杏鮑菇液體菌種制備條件的研究

楊麗維，王玉，陳穎，班立桐，*，劉靜

（1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384；3.天津鴻濱禾盛農(nóng)業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，天津300400）

杏鮑菇液體菌種制備條件的研究

楊麗維1，王玉2，陳穎1，班立桐2，*，劉靜3

（1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384；3.天津鴻濱禾盛農(nóng)業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，天津300400）

為了縮短杏鮑菇的制種和生產(chǎn)周期，提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)杏鮑菇液體菌種搖瓶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化研究。試驗(yàn)表明，適宜的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、0.01 g/L、蛋白胨3 g/L；適宜的培養(yǎng)條件是：接種量為12%、接種齡為培養(yǎng)4 d的菌種、裝液量為100mL/250mL、搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min、pH為6.0。

杏鮑菇；液體菌種；制備條件

杏鮑菇又名刺芹側(cè)耳、鮑魚(yú)菇，是一種集食用、藥用于一體的珍稀食用菌，其子實(shí)體菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，口感獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]。杏鮑菇很適合于工廠化栽培，目前生產(chǎn)上多數(shù)是采用固體菌種作為栽培種，這種傳統(tǒng)的生產(chǎn)模式因勞動(dòng)強(qiáng)度大、制種生產(chǎn)周期長(zhǎng)、污染率高而不能滿足生產(chǎn)的需要，不利于杏鮑菇生產(chǎn)的規(guī)模化和機(jī)械化[3]。由于液體菌種生產(chǎn)具有制種周期短，發(fā)菌速度快，菌齡一致，污染率低等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到人們的重視[4]。液體菌種在杏鮑菇生產(chǎn)上的應(yīng)用，有利于杏鮑菇栽培生產(chǎn)的工廠化和現(xiàn)代化[3]。本試驗(yàn)對(duì)適合杏鮑菇液體菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，旨在為杏鮑菇液體菌種的應(yīng)用與推廣提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

杏鮑菇，引自韓國(guó)，天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)教研室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，磷酸二氫鉀3，硫酸鎂1.5，瓊脂20，0.02，蛋白胨5，pH自然。

一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，瓊脂2，0.01，蛋白胨2，酵母浸出汁5，pH為5。

二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：

A．麩皮60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，0.01，蛋白胨3。

B．玉米粉60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，0.01，蛋白胨3。

C．黃豆粉60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，0.01，蛋白胨3。

D．豆粕60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，0.01，蛋白胨3。

E．黃豆餅粉60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.50.01，蛋白胨3。

F．土豆60，葡萄糖20，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，0.01，蛋白胨3。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

1）斜面菌種活化：將保存的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接到無(wú)菌斜面培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10 d～12 d，得斜面母種。

2）一級(jí)搖瓶菌種制備（種子液）：按常規(guī)方法制備液體培養(yǎng)基后，分裝于250 mL三角瓶中，裝液量100mL，初始pH為5，棉塞封口，121℃高壓滅菌30min，待冷卻后，按無(wú)菌操作方法，每瓶接入約0.2 cm2大小的經(jīng)活化的斜面菌種3塊，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2 d后，放入恒溫?fù)u床中，25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

3）二級(jí)搖瓶菌種制備（發(fā)酵液）：培養(yǎng)基制備方法同一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的一級(jí)搖瓶種以10%的接種量接種于二級(jí)搖瓶中，25℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4 d后取出，即可用于杏鮑菇栽培。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)基篩選

將一級(jí)搖瓶種以10%接種量分別接種于6個(gè)二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中，置于25℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4 d，然后測(cè)定各配方的菌球密度、菌絲干重、菌球直徑和萌發(fā)時(shí)間，每個(gè)配方重復(fù)3次。

1.2.3 最適培養(yǎng)條件試驗(yàn)

