞等[15]以整個(gè)大腸桿菌和志賀菌為研究對(duì)象，通過(guò)菌體與納米銀膠體混合均勻后滴于硅基底上，利用拉曼光譜儀檢測(cè)其拉曼信號(hào)來(lái)區(qū)分大腸桿菌和志賀菌。結(jié)果表明，未與納米銀顆?；旌系拇竽c桿菌和志賀菌沒(méi)有明顯的拉曼信號(hào)，而與納米銀顆粒混合后有明顯的拉曼信號(hào)，二者有明顯的區(qū)別，且重現(xiàn)性良好。蘇永波等[16]用便攜式拉曼光譜儀獲得了金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌在微波法制備的納米銀溶膠上的表面增強(qiáng)拉曼光譜。3種細(xì)菌的拉曼振動(dòng)峰的位置和強(qiáng)度區(qū)別明顯，因此SERS技術(shù)可用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌的快速鑒別。根據(jù)SERS的增強(qiáng)效應(yīng)，黃玉坤等[17]制備金納米溶膠作為增強(qiáng)試劑，采用36種不同的病原菌隨機(jī)編號(hào)作為未知樣品進(jìn)行拉曼光譜掃描檢測(cè)，通過(guò)聚類分析達(dá)到種屬鑒別，初步建立了病原菌SERS快速鑒別方法。

Senguptaa等[18]以納米銀膠體為SERS基底，對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門菌進(jìn)行了鑒別，并通過(guò)對(duì)含有N-乙?；陌被咸烟呛蛶О被腖-賴氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸進(jìn)行檢測(cè)，初步分析了致病菌拉曼峰歸屬問(wèn)題。Wang等[19]在96孔板中以50 nm AuNP為SERS基底，通過(guò)與菌體混合、短暫培養(yǎng)，5 min內(nèi)檢測(cè)菌體的拉曼信號(hào)，所得數(shù)據(jù)用PCA、HCA軟件分析后，對(duì)7種不同的致病菌進(jìn)行了區(qū)分歸類。Yao[20]以AuNP為SERS基底，對(duì)9種致病菌進(jìn)行了SERS檢測(cè)，PCA和HCA分析實(shí)現(xiàn)了歸類。SERS技術(shù)與數(shù)學(xué)分析方法結(jié)合，增強(qiáng)了其檢測(cè)食源性病原菌的實(shí)用性及靈敏性，應(yīng)用潛力很大。

為了提高菌體檢測(cè)的靈敏度及重復(fù)性，楊丹婷等[21]以大腸桿菌DSM株為檢測(cè)模型、膠體銀為液態(tài)基底，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件（振蕩速度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度），選取較優(yōu)條件對(duì)培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。DSM 1116在制備的AgNP溶液中于37℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)3 h為獲得SER檢測(cè)的較優(yōu)培養(yǎng)條件。以此條件，通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果歸一化處理，對(duì)大腸桿菌DSM 498/1116/5695進(jìn)行了鑒別。另外還檢測(cè)出單個(gè)大腸桿菌的拉曼峰，其出峰位置與溶液中細(xì)菌的出峰位置相同。通過(guò)SERS成像技術(shù)能夠檢測(cè)到大腸桿菌的最低濃度為1×105/mL。這種在膠體銀中培養(yǎng)后檢測(cè)的方法比未培養(yǎng)的檢測(cè)方法的拉曼信號(hào)強(qiáng)度提高到3.5倍，靈敏度和重復(fù)性也得到提升。

上述以金屬膠體為SERS基底檢測(cè)致病菌的方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，不需要特殊裝備，但結(jié)果重復(fù)性差。納米顆粒與細(xì)菌的混合溶液往往不均一[22]，金屬膠體的形狀、大小的微小變化都可以改變其SERS增強(qiáng)因子，且納米顆粒與致病菌細(xì)胞壁之間不充分的結(jié)合常常得不到重復(fù)性好的拉曼光譜，這在一定程度上限制了SERS技術(shù)的應(yīng)用。

1.1.2 固態(tài)基底菌體檢測(cè) 為了提高SERS檢測(cè)致病菌方法的重復(fù)性，很多研究者研制固態(tài)基底對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)。2009年，波士頓大學(xué)的Yan等[23]通過(guò)在電場(chǎng)力作用下，以10 nm Au和40 nm Au自組裝制備固態(tài)基底，對(duì)大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)多元方差、NCAS等對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這3種菌的鑒別。

