大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究

隋欣，暴悅梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究

隋欣，暴悅梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通過測(cè)試樹脂對(duì)土茯苓黃酮的吸附率、吸附速率、解吸率和產(chǎn)物得率及其黃酮含量，比較了5種不同類型吸附樹脂對(duì)土茯苓中黃酮的吸附特性。結(jié)論5種樹脂中D101樹脂對(duì)土茯苓總黃酮的吸附效果最好，吸附量可達(dá)18.32mg/g，X-5次之，吸附量達(dá)18.09mg/g。動(dòng)態(tài)柱吸附后，使用50%乙醇作為洗脫劑可以將被樹脂吸附的黃酮全部洗下，用量為3.5倍柱體積。通過本工藝，2 kg土茯苓獲得總黃酮6.27 g，得率為0.31%。經(jīng)HPLC分析，總黃酮中落新婦苷含量為90.54%。

大孔樹脂；黃酮；土茯苓；落新婦苷

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，具有除濕，解毒，通利關(guān)節(jié)之功效[1]。主產(chǎn)于廣東、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等省[2]，化學(xué)成分研究表明，土茯苓中含有落新婦苷、白黎蘆醇、異黃杞苷、異落新婦苷、柚皮素等多種成分[3-4]，其中二氫黃酮醇苷類（如落新婦苷）為土茯苓的有效成分[5]。近年來(lái)臨床和藥理試驗(yàn)表明，落新婦苷具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用[6-7]。分離純化高純度的土茯苓黃酮對(duì)新藥的開發(fā)有著重要意義。

實(shí)驗(yàn)以土茯苓為原料，采用大孔樹脂分離純化其所含的黃酮成分。通過分析D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，計(jì)算樹脂的單位飽和吸附容量Q，以此篩選較優(yōu)樹脂做后續(xù)動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)，以確定此樹脂分離純化土茯苓黃酮的最佳工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

土茯苓中藥飲片購(gòu)買于廣西康美藥業(yè)股份有限公司。D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5大孔吸附樹脂購(gòu)于鄭州勤實(shí)科技有限公司。

1.2 主要試劑

乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）：以上均購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑有限公司；落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品：上海同田生物科技有限公司；乙腈（高效液相色譜純）：TEDIACompany，USA。

1.3 儀器

Q-350B3型粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公司；BSA124S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HF-20B型超聲提取器：北京弘祥隆生物技術(shù)有限公司；754PC型紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SSC300NA型三足式離心機(jī)：張家港市永泰離心機(jī)制造有限公司；RE 52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-ШD型真空泵：上海亞榮生化有限公司；TGL-16B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Waters高效液相色譜儀：美國(guó)WATERS公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 土茯苓的預(yù)處理

揀選優(yōu)質(zhì)康美土茯苓飲片置于粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過40目篩網(wǎng)得土茯苓粉末，裝入密封袋后低溫密封保存。

2.2 樹脂的預(yù)處理

用無(wú)水乙醇浸泡并充分溶脹樹脂一夜，用大量蒸餾水洗去乙醇至無(wú)醇味，然后分別用體積分?jǐn)?shù)為2%的HCl溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH溶液浸洗樹脂各一夜，再用蒸餾水洗至中性，抽濾后密封存放備用。

2.3 標(biāo)品溶液的配制

將落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品置于干燥箱中105℃干燥至恒重，精密稱取干燥后的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于50mL容量瓶中，以極少量的甲醇將落新婦苷溶解后，添加蒸餾水至刻度線，配成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻備用。

2.4 土茯苓樣品高效液相色譜分析

稱取土茯苓粉末0.5 g，加入甲醇25mL，室溫下超聲提取30min，取上層提取液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，經(jīng)0.45μm有機(jī)系膜過濾備用。梯度洗脫方法見表1。

2.5 土茯苓總黃酮的提取

稱取干土茯苓粉末2 kg于超聲提取器中，加入20 L體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液；設(shè)定好各項(xiàng)工作參數(shù)：超聲提取總時(shí)間為45min，超聲間隙為3 s，攪拌速度為800 r/min，超聲溫度為30℃。超聲完成后取出混合液，經(jīng)三足式離心機(jī)將土茯苓粉渣和提取溶劑相分離，棄去粉渣，所得提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮（濃縮溫度為55℃），直至乙醇全部蒸出，對(duì)余下液體離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），棄去沉淀，收集上清液。