1）接種量的影響：將一級(jí)種以每瓶6%、8%、10%、12%、15%的接種量，接種于搖瓶培養(yǎng)基中。

2）接種菌齡的影響：分別將培養(yǎng)4.0、5.0、5.5、6.0、7.0 d的一級(jí)種，接種于搖瓶培養(yǎng)基中。

3）裝液量的影響：在250mL三角瓶中分別裝入50、80、100、120、150mL的培養(yǎng)基。

4）搖瓶轉(zhuǎn)速的影響：選擇搖床轉(zhuǎn)速分別為100、150、180、200 r/min。

5）初始pH的影響：將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)試為4.5、5.0、6.0、7.0、8.0，滅菌后接種培養(yǎng)。

以上試驗(yàn)均在25℃下?lián)u床培養(yǎng)4 d后取出，測(cè)量菌絲干重，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 測(cè)量?jī)?nèi)容及方法

1）菌絲干重的測(cè)定：把培養(yǎng)好的液體菌種用80目的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，收集菌球，用清水進(jìn)行反復(fù)沖洗，而后置于恒溫烘干箱中80℃烘干至恒重，用電子天平稱(chēng)量，重復(fù)3次，取平均值。

2）菌球密度的測(cè)定：培養(yǎng)結(jié)束后，取1m L發(fā)酵液攤勻于培養(yǎng)皿中，在暗背景下，用放大鏡直觀菌球數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，每瓶菌種重復(fù)記數(shù)3次，取平均值。

3）菌絲球回接平板萌發(fā)時(shí)間的測(cè)定：從培養(yǎng)液中取一個(gè)菌球置于PDA培養(yǎng)基平板中央，放置培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，每1小時(shí)觀察一次，當(dāng)有一組菌球萌發(fā)后，改為每0.5小時(shí)觀測(cè)一次，并記錄萌發(fā)時(shí)間，每組重復(fù)3次，取平均值[5]。

4）菌球直徑的測(cè)定：培養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取15個(gè)菌球在培養(yǎng)皿中排成一長(zhǎng)列，皿下襯坐標(biāo)紙，測(cè)量總長(zhǎng)度，重復(fù)3次，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇液體菌種搖瓶培養(yǎng)基的篩選

表1為杏鮑菇液體菌種在不同培養(yǎng)基下的菌絲生長(zhǎng)情況。

由表1可以看出。杏鮑菇液體菌種在不同培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況有所差異。配方E菌絲產(chǎn)量高、菌絲干重最大為5.4 g/L，菌球大小均勻，密度最大，為1.04×105個(gè)/L；配方D菌絲產(chǎn)量低、菌絲干重最小，菌球密度小且沉淀多；配方B中的菌絲干重和密度雖然僅次于配方E，但是其菌球回接平板后的萌發(fā)時(shí)間比較長(zhǎng)。對(duì)于杏鮑菇液體菌種來(lái)講，菌絲干重越大，菌球密度越大，則菌種的品質(zhì)越好，流動(dòng)性越強(qiáng)，接種后越容易分散，發(fā)菌點(diǎn)也就越多；菌球回接平板后萌發(fā)時(shí)間越短，說(shuō)明菌種的活性越強(qiáng)，接種后菌絲萌發(fā)和生長(zhǎng)速度越快，越有利于生產(chǎn)。綜合考慮，配方E液體菌種菌絲量大、密度高、回接平板萌發(fā)時(shí)間短，且菌球直徑適當(dāng)，確定其為適宜搖瓶培養(yǎng)基配方。

2.2 杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 接種量

設(shè)置不同接種量水平，裝液量100mL/250mL，pH5，25℃，180 r/min搖床培養(yǎng)4 d，測(cè)量菌絲干重。從圖中可看出，隨著接種量增加，菌絲干重逐漸增加，當(dāng)接種量達(dá)12%時(shí)，菌絲干重最大，繼續(xù)增加接種量，菌絲產(chǎn)量開(kāi)始下降。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果分析，接種量過(guò)少，菌絲體含量少，會(huì)引起發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)緩慢，延滯期延長(zhǎng)，菌絲終產(chǎn)量較低；接種量過(guò)多，帶入種子液中副產(chǎn)物過(guò)多，不利于菌絲培養(yǎng)，增加污染率，影響產(chǎn)量。因此，確定12%為適宜接種量。不同接種量對(duì)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