Zhao[24]帶領(lǐng)他的團(tuán)隊(duì)利用斜角沉積技術(shù)，用專門設(shè)計(jì)的電子波束蒸鍍系統(tǒng)制備了銀基底。他們使用便攜式和手持式拉曼光譜儀，以萬(wàn)古霉素修飾的銀基底檢測(cè)了致病菌。純菌體樣本的最低檢測(cè)限為102CFU/mL，綠豆芽樣本的最低檢測(cè)限為103CFU/mL。另外，該課題組結(jié)合數(shù)學(xué)分析方法，通過(guò)主成分分析，對(duì)不同菌株進(jìn)行了區(qū)分，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期少于4 h。這種方法提供了SERS檢測(cè)微量食源性致病菌的有力平臺(tái)，同時(shí)具有在實(shí)際環(huán)境中應(yīng)用的潛力，為SERS技術(shù)的推廣應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1.2 抗體標(biāo)記法菌體檢測(cè)

1.2.1 單組抗體標(biāo)記檢測(cè) 2010年，Wigginton等[25]通過(guò)膠體金標(biāo)記一組抗體的方法得到待測(cè)菌的拉曼信號(hào)。他們將含有致病菌的樣品用膜濾器過(guò)濾，并捕獲在膜的頂部；以40 nm膠體金標(biāo)記抗體，與待檢溶液孵育30 min。標(biāo)記抗體的膠體金與待檢菌特異性結(jié)合，然后通過(guò)PCTE膜過(guò)濾，清洗后，未與抗體結(jié)合的致病菌被洗掉，結(jié)合了膠體金的待檢菌通過(guò)拉曼成像檢測(cè)。這種方法檢測(cè)特異性高，能從含有多種菌體的樣本中分離出待檢菌。但是由于蛋白質(zhì)的空間位阻，使得膠體金與待檢菌距離加大，其SERS增強(qiáng)作用減弱，使得檢測(cè)靈敏度較低。

1.2.2 雙組抗體標(biāo)記檢測(cè) 為提高檢測(cè)靈敏度，許多研究采用抗體-抗原-抗體夾心法結(jié)合SRRS技術(shù)檢測(cè)致病菌。首先拉曼復(fù)合物偶聯(lián)抗體后特異性捕獲樣品中的致病菌，然后與連有抗體的液態(tài)基底結(jié)合，拉曼光譜儀檢測(cè)拉曼信號(hào)。在利用SERS抗原抗體夾心法檢測(cè)致病菌方面，Wang、Guven等做了很多研究，并取得了一定的成果。Wang等以二氧化硅包裹順磁性納米顆粒Fe3O4為液態(tài)基底、納米Au-MBA為拉曼復(fù)合物，檢測(cè)了花生液中的3種致病菌，最低檢測(cè)限為103CFU/mL[26]。Guven等以棒狀金膠體結(jié)合DTNB為拉曼復(fù)合物、金包裹順磁性納米顆粒Fe3O4為液態(tài)基底，檢測(cè)DTNB的拉曼信號(hào)。檢測(cè)了濃度為101～107CFU/mL的大腸桿菌，在4.7×101～4.7×104CFU/mL范圍內(nèi)拉曼信號(hào)強(qiáng)度與菌體濃度有良好的線性關(guān)系，R2為0.992。最低檢測(cè)限（LOD）為8 CFU/mL，定量限（LOQ）為24 CFU/mL[27]。這種方法基于抗原抗體免疫反應(yīng)，特異性好；同時(shí)由于拉曼標(biāo)志物的信號(hào)較菌體本身信號(hào)強(qiáng)，在外加磁場(chǎng)作用下納米顆粒Fe3O4對(duì)待檢物進(jìn)行有效富集，故可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。但是由于需要能特異性與致病菌反應(yīng)的一對(duì)抗體，這種方法的檢測(cè)成本較高，偶聯(lián)抗體等步驟使得前期實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，且由于蛋白存放周期的限制，其應(yīng)用有效期較短，且偶聯(lián)抗體后的拉曼復(fù)合物穩(wěn)定性仍有待提高。

2 食源性致病菌標(biāo)記物檢測(cè)

吡啶二羧酸（DPA）是致病菌的休眠體-芽孢中特有的生物標(biāo)記物。通過(guò)檢測(cè)DPA，可實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌芽孢的檢測(cè)[28]。2009年，Cheng等[29]利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修飾金基底，然后在PVP上面修飾一層金納米顆粒作為SERS基底檢測(cè)DPA，最低檢測(cè)限為0.1×10-9mol/L，而且在低濃度范圍內(nèi)DPA的拉曼信號(hào)強(qiáng)度和它的濃度之間呈線性相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為建立高靈敏度的基于SERS對(duì)致病菌孢子生物標(biāo)志物進(jìn)行識(shí)別的技術(shù)提供了很好的研究基礎(chǔ)。2年后，該課題組利用金納米顆粒作為SERS基底檢測(cè)枯草芽孢桿菌孢子釋放的DPA[30]。該方法讓SERS檢測(cè)致病菌孢子具有更高的分辨率和靈敏性。2013年，Cowcher小組[31]以銀納米溶膠作為SERS基底，結(jié)合數(shù)學(xué)分析方法，建立了一套便攜式快速檢測(cè)病菌的檢測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)5×10-9DPA。