2.6 大孔樹脂吸附土茯苓中的黃酮

2.6.1 樹脂的靜態(tài)吸附和篩選

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂D101，NKA-9，AB-8，H103和X-5各1 g裝入100mL的具塞磨口三角瓶中，加入50m L稀釋后總黃酮濃度為430μg/m L的土茯苓提取液，置于20℃搖床內(nèi)搖蕩，每隔15分鐘用移液槍吸取少量樣液，樣液經(jīng)稀釋后于291 nm下檢測(cè)吸光度，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附曲線。待樹脂充分吸附后，測(cè)定樣液吸附平衡時(shí)總黃酮的最終濃度，計(jì)算樹脂的單位飽和吸附容量Q。通過比較不同樹脂的飽和吸附量，篩選出較優(yōu)的大孔樹脂。

2.6.2 樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解吸

由樹脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，對(duì)篩選出的一種理想樹脂，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)。把預(yù)處理好的樹脂濕法裝入15mm×500mm玻璃色譜柱中（柱高31 cm，柱床體積約為55mL），將稀釋后的土茯苓總黃酮提取液（430μg/mL）以10mL/min速度上柱，直至吸附完全。樹脂柱分別用10 0mL純化水洗脫，可洗去水溶性雜質(zhì)糖和蛋白質(zhì)等，再依次用20%，50%，80%乙醇各250mL以3mL/min流速洗脫，收集洗脫液紫外檢測(cè)土茯苓中的落新婦苷。分別對(duì)洗脫液進(jìn)行HPLC分析。通過以上小試試驗(yàn)確定最佳洗脫溶劑和洗脫量。最后通過中試試驗(yàn)來(lái)收集土茯苓落新婦苷洗脫液。

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取土茯苓提取液和落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后置于石英比色皿中，以各自試劑空白為參比，在波長(zhǎng)200 nm～400 nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)落新婦苷在291 nm處有最大吸收峰，因此選擇291 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。圖1和圖2分別為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液紫外掃描圖譜。對(duì)比圖1和圖2可知，土茯苓提取液和落新婦苷紫外吸收?qǐng)D譜基本一致，這是因?yàn)橥淋蜍咛崛∫褐兴煞趾吐湫聥D苷均為黃酮類化合物，具有明顯的紫外吸收光譜特征，它們?cè)?91 nm下具有最大吸收波長(zhǎng)，濃度與吸光強(qiáng)度變化遵循朗伯比爾定律，土茯苓中總黃酮濃度以落新婦苷濃度計(jì)量。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取落新婦苷標(biāo)品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0、2.4mL分別置于刻度為10mL的試管中，依次加蒸餾水至10mL，搖勻，以蒸餾水做空白。在291 nm處測(cè)量以上各溶液的吸光度，以落新婦苷的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=41.179X＋0.028 3，R2=0.999 7，濃度在0mg/mL～0.024mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系（見圖3）。

3.3 樹脂的靜態(tài)吸附結(jié)果

3.3.1 樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

在20℃搖床中，考察了D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5種樹脂對(duì)土茯苓總黃酮吸附率和吸附時(shí)間的關(guān)系，繪出了靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，D101對(duì)土茯苓總黃酮的吸附速度最快，X-5與D101吸附速率相當(dāng)；D101、NKA-9、AB–8和X-5在2.5 h內(nèi)基本達(dá)到平衡，而H103在4 h內(nèi)還未達(dá)到平衡。

3.3.2 樹脂的篩選

在相同的條件下，吸附樹脂的種類不同，吸附能力也有所不同。不同種類樹脂吸附能力的差異是由于樹脂表面積的大小及其極性存在差異。按公式（1）計(jì)算樹脂的單位飽和吸附容量Q（見表3）。

式中：Q為吸附率，（mg/g）；C0為初始濃度，（mg/mL）；Cr為剩余濃度，（mg/m L）；V為溶液體積，m L；W為樹脂質(zhì)量，g。

試驗(yàn)表明，大孔樹脂D101對(duì)總黃酮的吸附容量最大，為每克干樹脂18.32mg/g，選擇D101大孔樹脂做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大孔樹脂D101是非極性樹脂，其孔表疏水性較強(qiáng)，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)。