2.2.2 接種齡

接種量12%，裝液量100mL/250mL，pH 5，25℃，180 r/min培養(yǎng)不同天數(shù)，測(cè)量菌絲干重。圖2為不同菌齡的菌絲生長(zhǎng)情況。

可以看出，種子液培養(yǎng)到第4天時(shí)，杏鮑菇的菌絲體產(chǎn)量最高，之后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，菌絲生物量開(kāi)始下降。因?yàn)榻臃N菌齡直接影響菌絲生長(zhǎng)活力，從而影響菌絲生長(zhǎng)速度和生物量，而菌絲在培養(yǎng)后期由于營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)，代謝產(chǎn)物累積，菌種發(fā)生自溶，所以導(dǎo)致菌絲產(chǎn)量下降。種子液在培養(yǎng)到第4天時(shí)杏鮑菇菌絲體處于旺盛的指數(shù)生長(zhǎng)期，菌絲活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)接后所得的菌絲干重較大。因此，確定接種最佳菌齡為4 d。

2.2.3 裝液量

設(shè)置不同裝液量水平，接種量12%，pH5，25℃，180 r/min搖床培養(yǎng)4 d，測(cè)量菌絲干重。不同裝液量對(duì)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在250mL三角瓶中裝液量為100mL時(shí)，杏鮑菇的菌絲干重最大，菌絲產(chǎn)量最多；裝液量150mL時(shí)，菌絲產(chǎn)量下降明顯；菌絲產(chǎn)量最少的是裝液量為50m L。因?yàn)檠b液量過(guò)少，搖瓶?jī)?nèi)菌絲生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)供給量不足，同時(shí)震蕩時(shí)剪切力過(guò)大易對(duì)菌絲造成較大的損傷，影響菌絲生長(zhǎng)導(dǎo)致產(chǎn)量減少。裝液量過(guò)多，液面接觸的空氣面積小，通氣量少，單位體積溶氧量變小，菌絲缺氧而生長(zhǎng)緩慢。綜合分析，選擇裝液量100mL/250mL為最佳。

2.2.4 搖瓶轉(zhuǎn)速

接種量12%，裝液量100mL/250mL，pH 5，25℃，用不同轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)4 d，測(cè)量菌絲干重。不同搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

結(jié)果如圖4所示，隨著轉(zhuǎn)速增加，菌絲生物量逐漸提高，當(dāng)達(dá)到150 r/min時(shí)，菌絲產(chǎn)量最大，之后呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著轉(zhuǎn)速提高，搖瓶溶氧量不斷增加，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，而當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)剪切力過(guò)大，對(duì)菌絲的機(jī)械刺激加大，菌絲球形成受到了抑制。因此，確定最適搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.2.5 初始pH

接種量12%，裝液量100mL/250mL，設(shè)置不同pH，25℃，150 r/min搖床培養(yǎng)4 d，測(cè)量菌絲干重。不同pH的菌絲生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖5。

可以看出，杏鮑菇菌絲體在pH4.5～8.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，但不同pH對(duì)菌絲生物量有較大的影響。由于培養(yǎng)基高溫滅菌后，發(fā)酵液的pH會(huì)有所下降，菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中由于自身代謝作用會(huì)分泌一些有機(jī)酸，這些有機(jī)酸的積累會(huì)使發(fā)酵液的pH進(jìn)一步降低，因此杏鮑菇菌絲體適宜在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，pH 6.0時(shí)，菌絲干重達(dá)到最大，故杏鮑菇液體菌種發(fā)酵最適pH為6.0。