與直接檢測(cè)完整菌體相比，檢測(cè)致病菌孢子標(biāo)記物具有更高的分辨率和靈敏性，這在檢測(cè)環(huán)境中是否存在致病菌時(shí)具有很好的實(shí)用性。但是由于DPA是致病菌孢子中共有的物質(zhì)，所以通過(guò)檢測(cè)DPA無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同菌株的鑒別與區(qū)分。

3 食源性致病菌核酸檢測(cè)

2010年韓國(guó)的Kang等[32]以4種致病菌的目的DNA片段為待檢物，設(shè)計(jì)了2條與目的DNA片段互補(bǔ)配對(duì)的DNA探針，將其中一條通過(guò)巰基固定在普通硅基底上作為捕獲探針，用拉曼染料、AuNP與另一條DNA序列相連作為檢測(cè)探針，其中AuNP起SERS增強(qiáng)作用，增強(qiáng)因子為2.6×103。該方法的最低檢測(cè)濃度為10 pmol/L。

這種檢測(cè)方法靈敏度很高，但在實(shí)際應(yīng)用中可行性不高。首先，須從菌體中提取核酸，樣品前處理過(guò)程繁瑣；其次，基于SERS檢測(cè)食源性致病菌核酸的主要工作是制作與目標(biāo)寡核苷酸互補(bǔ)的檢測(cè)寡核苷酸探針和捕獲寡核苷酸探針，而設(shè)計(jì)探針需要目的DNA片段的堿基序列，這就限制了此方法的實(shí)際應(yīng)用，且偶聯(lián)核酸等實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為繁瑣，周期較長(zhǎng)。

4 SERS與其他技術(shù)聯(lián)用

SERS與其他技術(shù)連用，是為了取長(zhǎng)補(bǔ)短，實(shí)現(xiàn)致病菌檢測(cè)方法的優(yōu)化。2003年，Alexander等[33]采用近紅外-SERS獲得單一細(xì)菌孢子的拉曼光譜。他們把60 nm AuNP修飾在玻璃上作為SERS基底，在787 nm激光激發(fā)下，對(duì)嗜熱芽孢桿菌的2種不同菌株的單個(gè)孢子進(jìn)行了檢測(cè)，與傳統(tǒng)拉曼光譜相比，靈敏度增強(qiáng)了102。

5 結(jié)語(yǔ)

由于食源性致病菌在數(shù)百萬(wàn)細(xì)菌中只占很少的一部分（＜100 CFU/g），尤其當(dāng)它們濃度較低時(shí)，很難被檢測(cè)出來(lái)[34]。這就需要開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、可靠、快速、靈敏、有選擇性及成本可行的檢測(cè)技術(shù)。這種檢測(cè)技術(shù)應(yīng)該能夠適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以滿足實(shí)際應(yīng)用中食源性疾病預(yù)防控制的需要。根據(jù)SERS技術(shù)的理論及應(yīng)用實(shí)踐，人們已建立了很多快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、低耗的SERS檢測(cè)技術(shù)。但是，目前仍未能實(shí)現(xiàn)SERS檢測(cè)技術(shù)的產(chǎn)品化與廣泛推廣應(yīng)用，各項(xiàng)研究仍須進(jìn)一步完善與優(yōu)化。

近年來(lái)SERS技術(shù)發(fā)展迅速，隨著微加工技術(shù)和納米技術(shù)的進(jìn)步，拉曼光譜儀將不斷微型化，各種便攜式、手持式拉曼光譜儀的出現(xiàn)，使在市場(chǎng)上直接檢測(cè)食源性致病菌成為可能。拉曼光譜儀還將進(jìn)一步提高與計(jì)算機(jī)的緊密結(jié)合，樣本信息采集、數(shù)據(jù)處理、分析連續(xù)完成，形成檢測(cè)的自動(dòng)化系統(tǒng)。SERS技術(shù)的不斷進(jìn)步，必然會(huì)要求不斷降低檢測(cè)成本，提高靈敏度、穩(wěn)定性，這些特性的改善也會(huì)加速這項(xiàng)致病菌檢測(cè)技術(shù)的市場(chǎng)化、商品化應(yīng)用進(jìn)程。

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