3.4 樹脂的動(dòng)態(tài)吸附及解吸結(jié)果

根據(jù)樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)，我們選取D101做后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)D101樹脂動(dòng)態(tài)吸附落新婦苷和解吸進(jìn)行研究。結(jié)果表明當(dāng)用20%的乙醇洗脫樹脂柱時(shí)，其他黃酮成分及部分落新婦苷能被洗脫下來(lái)；當(dāng)用50%的乙醇洗脫樹脂柱時(shí)，大量落新婦苷被洗脫下來(lái)；當(dāng)用80%的乙醇洗脫時(shí)，液相圖中未見落新婦苷出峰，說(shuō)明樹脂柱中的黃酮已被完全洗脫。

通過以上試驗(yàn)，確定土茯苓黃酮的純化步驟為：先用2倍柱體積純凈水洗去水溶性雜質(zhì)糖和蛋白質(zhì)等，再用50%乙醇洗脫樹脂柱上的總黃酮。圖5為50%乙醇洗脫曲線。

由圖5可知，在乙醇用量為柱體積的0.5倍～1.2倍時(shí)，隨著乙醇用量的加大，流出液中黃酮的含量逐漸增加；當(dāng)乙醇用量繼續(xù)加大時(shí)，流出液中黃酮的濃度又逐漸的降低；當(dāng)乙醇用量為柱體積的3.5倍左右時(shí)，已基本將黃酮洗凈。因此最終確定，50%乙醇用量為3.5倍柱體積。

3.5 純化產(chǎn)物的HPLC分析

對(duì)步驟2.6收集到的土茯苓黃酮粗品進(jìn)行HPLC（見圖6）分析可知，黃酮中主要成分落新婦苷的純度可達(dá)90.54%。2 kg土茯苓經(jīng)D101大孔樹脂分離純化后可得6.27 g土茯苓黃酮，得率為0.31%。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)土茯苓中黃酮成分的分離純化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)D101、NKA-9、AB-8、H103、和X-5這5種樹脂，D101對(duì)土茯苓總黃酮的吸附效果最好，吸附量可達(dá)18.32mg/g，而X-5其次，為18.09mg/g。樹脂柱洗脫時(shí)，先用2倍柱體積純凈水洗去水溶性雜質(zhì)糖和蛋白質(zhì)等，再用50%乙醇洗脫樹脂柱上的黃酮成分，洗脫用量確定為柱體積的3.5倍即可。洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得到土茯苓黃酮中落新婦苷的含量為90.54%。經(jīng)上述工藝步驟，2 kg土茯苓共得6.27 g土茯苓黃酮，得率為0.31%。該工藝步驟簡(jiǎn)單，得率較高，是一種值得推廣的土茯苓黃酮提取工藝。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:14-15

[2] 李玉蓮,李玉琪,曾平,等.土茯苓植物資源調(diào)查[J].中草藥,2002,33 (9):850-852

[3]陳廣耀,沈連生,江佩芬.土茯苓中二氫黃酮醇甙的研究[J].中國(guó)中藥,1996,21(6):355

[4]陳廣耀,沈連生,江佩芬.土茯苓化學(xué)成分的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1996,19(1):44

[5]陳紅梅,秀蘭,吳占全.土茯苓的化學(xué)與藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族醫(yī)藥,2008(11):71-73

[6] 張白嘉,劉亞歐,劉榴,等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床,2004,20(1):11-12

[7] 吳麗明,張敏.土茯苓中落新婦苷的利尿和鎮(zhèn)痛作用[J].中藥材, 1995,18(12):627-630

Study on the Separation of Glabrous Greenbrier Rhizome Flavonoids by Macroporous Resin

SUIXin，BAOYue-mei
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Through the test of resin adsorption on Glabrous Greenbrier Rhizome flavonoids， adsorption rate，ratio of desorption， the yield rate and the content of flavonoid， Compared the adsorption characteristic of 5different kinds of adsorption resins for flavonoids from Glabrous Greenbrier Rhizome. The best adsorption effectof five kinds of resin and D101 resin for total flavonoids in Glabrous Greenbrier Rhizome， adsorption capacitywas 18.32 mg/g， and the X-5 followed， 18.09 mg/g. After the dynamic column adsorption， flavonoids using50 % ethanol as eluant can be adsorbed by the resin eluted all yieid， the amount of 3.5 times the columnvolume. Through this process， 2 kg Glabzons Greenbiere Rhizowe 6.27 g flavonoids， yield 0.31 %. By theanalysis of HPLC， total flavonoids astilbin content was 90.54 %.

macro-reticular resin；flavonoid；Glabrous Greenbrier Rhizome；Astilbin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.012

2015-01-08

隋欣（1982—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品微生物檢測(cè)。