2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

初始條件與優(yōu)化后條件對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2。

將杏鮑菇的種子液分別置于初始條件和優(yōu)化后條件下進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)化后條件為：黃豆餅粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、VB10.01 g/L、蛋白胨3 g/L，調(diào)整接種量為12%、接種齡為培養(yǎng)4天的菌種、裝液量為100m L/250m L、搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min、pH為6.0。觀察各項(xiàng)指標(biāo)，得出結(jié)果如下，優(yōu)化后條件培養(yǎng)杏鮑菇液體菌種得到的各指標(biāo)與初始條件相比菌絲干重提高了128.3%、菌球密度提高了107.7%、菌球直徑縮短了26.1%、菌球回接平板萌發(fā)時(shí)間縮短了20.0%。

3 小結(jié)與討論

在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件下，采用搖瓶液體培養(yǎng)法，對(duì)杏鮑菇液體發(fā)酵過(guò)程中菌絲干重、密度等各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行分析，得到適宜杏鮑菇液體菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、0.01 g/L、蛋白胨3 g/L；最佳培養(yǎng)條件為：接種量12%、接種齡為培養(yǎng)4 d的菌種、裝液量100mL/250mL、搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min、pH為6.0。優(yōu)化后條件培養(yǎng)杏鮑菇液體菌種與初始條件相比菌絲干重提高了128.3%、菌球密度提高了107.7%、菌球直徑縮短了26.1%、菌球回接平板萌發(fā)時(shí)間縮短了20.0%。

在液體發(fā)酵過(guò)程中，杏鮑菇的菌絲形態(tài)不斷發(fā)生變化，從帶分枝的絲狀體，直至由菌絲形成高密度的菌絲球。液體發(fā)酵要求在短時(shí)間內(nèi)菌絲獲得大量的營(yíng)養(yǎng)成分，形成體積小、數(shù)量多的菌絲球，這就需要適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來(lái)提供菌絲生長(zhǎng)，從而提高產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，確定杏鮑菇液體菌種生長(zhǎng)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)是非常重要的。

杏鮑菇液體菌種具有生產(chǎn)周期短、發(fā)菌速度快、菌齡一致、污染率低、菌種質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，其生產(chǎn)具有技術(shù)可行性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，適宜工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化周年生產(chǎn)。

[1]孟麗君,王芳,張玉萍,等.杏鮑菇液體菌種的制備條件及應(yīng)用研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,29(2):153-156

[2]馬瑞霞,劉慧.杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的篩選及培養(yǎng)條件的探討[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(7):452-456

[3]黎勇,薛林浩,王丹,等.日引1號(hào)杏鮑菇液體制種條件研究[J].食用菌,2012(3):22-23,48

[4]劉冠卉,屠潔,張久成,等.杏鮑菇液體菌種的制備研究[J].北方園藝,2009(11):230-232

[5] 袁建平,張國(guó)鳳,馬立芝.杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的篩選[J],廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào),2006,22(4):82-83

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Study on Preparation Condition of Liquid Spawn of Pleurotus eryngii

YANG Li-wei1，WANGYu2，CHENYing1，BAN Li-tong2，*，LIU Jing3
（1.Tianjin Research Institution of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Hong Bin He Sheng Agricultural Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300400，China）

The screening and optimizing of medium and culture condition in shake flask of Pleurotus eryngiiliquid spawn were studied. The purpose was to shorten the breeding and production period and to improve theyield and quality. The experiment indicated that the suitable medium formulas were soybean bread flour 60 g/L，glucose 20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01g/L，peptone 3 g/L.The suitable culture conditions were inoculum quantity 12%，cellage 4 days，liquid quantity 100m L/250m L，rotate speed 150 r/min，pH 6.0.

pleurotus eryngii；liquid spawn；preparation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.029

2013-11-29

天津市北辰區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（BCNYKJ2013-4）

楊麗維（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究工作。

*通信作者：班立桐（1972—），男，教授，從事食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)教學(xué)與研究工作。